Cours de Biotechnologies PDF

COURS BIOTECHNOLOGIES I CHAPITRE I. BIOTECHNOLOGIE I.1. Définitions I.1.1 Biotechnologie : La biotechnologie représente une discipline multidisciplinaire qui combine les potentialités d'une entité vivante, ou d'une de ses parties, avec différentes techniques et procédés dans un de...

COURS BIOTECHNOLOGIES I CHAPITRE I. BIOTECHNOLOGIE I.1. Définitions I.1.1 Biotechnologie : La biotechnologie représente une discipline multidisciplinaire qui combine les potentialités d'une entité vivante, ou d'une de ses parties, avec différentes techniques et procédés dans un dessein économique. Actuellement, la biotechnologie est reconnue comme l'une des technologies les plus émergentes, en raison des avancées significatives de la biologie moléculaire au cours des dernières années. I.1.2. Origine étymologique du terme "Biotechnologie" : Le terme "biotechnologie" est formé de deux éléments : "Bio" dérive du grec "Bios", signifiant la vie. Ce terme a évolué pour donner naissance au mot "Biologie" au début du XIXe siècle. "Technologie" provient du grec "Technologia". Ce mot est apparu dans les textes français en 1656 pour désigner "l'étude des techniques, des outils, des machines et des matériaux". I. 1.3. Origines des biotechnologies Origine et développements des biotechnologies - Bref historique : On distingue trois étapes dans l'histoire des biotechnologies : Du Néolithique au début du 20e siècle : utilisation des bactéries, levures, moisissures dans divers domaines tels que l'alimentation, les boissons, et les textiles. Standardisation des procédés de fermentation. Notamment en 1650 avec le procédé d'Orléans pour la fabrication du vinaigre, en 1664 avec la création d'une bière alsacienne réputée, et en 1890 avec le développement des premiers vaccins par Louis Pasteur et Robert Koch. Des années 1920 aux années 1970 : essor de l'industrie des antibiotiques, des vitamines, etc. Découvertes marquantes telles que la pénicilline par Alexander Fleming en 1927 et la compréhension de l'ADN comme support génétique en 1953. Depuis le début des années 1970 : progrès en génétique, biologie cellulaire, immunologie avec une "maîtrise" du génome grâce au clonage moléculaire. Notamment, les débuts du "génie génétique" en 1972 avec Stanley Cohen et Georges Kohler, et l'annonce du décodage complet du génome humain en 2002. 2  L'identification moléculaire de la structure d'un gène, qu'il soit procaryote ou eucaryote, s'effectue en établissant la séquence nucléotidique de l'unité de transcription et en caractérisant les séquences régulatrices qui permettent son expression. I.4. Histoire et Évolution de la Biotechnologie I.4.1. Biotechnologie Ancienne (avant 1800) : L'histoire de la biotechnologie remonte à l'époque où les gens ont commencé à adopter un mode de vie sédentaire vers 9000 av. J.-C. Cette période a été marquée par la découverte souvent fortuite de procédés de fermentation alimentaire, contribuant à l'amélioration des saveurs et des textures. La délibérée contamination par des bactéries ou des champignons, tels que les moisissures, était une pratique courante. En 1866, Louis Pasteur publie des conclusions établissant le lien direct entre la levure et la fermentation des sucres. Plus tard, en 1915, la production de levure de boulangerie est initiée. I.4.2. Biotechnologie Classique : Cette période voit l'émergence de divers types de boissons (vin, cidre), ainsi que la production de produits tels que le vinaigre, la glycérine, l'acétone, le butanol, l'acide lactique, les antibiotiques, etc. Des transformations chimiques sont employées pour la production de produits thérapeutiques, où le substrat réagit avec une enzyme microbienne pour produire le produit final. I.4.3. Biotechnologie Moderne : En 1953, JD Watson et FHC Crick lèvent le voile sur les mystères entourant l'ADN en proposant le modèle structurel de l'ADN, connu sous le nom de "modèle double hélice de l'ADN". Cet événement marque le début de la biotechnologie moderne. I.5 Grands Enjeux Actuels des Biotechnologies et Bionanotechnologies Nanotechnologies: Un nanomètre est environ 500 000 fois plus fin que l'épaisseur d'un trait de stylo à bille, 30 000 fois plus fin que l'épaisseur d'un cheveu et 100 fois plus petit qu'une molécule d'ADN. Les nanotechnologies englobent des nano-objets, des particules, fibres ou tubes dont la taille varie entre 1 et 100 nm. Les nanomatériaux, composés ou constitués de nano-objets, présentent des propriétés améliorées liées à la dimension nanométrique. Ces nanotechnologies, débutées au début des années 1980, ont des applications majeures dans les domaines des technologies de l'information, de la santé, 3 des nouveaux matériaux et de l'énergie. Nanobiotechnologie : La nanobiotechnologie peut être définie de différentes manières. Certains la décrivent comme l'application de techniques nanotechnologiques pour le développement et l'amélioration de produits et processus biotechnologiques. D'autres réservent le terme "bionanotechnologies" pour décrire l'utilisation de composantes biologiques à l'échelle nanométrique. En pratique, ces termes sont souvent fusionnés sous la catégorie générale de "nanobiotechnologie". I.6. Définition des Biotechnologies