Spectrophotométrie d'absorption moléculaire dans l'UV-VISIBLE PDF

Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’UV – VISIBLE  I. Généralités sur les méthodes optiques De nombreuses méthodes analytiques sont fondées sur les interactions entre la matière (solution médicamenteuse À doser ) et une radiation électromagnétique. Il peut s’agir de photo...

Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’UV – VISIBLE  I. Généralités sur les méthodes optiques De nombreuses méthodes analytiques sont fondées sur les interactions entre la matière (solution médicamenteuse À doser ) et une radiation électromagnétique. Il peut s’agir de photométrie dans le visible , l’ultraviolet ou l’infrarouge voire dans le domaine des rayons x. Les propriétés optiques des solutions dépendent des structures atomiques et moléculaires , les radiations électromagnétiques sont émises et absorbées sous forme de corpuscules appelé quanta de lumière ou bien photon.  II. Rappel sur les ondes électromagnétiques La lumière présente deux aspects :caractère ondulatoire et corpusculaire. Aspect ondulatoire : Explique les phénomènes d’interférences et de diffraction de la lumière. La radiation lumineuse est constituée de deux vecteurs champs ( électrique et magnétique ) qui sont perpendiculaires et varient de façon sinusoïdale et perpendiculaires à une direction de propagation. ( théorie de J.C.Maxwell ). Représentation d’une onde électromagnétique  Aspect corpusculaire : L’ existence de cet aspect ondulatoire ne peut pas expliquer toutes les propriétés optiques ,donc il est nécessaire de considérer en outre la radiation comme une série discontinue de paquets ou quantums d’ énergie c’est le caractère quantique de la lumière. L’effet photoélectrique On définit une onde électromagnétique qu’est une fonction sinusoïdale y= a cos (ωt- Ф) a : l’amplitude de la vibration ω : la pulsation de la vibration ω= 2 π c / λ Ф : la phase par =C.T  : Longueur d’onde en : m, µm, nm. C: Célérité de la lumière dans le vide soit 3108 m/s T: Période; temps au bout duquel le phénomène se reproduit identique à lui même = 1/T=C/  : fréquence ( s-1 ou Hertz « Hz ») E = h = h C/ E : Energie du photon en Joules (J) h : constante de Planck = 6.62. 10-34 J.s = 1/ : le nombre d’onde ( m -1 ), (cm-1)  Type d’onde longueur d’onde Rayon x 10-3 - 10 nm Ultra violet lointain 10 - 200 nm Ultra violet proche 200 - 400 nm Visible 400 - 780 nm (750-800) Infra rouge proche 780 – 2500 nm Infra rouge moyen 2.5 μm – 50 μm Infra rouge lointain 50 – 1000 μm Micro- ondes 0.1 - 100 cm Ondes radio 1 - 1000 m  III. Energie d’une molécule La molécule (indépendante ) peut se mouvoir dans l’espace sans se heurter, il s’agit d’une énergie cinétique due au divers mouvements : 1 - La translation: mouvement libre de La particule selon les trois directions de l’espace , cette énergie n’est pas quantifiée. 2 - La rotation de la molécule autour de son centre de gravité , cette énergie est quantifiée 3 - La vibration des atomes qui constituent cette molécule, les uns par rapport aux autres (détaillée en IR) 4 – L’énergie électronique: fait intervenir La structure réelle de la molécule , faite d’atomes ( noyau + électrons ) elle correspond à la répartition des électrons et à ses variations.  Ee > Ev > Er E2 r2 v4 r1 r2 v3 r1 v2 r2 r1 v1 E1 Diagramme énergétique L’énergie électronique n’est pas continue elle ne peut prendre que certaines valeurs : E0 , E1 , E2 ……. On dit alors que l’énergie est discontinue ou quantifiée. ET = Ee +Ev + Er  IV. La spectroscopie dans l’UV et le Visible Appelée également absorptiométrie , spectrophotométrie ou colorimétrie (visible) ; c’est une des méthodes d’analyse de la spectroscopie moléculaire permet l’analyse structurale de certaines molécules (qualitative) et de nombreuses déterminations quantitatives. Inscrite à la pharmacopée européenne (5 e édition). Les molécules absorbent des photons dans le domaine de l’UV –Visible( λ entre 190 – 800 nm). L’absorption d’un photon dans ce domaine entraine un changement d’énergie qui s’accompagne de variations d’énergies vibrationnelle et rotationnelle. Chaque transition correspond à une bande d’absorption (multiples raies de transition rotationnelle) : aspect de spectre continu. La spectroscopie dans l’UV et le visible fait intervenir l’excitation électronique et modifie l’énergie vibrationnelle et rotationnelle Dans la spectroscopie UV –visible , il y a modification de la répartition électronique de la molécule  IV.1. Phénomène d’absorption Si la radiation incidente possède une énergie E= h qui correspond à la zone de transition électronique, cette radiation sera absorbée et la molécule passe à un état énergétique supérieur, la molécule dans un état excité qui ne dure pas longtemps et par conséquence elle revient à son état fondamental en restituant l’énergie absorbée sous forme de chaleur. E 2 h = E1 – E0 E1 E0 : état fondamental h Si h ≠ E1 – E0, il n y a pas absorption et la molécule ne passera pas à l’état énergétique E1.  