Vertes, Blanches, Rouges, etc. Le thème central de cette section réside dans la notion que la biotechnologie est actuellement un domaine extrêmement vaste de la recherche scientifique, et le terme "biotechnologie" englobe divers processus et applications, dont beaucoup ne viennent pas immédiatement à l'esprit lorsqu'on évoque ce terme. a. Biotechnologie Rouge (Médicale) : La biotechnologie rouge regroupe toutes les utilisations de la biotechnologie liées à la médecine. Cela inclut la production de vaccins et d'antibiotiques, le développement de nouveaux médicaments, les techniques de diagnostic moléculaire, les thérapies de régénération, et l'application du génie génétique pour traiter les maladies par manipulation génétique. Des exemples pertinents englobent la thérapie cellulaire, la médecine régénérative, la thérapie génique, et les médicaments basés sur des molécules biologiques comme les anticorps thérapeutiques. b. Biotechnologie Blanche (Industrielle) : La biotechnologie blanche englobe toutes les utilisations de la biotechnologie liées aux processus industriels. Ce secteur, appelé biotechnologie blanche, accorde une attention particulière à la conception de processus et de produits à faible consommation de ressources, les rendant plus écoénergétiques et moins polluants que les méthodes traditionnelles. Cela englobe l'utilisation de microorganismes dans la production de produits chimiques, la conception et la fabrication de nouveaux matériaux pour un usage quotidien (plastiques, textiles...), et le développement de sources d'énergie durables comme les biocarburants. c. Biotechnologie Grise (Environnementale) : La biotechnologie grise englobe toutes les applications de la biotechnologie directement liées à l'environnement, incluant la préservation de la biodiversité et l'élimination des contaminants. 4 Pour la préservation de la biodiversité, elle utilise des techniques de biologie moléculaire pour l'analyse génétique des populations et des espèces dans les écosystèmes, ainsi que des techniques de clonage pour préserver les technologies de stockage des espèces et des génomes. En ce qui concerne l'élimination des polluants ou la bioremédiation, la biotechnologie grise utilise des microorganismes et des plantes pour isoler et éliminer diverses substances telles que les métaux lourds et les hydrocarbures, avec la possibilité de réutiliser ces substances ou leurs sous- produits. d. Biotechnologie Verte (Agricole) : La biotechnologie verte se concentre sur l'agriculture en tant que domaine de travail. Les approches biotechnologiques vertes incluent la création de nouvelles variétés végétales d'intérêt agricole, la production de biofertilisants et de biopesticides, en utilisant des cultures in vitro et des plantes de clonage. La création de variétés végétales modifiées, principalement par transgenèse, vise à développer des variétés résistantes aux ravageurs et aux maladies, ayant des propriétés nutritionnelles améliorées, et pouvant servir de bio-usines pour la production de substances d'intérêt médical, biomédical ou industriel. e. Biotechnologie Bleue (Marine) : La biotechnologie bleue exploite les ressources maritimes pour créer des produits et des applications d'intérêt industriel. En tirant profit de la biodiversité marine, elle offre des opportunités dans divers secteurs. La biotechnologie bleue utilise des matières premières marines, notamment des hydrocolloïdes et des gélifiants, largement utilisées dans l'alimentation, la santé, et d'autres domaines. Elle bénéficie également à la médecine et à la recherche grâce à l'utilisation de molécules provenant d'organismes marins, tandis que des biomatériaux et des agents régénératifs sont étudiés pour leur utilisation dans ces secteurs. D'autres domaines tels que l'agriculture et les cosmétiques explorent le potentiel de la biotechnologie bleue pour leur développement futur. 5  Principales applications de la biotechnologie utilisant le codedes couleurs Les différents biomatériaux et leur utilisation On distingue cinq grandes catégories de biomatériaux : 1) les matériaux d'origine naturelle; 2) les métaux et alliages métalliques; 3) les céramiques; 4) les polymères. Les métaux et les polymères constituent la majeure partie des biomatériaux utilisés aujourd’hui. 1. Les matériaux d'origine naturelle Le souci de biocompatibilité des matériaux a orienté les chercheurs vers des matériaux d'origine naturelle. Les applications existantes de ces matériaux sont très nombreuses : la greffe (transplantation): c'est le transfert sur un patient receveur d’un tissu ou d’un organe provenant du patient lui-même (autogreffe), ou d’un autre individu (le donneur) de même espèce (allogreffe), ou de deux espèces différentes proche génétiquement (hétérogreffe). Il est utilisé pour greffes vasculaires, cornée de l’œil, valves cardiaques, tendons et ligaments, etc. 6  Tendons et ligaments Possibilités de greffes Les polysaccharides : ✓ la cellulose est un glucide complexe (polysaccharide) constituant principal des parois des cellules végétales. Elle est traditionnellement utilisée pour les membranes de dialyse. ✓ la chitine est, après la cellulose, le polysaccharide le plus répandu dans la nature. Sa structure ressemble à celle