V. Aspect quantitatif V.1. Intensité lumineuse - L’intensité de la lumière est le nombre de photons de même énergie qui arrive par unités de temps dans une direction bien déterminée, on l’exprime par une intensité incidente I0 - Il s’agit d’une lumière Monochromatique. - Une radiation possédant une énergie: E=hν=h.c/λ est émise par une source de lumière et traverse un milieu donné. Au cours du trajet cette lumière peut subir une absorption partielle par les molécules absorbantes  Loi de l’absorption : Mécanique quantique E2 h = E1 – E0 E1 h E0 : état fondamental solution I0 constant I Avec I < I0 L Trajet optique (longueur de la solution) Cette intensité I0 peut être modifiée si cette radiation traverse une solution (ou molécule) qui absorbe cette radiation. V.2 La loi de BEER-LAMBERT La loi de Beer-Lambert, aussi connue comme la loi de Beer-Lambert-Bouguer et chez les francophones parfois même simplement comme la loi de Bouguer, est une relation empirique reliant l'absorption de la lumière aux propriétés des milieux dans lesquels elle passe. La loi de Beer-Lambert établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution, l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution.  Lorsqu’une lumière d’intensité I0 passe à travers une solution, une partie de celle ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de la lumière transmise est donc inférieure à I0. On définit l’absorbance de la solution comme : I0 DO = log I On parle aussi de transmittance définit par la relation : I T= DO = − log T I0 L’absorbance est une valeur positive, sans unité. Elle est d’autant plus grande que l’intensité transmise est faible. La relation de Beer-Lambert décrit que, à une longueur d’onde λ donnée, l’absorbance d’une solution est proportionnelle à la concentration des espèces de la solution, et à la longueur du trajet optique (distance sur laquelle la lumière traverse la solution). Pour une solution limpide contenant une seule espèce absorbante : D.O = log I0/ I = log 1 / T = K.C. l DO est l’absorbance ou la densité optique de la solution pour une longueur d'onde λ ; C est la concentration de l’espèce absorbante ; L (en cm) est la longueur du trajet optique ;  D.O = log I0/ I = log 1 / T = K.C. l K : constante qui dépend de  , de la nature de la molécule et du mode d’expression de C. Si C en moles/l : K  = ε : coefficient d’absorption (d’extinction) molaire. (moles/l)-1..cm-1 Si C en g/100ml : K  = E1%1cm : coefficient d’extinction spécifique. (le « E » 1% ) (g/100ml)-1..cm-1 L’intensité incidente I0 doit être constante et très augmentée au cours de l’absorption A I0 B I C.. La loi de Beer Lambert est linéaire pour 0 < DO ≤ 1. La loi de Beer Lambert est additive pour l’absorbance; mais non pour la transmittance. I0 D.O = log =  a.Ca. l +  b.Cb. l +  c.Cc. l +.... I V.3. Conditions de validité de la loi de Beer Lambert : 1/ Lumière monochromatique 2/ Faibles concentrations : aux fortes concentrations les molécules interagissent entes elles ce qui modifie la distribution de leur charge et leur capacité à absorber la lumière, 3/ La solution doit être limpide ( turbidimétrie néphélémétrie pour les suspensions ) , ne doit être ni fluorescente, ni hétérogène (bulles, précipité…) 4/ La solution n’est pas le siège d’une réaction photochimique. VI. Appareillage  source lumineuse Elle est constituée par : ▪ Une lampe à décharge au deutérium ou à hydrogène utilisée dans le domaine de 160 à 375 nm , ▪ Une lampe à filament de tungstène pour la région allant de 350 à 800 nm. Voire 2500 nm (proche IR). ▪ les lampes tungstène/ halogène pour un domaine plus étendu 240-2500nm utilisées pour leur intensité forte et leur logue durée de vie Sélecteurs de longueurs d’onde Le rôle du monochromateur est d'isoler le rayonnement sur lequel on fait la mesure. * Les filtres : Capables d’absorber l’ensemble des rayonnements fournis par la lampe sauf la bande spectrale sélectionnée on distingue *les filtres d’absorptions :plaque de verre coloré utilisé dans le visible. * Les filtres interférentiels : dans l’UV et le visible :une couche diélectrique transparente entourée par deux films métalliques le tout enserré entre deux plaques en verre transparent ( réflexions successives).  λ1 λ2 La largeur du pic a mi hauteur= la bande passante = λ 2 – λ1 NB/ bande passante des filtres d’absorption est large 30nm au minimum , pour le filtre interférentiel , elle est plus étroite 10nm  Monochromateur L'élément de base est un prisme ou un réseau. * Le réseau Il est composé principalement d'un système dispersif, d'une fente d'entrée et d'une fente de sortie. * Prisme Dispersion de la lumière blanche -La bande passante d’un monochromateur varie de 1 à 20nm Selon les exigences de la pharmacopée européenne , les analyses de contrôles des matières premières et de préparations pharmaceutiques la bande passante d’un monochromateur à réseau doit être ≤ 2nm , Cuve Elle contient soit l'échantillon soit la référence. La longueur de la cuve est définie (1, 2, 4 ou 5cm de trajet optique). Elle doit être transparente aux radiations d'étude. Par exemple en UV, les cuves sont en quartz, elles ne peuvent être ni en plastique ( visible pour les milieux aqueux ) ni en Verre (visible pour le milieu aqueux et organique ). Détecteur Cellule photoélectrique qui transforme l’énergie lumineuse en courant électrique qui est amplifié  Tube photomultiplicateur Un rayonnement frappe la photocathode pour extraire des électrons qui sont attirés par l’anode.  VII. Applications: Détermination de la concentration d’une solution X en utilisant une courbe d’étalonnage SPECTRE D’ABSORPTION caféine