de la cellulose. C'est un copolymère qui est présenté naturellement sous forme cristalline ou sous forme de complexes chitino-protéiques. Ces principales sources sont les crustacés marins (Crabes, Crevettes, langoustines et Krill) et les insectes (Fourmis, Blattes et Coléoptères). Elle confère la rigidité et la résistance aux organiques qui en contiennent. Elle est biodégradables, biorésorbables et susceptible d’application pour les fils de suture, la chirurgie reconstructive et la peau artificielle. ✓ les fucanes sont des polysaccharides sulfatés extraits des algues brunes marines. Ils sont capables de promouvoir et d’accélérer la migration et la prolifération des cellules ostéoblastiques, ainsi que d’amélioration des capacités ostéoinductrices. Ils sont des produits de substitution et régénération osseuses, utilisés comme greffes et dispositifs implantables. le corail naturel est utilisé comme des substitut osseux, grâce à sa possibilité de recolonisation par les cellules osseuses. Il est composé à 99% de carbonate de calcium en phase cristalline. Il conserve après traitement thermique une structure poreuse (varie selon les espèces de coraux considérés) qui lui confère des propriétés ostéoinductrices. Le collagène est une substance protéique. Il s’agit de l’un des constituants fondamentaux du 7  tissu conjonctif dans les vaisseaux sanguins, la peau, les articulations, les reins, les poumons et le cœur. Ainsi, le corps humain est composé d’environ 25% de collagène. Il est d'origine animale ou humaine. Il est susceptible d’application pour le remplacement tissulaire, cornée, cicatrisation…etc. II.1. Les métaux et les alliages métalliques Ils sont les premiers à avoir été utilisés pour fabriquer des implants. Ils sont très utilisés pour la conception de prothèses car ils possèdent de bonnes propriétés et de meilleure biocompatibilité. Les plus important sont : les aciers inoxydables (acier inox 316L, Co-Cr-Mo, Titane et Ti-6Al-4V) : utilisées en chirurgie orthopédique. Le titane : utilisé principalement en chirurgie orthopédique et en implantologie dentaire. On le trouve également dans les stimulateurs cardiaques et les pompes implantables. Principales caractéristiques des alliages inoxydables utilisés en médecine Alliage Module d’élasticité (GPa) Résistance en traction (MPa) Densité (g/cm3) Acier 316L 190 590-1350 8,8 Co-Cr-Mo 210-250 650-1900 7,8 Ti-6Al-4V 116 960-1100 4,4 Titane 110 760 4,5 Les alliages à mémoire de forme (AMF) : L’effet mémoire de forme repose sur l’existence d’une transformation de phase réversible entre un état structural haute température (austénite) et un état structural basse température (martensite). Elle se produit sur une plage de température assez restreinte (20 à 40°C) sans changement de volume. Donc, ils présentent des propriétés exceptionnelles dont : ▪ l’effet mémoire, c’est-à-dire la possibilité de retrouver une forme mémorisée par simple élévation de température à partir d’un état déformé à froid, ▪ l’effet super élastique autorisant des déformations purement élastiques 5 à 10 fois supérieures à tout autre alliage métallique. Les plus connus sont : les alliages à base Ni-Ti (Nitinol), les alliages à base Cu-Zn-Al et les alliages à base Cu-Al-Ni. 8  Propriétés des AMF à base NiTi, CuZnAl et CuAlNi Propriétés Ni-Ti Cu-Zn-Al Cu-Al-Ni Température de fusion (°C) 1250 1020 1050 Masse volumique (g/cm3) 6,45 7,9 7,15 Module d’Young (GPa) 95 70-100 8 0-100 Allongement à rupture de la phase martensitique (%) 30-50 15 8-10 Température de transformation (°C) -100/+110 -200/+110 -150/+200 Hystérésis (°C) 30 15 20 Température maximale (°C) 400 150 300 Nombre maximal de cycles thermiques 100 000 10 000 5 000 Résistance à la corrosion Excellente Acceptable Bonne Application de quelques métaux et alliages métalliques Matériau Domaine d'application Aciers inoxydables Pacemaker (électrodes), plaques et vis d'ostéosynthèse, agrafes diverses Co-Cr-Mo Implants articulaires, implants dentaires Ti-6Al-4V Implants articulaires, plaques et vis d'ostéosynthèse, pacemaker, implants dentaires, élément de chirurgie reconstructive Nitinol (Ni-Ti) Implants orthopédiques, stents, agrafes diverses, accolades Schéma et électrodes de pacemaker Plaques d'ostéosynthèse Implants dentaires Stents chaînées dans le vaisseau sanguin Accolades Agrafes Les mousses métalliques présentent les caractéristiques suivantes : ✓ porosité élevée (70%-85%); ✓ perméabilité (taille de pores entre 50 et 400μm); 9  ✓ structures et propriétés similaires à celles des os; ✓ Favorisent l'intégration des implants; ✓ Servent de support à la croissance de tissus osseux; ✓ Permettent l'intégration de facteurs de croissance et de médicaments. La structure, l’excellente résistance à la corrosion, la biocompatibilité et les propriétés mécaniques de ces mousses en font un matériau de choix pour la fabrication d’implants et de systèmes d’ancrage pour des applications orthopédiques(hanches, genoux, reconstruction osseuse, etc.) et dentaires de même que les composantes de dispositifs médicaux d'intervention et de diagnostic (instruments de laparoscopie, endoscopie, etc.). Les matériaux visés sont essentiellement le titane et ses alliages (CpTi, Ti6Al4V, TiNi), les aciers inoxydables et les alliages de Co-Cr-Mo. Les propriétés mécaniques des mousses de titane sont très similaires à celles des os poreux, comparativement à celles du titane solide qui est couramment utilisé en orthopédie et dentisterie. Cette caractéristique permet un meilleur transfert de charge entre l’os et l’implant et favorise une meilleure intégration de l’implant dans l’os. Similarité de la mousse de titane et du corail à l'os spongieux 10 2. Les Céramiques Les céramiques se caractérisent par une température de fusion élevée, une rigidité, une légèreté, une résistance à la chaleur et à la corrosion, et une fragilité qui déterminent leurs domaines d'application. Elles incluent des oxydes (alumine et zircone), des carbures (silicium, tungstène), des borures, des nitrures, des sulfures et des composés intermétalliques. Dans le domaine des biomatériaux, on rencontre principalement : Les céramiques bioinertes, L’alumine (Al2O3) et La zircone (ZrO2), sont des matériaux stables dans le temps, très durs et très fragiles, de très grande pureté, de haute densité, de résistance en flexion très élevée, de faible usure, de faible coefficient de frottement, de très bonne tolérance, de bonne résistance à la corrosion in vivo, de grande durabilité, de mouillabilité élevée que celle des métaux et des polymères, ils possèdent une faible capacité de déformation et d'absorption des chocs, ils associent la plus haute esthétique et la plus haute biocompatibilité. Leur biocompatibilité et leurs caractéristiques mécaniques élevées font d'eux des éléments de prothèses orthopédiques (hanche, genou, épaule) et de prothèses dentaires (couronnes, bridges). Les céramiques bioactives et biorésorbables ✓ Céramique de Phosphate de Calcium sont parfaitement tolérées, fragiles et de faible résistance mécanique qui limitent leur utilisation isolée en cas de contrainte importante. Elles possèdent d’excellentes propriétés d’ostéoconduction et de meilleure colonisation (porosité proche de celle de l'os naturel). Leurs compositions chimiques très proches de celle de la phase minérale de l'os, leurs propriétés biologiques et leur biocompatibilité en font d'excellents produits de substitution osseuse en chirurgie maxillo-faciale, neurochirurgie, odontologie et orthopédie. Les différents produits sont : le phosphate tricalcique 𝛽 (𝛽 TCP), l’hydroxyapatite (HAP) et les produits biphasés (BPC). ✓ Les bioverres SiO2P2O5CaO Na2O développent à leur surface une couche d’hydroxyapatite cristallisée carbonatée similaire à la phase minérale de l’os, en les immergeant dans un fluide physiologique. Cette couche permet ainsi au matériau d’être utilisé comme implant osseux dans un organisme humain. La résorption de ce matériau est particulièrement lente. ils sont utilisés en chirurgie réparatrice dans de nombreuses parties du corps humain dont les osselets de l’oreille (marteau, enclume et étrier), les dents, les genoux, les hanches. II.2. Les polymères Les polymères thermoplastiques Les thermoplastiques peuvent être déformés plastiquement sous l’effet de la température. Ce phénomène est réversible et théoriquement répétable. Ils ont une température au-dessus de laquelle ils sont mous et déformables, et en-dessous de laquelle ils sont durs et fragiles. Cette température s'appelle température de transition vitreuse (Tg) et elle est différente pour 11  chaque plastique. Parfois on ajoute des additifs (plastifiants) au plastique pour le rendre plus mou et plus déformable. La liaison entre les chaînes d'un thermoplastique est faible (changement d'état avec une élévation de température) alors que dans le cas d'un thermodurcissable, elle est forte et donc définitive. Parmi les thermoplastiques on trouve le polyéthylène(PE), le polypropylène(PP), le polystyrène (PS), le polychlorure de vinyle (PVC), le polyméthacrylate de méthyle (PMMA ), le polytétrafluoroéthylène (PTFE), le polyester (PET) et le polycarbonate (PC). Les polymères thermodurcissables ne peuvent pas être recyclés, car leur forme, conférée dans un moule selon un processus chimique, est définitive. Ils sont plus durs et plus rigides que les polymères thermoplastiques. Les principaux polymères thermodurcissables sont : les époxydes ; les phénoliques et les polyamides. Matériau Domaine d'application Polyéthylène (PE) Alèses, champs opératoires, vêtements de protection, tubulures (tubes, sondes, cathéters), sutures, implants vasculaires et orthopédiques. Polypropylène (PP) Seringues jetables, tubes de cathéters, flacons de soluté, fils de suture, ligaments. Polychlorure de Vinyle Poches à sang, à urines, sondes, tubages, gants d’examen, champs (PVC) opératoires. Polystyrène (PS) Boîtes de Pétri. Thermoplastiques Polyester (polyéthylène Sutures, implants vasculaires, valves cardiaques, support d’analyse, téréphtalate : PET) ligaments, chirurgie du tube digestif. Polytétrafluoroéthylène Implants vasculaires, chirurgie faciale, Cathéters, siège de valves (PTFE : téflon) cardiaques. Polyméthacrylate de Lentilles de contact rigides, cristallins artificiels, prothèse dentaire, Méthyle (PMMA) lentilles intraoculaires, ciment orthopédique. Polyamide (PA) Cathéters, sondes, fils de suture. Silicone (Polysiloxane) Cathéters, sondes, drains, lentilles de contact souples, prothèse de Elastomères chirurgie esthétique, pansements pour plaie profonde. Polyuréthane (PEU) Orthèse, matelas, bandes, pacemaker (isolant), Urologie, implants mammaires, valves cardiaques. Les élastomères (caoutchoucs) se caractérisent par leur grande déformabilité, avec par exemple des allongements réversibles jusqu’à 1000 % de leur longueur initiale. Les plus utilisés sont : la silicone et le Polyuréthane. Les élastomères thermoplastiques appartiennent à une nouvelle catégorie de polymères 12  qui allient la déformabilité des élastomères à la recyclabilité des thermoplastiques. II. BIOTECHNOLOGIE CHIMIQUE II1. Synthèse multi étapes de divers principes actif – Hémi et synthèse totale. https://www.maxicours.com/se/cours/synthese-et-hemisynthese-de-molecules- biologiquement-actives/ 1. Problématique : pourquoi synthétiser des molécules ? Dans l’industrie chimique, on arrive à synthétiser et à produire en grandes quantités des molécules biologiquement actives (médicaments). L’intérêt d’une synthèse est de fabriquer la molécule souhaitée à partir de molécules peu onéreuses. La molécule est « façonnée » de la manière que l’on souhaite, afin de lui donner les propriétés voulues. Une hémisynthèse se distingue par rapport à une synthèse par le fait que la molécule utilisée au départ est issue directement de substances naturelles et présente déjà quasiment la structure moléculaire de la molécule finale. Par exemple, l’acide acétylsalicylique (l’aspirine) est produit par hémisynthèse, à partir de l’acide salicylique. Cette molécule présente des propriétés intéressantes en tant que médicament, qui sont conservées par l’aspirine, tout en étant moins nocive pour l’estomac. L’acide salicylique est une substance naturelle (saule), mais peut également être synthétisée à partir du phénol. Certains critères sont à prendre en compte lors d’une synthèse ou hémisynthèse, comme le coût de fabrication de la molécule (réactifs, chauffage, rendement), l’aspect sécurité/environnement (toxicité de certaines espèces manipulées), ainsi qu’un contrôle qualité de l’espèce chimique produite (extraction, purification). Dans la nature, on trouve la plupart des molécules dont on a besoin (parfums, médecine,...). La phytothérapie désigne une pratique de la médecine qui utilise les propriétés médicinales des plantes. Cependant, dans les pays industrialisés, on rencontre peu cette pratique, au profit de la synthèse industrielle de molécules. On peut voir plusieurs raisons : Les quantités de substances actives sont en très petites quantités dans les plantes. A l’échelle d’une population, cela demanderait des quantités énormes de plantes. La synthèse est moins chère. Les molécules actives sont souvent mélangées dans les plantes à d’autres substances non souhaitées, et la séparation n’est pas aisée. Certaines molécules naturelles présentent des effets secondaires. Une synthèse chimique consiste à fabriquer une nouvelle molécule à partir d’une ou plusieurs réactions chimiques. L’enjeu d’une synthèse est de partir de molécules faciles à se procurer (peu chères), en ayant un rendement le plus élevé possible, ce qui inclut l’énergie investie 13 (chauffage). Il faut aussi tenir compte de l’éventuelle nocivité/toxicité de certains réactifs, produits intermédiaires ou sous-produits de réaction. Enfin, il est nécessaire de prévoir l’extraction et la purification de la molécule à synthétiser. Une hémisynthèse est un cas particulier de synthèse chimique. La molécule de départ est issue directement de substances naturelles et correspond quasiment dans sa structure à la molécule que l’on souhaite produire. L’enjeu d’une hémisynthèse est une légère modification afin de faire acquérir à la molécule cible des propriétés qu’elle n’avait pas, ou la rendre plus assimilable pour un consommateur. L’intérêt par rapport à une synthèse est d’économiser des étapes dans la fabrication. 2. Groupes caractéristiques Les molécules biologiquement actives (médicaments par exemple) tirent leurs propriétés de leur structure, mais aussi des fonctions organiques qu’elles possèdent. Le tableau ci-dessous en présente les principales. Certaines sont déjà connues et/ou seront reprises plus en détail dans de prochaines fiches. Nom Structure Remarque Le carbone porteur du groupe Alcool hydroxyle OH doit être tétragonal : 4 liaisons simples. Éther Fonction en bout de chaîne Aldéhyde carbonée. Cétone Acide Caractère acide de la molécule. carboxylique Molécule pouvant présenter des Ester propriétés odorantes : parfums. 14 Amine Caractère basique de la primaire molécule. Souvent, R’ ou R’’ se résument à un atome d’hydrogène. Amide En SVT, les liaisons peptidiques sont des amides. Groupe hydroxyle porté par un cycle benzénique. N’est pas un Phénol alcool, ou alors un « alcool particulier ». Obtenu par déshydratation Anhydride d’acide carboxylique. Très d'acide réactifs. 3. Exemple : hémisynthèse de l'aspirine L’acide salicylique est une molécule présente naturellement dans le saule (un arbre) ou dans la reine des près (une plante). Elle a des propriétés analgésiques (supprime la douleur), antipyrétiques (combat a fièvre) et antiseptique (tue bactéries et virus). Cependant, par hémisynthèse à partir de l’acide salicylique, on produit l’acide acétylsalicylique, plus connu sous le nom d’aspirine. En effet, celle-ci est plus performante comme médicament, a des propriétés anti-inflammatoires, et est moins nocive pour l’estomac. Elle conserve les propriétés de l’acide salicylique, sauf l’effet antiseptique. L’aspirine peut être produite par réaction de l’acide salicylique avec l’acide éthanoïque, appelé aussi acide acétique : 15 Toutefois, le rendement de cette réaction est limité à 8%. Afin de l’augmenter, on a la possibilité de remplacer l’acide éthanoïque par de l’anhydride éthanoïque, plus réactif : La réaction est lente, mais peut être accélérée par chauffage modéré. En Travaux pratiques, le montage correspondant se présente sous la forme : Pendant une vingtaine de minute, le mélange est maintenu à 60 °C par le bain marie. Un tube en verre fait office de réfrigérant à air, et condense les vapeurs afin qu’elles retombent dans le milieu réactionnel. L’acide sulfurique catalyse la réaction entre l’acide salicylique et l’anhydride éthanoïque. Attention, ce dernier est corrosif, et il convient ainsi de prendre des précautions quand on le manipule. Une fois la réaction terminée, le mélange est refroidi pour que l’aspirine cristallise, c'est-à-dire 16 prenne une forme solide. Afin d’extraire les cristaux blancs formés, on utilise alors une filtration sous vide : Le liquide passe à travers le papier filtre et à travers l’entonnoir Büchner, par gravité et par l’aspiration créée par la trompe à eau. Afin de vérifier la qualité de l’aspirine synthétisée, il existe divers tests, comme une chromatographie sur couche mince (CCM). A partir de deux tâches étalons (acides salicylique et acétylsalicylique purs) et un échantillon de l’aspirine synthétisé, une CCM révélée sur UV peut donner ce résultat : Dans cet exemple, l’aspirine synthétisée a été correctement purifiée, car elle ne fait pas apparaître des traces d’acide salicylique qui n’aurait pas réagi. Remarque : l’acide salicylique est aussi synthétisable industriellement à partir du phénol, selon la réaction de Kolbe : 17 II.2.Synthèse peptidique en phase solide et liquide des peptides bioactifs https://www.gazettelabo.fr/archives/pratic/1996/9syntPS.htm L'engouement relatif aux peptides est né dès la fin des années 60, quand est apparu la possibilité de synthétiser chimiquement à façon de grandes quantités de peptides. En effet, I ‘identification de peptides à activité biologique est à la base du développement de nombreuses thérapies : de nombreux peptides naturels ont été caractérisés et portent des activités biologiques très diverses. Citons par exemple : les hormones, les inhibiteurs d'enzymes, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs, les immunomodulateurs... Le peptide de synthèse est promis à un bel avenir : c'est un outil de choix pour des applications aussi diverses que nombreuses dans les domaines de la biologie moléculaire, de la biochimie, de la médecine, du diagnostic et du développement de vaccins et de nouveaux médicaments. Ie peptide est, soit utilisé directement pour ses propriétés pharmacologiques, soit pour permettre d'approfondir la compréhension des mécanismes biologiques dans lesquels il intervient. De façon très schématique, les principales applications développées avec les peptides synthétiques ont pour objectif d'imiter les caractéristiques de portions d'une protéine beaucoup plus longue. Des petits fragments sélectionnés de la protéine sont synthétisés et testés dans des essais biologiques. Cette approche vise à déterminer les sites actifs des protéines : les sites récepteurs, les sites effecteurs et activateurs, les sites de fixation. Les divers sites fonctionnels d'une protéine sont ainsi accessibles. Cependant, alors que l'intérêt du peptide a été validé en recherche, les applications cliniques restent encore limitées. Une raison essentielle est leur rapide dégradation in vivo par les peptidases. A contrario, le peptide présente l'énorme avantage de ne pas générer de métabolite toxique. Différentes méthodologies sont utilisées pour le développement de "peptides médicaments". Grâce à la modélisation moléculaire, les acides aminés peuvent être remplacés par des résidus "exotiques", les liaisons chimiques entre résidus peuvent être remplacées par des liaisons résistantes, ce qui permet de conserver les propriétés caractéristiques intrinsèques du peptide tout 18 en augmentant son temps de demi-vie et/ou son affinité pour sa cible. De tels peptides pharmaco modulés seront la voie de développement de médicaments très sélectifs, basés sur les peptides déjà sélectionnés par la Nature. Le développement de vaccins ou de tests diagnostiques est un domaine où un très grand nombre de peptides sont utilisés. Dans les deux cas, la séquence entière de la protéine est synthétisée sur un support de cellulose sous la forme de peptides courts se chevauchant. Les peptides sont ensuite analysés pour leur reconnaissance par le ou les anticorps anti protéine du sérum humain ou du sérum de mammifère (cartographie des épitopes, régions immunogènes de la protéine). Les peptides qui réagissent peuvent être identifiés et optimisés afin d'être utilisés en routine pour le diagnostic ou encore comme vaccins synthétique pour induire des anticorps. Une telle méthode est aussi applicable à la détermination des zones reconnues par les anticorps auto-immuns. La synthèse de peptides courts chevauchants libres permet, quant à elle, de faire la cartographie des épitopes T impliqués dans l'immunité à médiation cellulaire. La pharmacologie est une autre grande consommatrice de peptides: un grand nombre de peptides sont synthétisés et testés pour leur interaction avec un récepteur ou leur capacité à induire une réponse biologique. Les séquences sélectionnées sont alors synthétisées avec diverses modifications guidées par la modélisation moléculaire qui permettent de déterminer les pharmacophores (les structures importantes pour l'activité pharmacologique). Une stratégie prometteuse pour l'identification des pharmacophores est la synthèse de banques combinatoires de peptides ou de peptidoïdes couvrant un domaine structural assez large. Ici encore, la modélisation moléculaire permet de restreindre et de rationaliser l'espace conformationnel à explorer. Un test de criblage biologique est alors appliqué afin de déterminer les molécules d'intérêt. La chimie des peptides : toujours un défi La synthèse peptidique constitue un défi que les chimistes organiciens s'efforcent de relever depuis le début du siècle. Synthétiser un peptide reste un "art". Les peptides sont de petits fragments de protéines d'une taille comprise entre 2 et quelques dizaines d'acides aminés. Les résidus d'acides aminés d'une chame peptidique sont reliés entre eux par la liaison peptidique, une liaison amide (-CONH-). Ces liaisons sont formées de façon artificielle au cours de la synthèse chimique des peptides. Les difficultés inhérentes à la synthèse peptidique proviennent de la structure même de leurs 19 constituants de base, les acides aminés, qui portent des substituants aux propriétés physico- chimiques très diverses. Un acide aminé porte 4 substituants situés aux sommets d'un tétraèdre autour du carbone central. H H2N-C-COOH R Il existe 20 acides aminés naturels qui se différencient par leur chame latérale R: dimension, forme, charge, capacité à former des liaisons hydrogène, hydrophobicité, et bien sûr réactivité chimique. La nature chimique de R est soit aliphatique (aucune fonction réactive) soit Alcool, Sylphydrile, Amine (primaire, imidazole ou guanidinium), groupement cyclique secondaire, acide ou carboxamide, aromatique, indole. Pour former la liaison peptidique entre 2 acides aminés successifs (M1 et M2 dans le schéma qui suit) dans la séquence désirée, avec le départ d'eau, il faut utiliser un agent de déshydratation. La réalité est pourtant bien différente. Dans une telle réaction le dipeptide AA1-AA2 serait ultraminoritaire dans le mélange réactionnel, pour plusieurs raisons: Si l'on ne bloque pas la fonction H2N (amine a) de AA1 et la fonction COOH de AA2, on forme aussi bien AA1-AA2 que AA2-AA1 et encore AA1-AA1, AA2-AA2, ainsi que des polymères plus lourds, la réaction n'ayant aucune raison de s'arrêter parés le premier couplage. Si i'on ne bloque pas les fonctions réactives éventuellement portées par R1 et R2, il se formera aussi des branchements latéraux de diverses manières. Il est donc nécessaire d'utiliser des groupements protecteurs si l'on veut obtenir un seul produit. Une contingence supplémentaire apparaît aussi: L’orthogonalité des protections. En effet, lorsque l'on voudra coupler un 3ème acide aminé AA3, il faudra pouvoir libérer sélectivement la fonction COOH de AA2 pour permettre la formation de la liaison nouvelle peptidique. Notons que la synthèse chimique des peptides à lieu dans le sens contraire de la synthèse biologique, la raison est fort simple: la nature sait activer la fonction amine (NH2) lors de la formation des aminoacylt RNA, le chimiste ne sait qu'activer la fonction carboxyle (COOH) par formation d'un anhydride symétrique ou d'un est en 20 Avant de pouvoir synthétiser un peptide, les problèmes à résoudre par les organiciens ont donc été les suivants: Disposer d'une stratégie d'activation de la fonction -COOH de l'acide aminé à introduire dans le peptide, qui permette des rendements de couplage supérieurs à 99.99%. En effet, le rendement en produit final décroît exponentiellement avec le nombre d'étapes de couplage : si le rendement n'est "que" de 90% à chaque couplage, (ce qui est déjà excellent pour une réaction organique) au 15ème AA, le rendement final sera (0.9^15) soit 20%. Disposer de groupements protecteurs des fonctions latérales -OH, -SH, -COOH, -NH2, - HN-(C=N)-NH2, -NH-, et savoir les enlever spécifiquement avec une efficacité proche de 100% à la fin de la synthèse du peptide. Disposer de groupements protecteurs de la fonction -NH2 à engager dans la prochaine liaison peptidique, et savoir les enlever spécifiquement entre chaque étape de couplage, là aussi avec un rendement quantitatif, sans toucher aux protections latérales. Ce n'est pas tout: pour arriver au produit final, il faut être capable à chaque étape de couplage de débarrasser le peptide en croissance des réactifs mis en excès, des groupements protecteurs d'amine clivés, et autres produits indésirables. Deux approches sont utilisables: synthèse en phase liquide, avec purification du peptide entre chaque étape, et synthèse sur support solide (résine polymère) où la séparation se fait par simple rinçage parés les étapes de couplage et de clivage de la protection intermédiaire. Chacune de ces méthodes a ses avantages et inconvénients. La synthèse en phase liquide est longue et fastidieuse (au minimum, deux AA par jour) mais elle peut travailler sur des quantités très importantes, de plus la purification intermédiaire garantit du produit final très propre. La synthèse sur support solide est beaucoup plus rapide, elle est automatisable entièrement, mais reste limitée en quantité à quelques grammes de peptide par synthèse. Elle est plus exigeante au point de vue des rendements de couplage et déprotection intermédiares, car i'on conserve sur la résine toutes les ratées de couplage. Il faut donc des rendements excellents. Il faut aussi disposer d'un support adéquat pour l'élongation du peptide, et être capable de cliver le peptide de la résine en fin de synthèse. 21 La suite de notre propos sera consacrée à la mise en œuvre de la synthèse en phase solide: réactifs et instrumentation. Synthèse en phase solide: Dans une série d'articles de 1962 à 1964, R.B. MERRYFIELD à posé les bases de cette stratégie, qui s'est depuis très largement imposée. Le principe général est depuis resté le même, mais des améliorations techniques à tous les niveaux l'ont rendue très praticable. Le schéma montre le principe itératif de la méthode : Le cycle d'addition commence par la déprotection de la fonction amine du peptide en croissance, puis l'addition de l'AA suivant activé, ce qui donne un peptide protégé augmenté d'un M, prêt pour un nouveau cycle. La force de la synthèse sur support solide réside dans les lavages: en phase liquide il faut traduire lavage par purification, Iyophilisation, caractérisation et re-solubilisation. Lorsque le peptide complet est assemblé, le dernier AA est déprotégé, puis les protections latérales sont enlevées et le peptide est clivé du support (ces deux dernières opérations peuvent se faire de façon concomitante). Le peptide libre est purifié, puis caractérisé. en pratique Nous allons passer maintenant en revue les divers points clés de la synthèse sur support solide d'un point de vue pratique: quelles sont les options les plus courantes actuellement, les contrôles de qualité et l'instrumentation, puis nous parlerons de développements de synthèse multiple et de synthèse combinatoire. Groupements protecteurs de la fonction amine a : Deux stratégies de protection sont en concurrence : stratégie Boc et stratégie Fmoc. La stratégie Boc, la plus ancienne utilise un groupement tertiobutyloxycarbonyle pour protéger la fonction a amine de l'AA à coupler. Boc est labile en milieu acide, chaque déprotection intermédiaire a lieu dans un milieu assez agressif, I'acide trifluoroacétique (TFA). La déprotection crée un carbocation très réactif susceptible de donner des réactions secondaires. Les protections latérales doivent résister au TFA; et sont clivées en conditions hyperacide par l'acide fluorhydrique (HF) d'un maniement assez dangereux. La stratégie Fmoc utilise le fluorenemethoxycarbonyle, 22 labile en miiieu nucléophile, il est clivé en quelques secondes par une solution de pipéri dine dans le DMF (diméthyformamide) dans des conditions douces. Les protections latérales doivent être stables en milieu basique et clivées en condition acide (TFA). Les Fmoc-AA sont plus coûteux que les Boc AA, mais l'ensemble des opérations de clivage sont plus douces pour le peptide et l'utilisateur. Cette stratégie est employée en routine dans notre Laboratoire de production et nous donne entière satisfaction. Elle est bien adaptée aux synthétiseurs automatiques, la déprotection peut être suivie en spectrophotométrie U.V. ce qui permet de mesurer l'efficacité des couplages. L'activation des acides aminés L'activation classique d'un acide aminé consiste à replacer l'H du COOH par un groupement bon partant. De nombreuses solutions ont été proposées. Les solutions courantes sont l'utilisation d'esters actifs, ou l'utilisation d'anhydrides symétriques. La réaction doit être rapide et totale, aussi travaille-t-on avec des concentrations aussi élevées que le permettent les solubilités et de larges excès molaires d'AA activés (3 à 10) de façon à accélérer les vitesses de couplages et pousser les réactions jusqu'au bout. Le lavage de la résine permet d'éliminer facilement excès d'AA n'ayant pas réagi. Les stratégies d'activation sont les mêmes que l'on travaille en Boc ou en Fmoc. Anhydrides symétriques: On utilise un carbodilmide, le DIPCDI, agent déshydratant qui permet de former l'anhydride symétrique in-situ. 2 R-CO-OH + DIPCIDI ->R-CO-O-OC-R + Diisopropylurée. Celui-ci est ensuite attaqué par l'amine du peptide en élongation pour former la liaison amide et libérer un acide libre R'-NH2 + R-CO-O-OC-R -> R-CONH-R'+ R-COOH Le couplage est rapide et efficace, mais cette méthode est coûteuse, car le seul des deux AA de l'anhydride sera utilisé. Si l'on travaille avec un excès molaire de 5, on utilise seulement le dixième de la quantité d'AA mise en jeu. Esters actifs : Ici le groupement partant est un alcool. La réaction doit avoir lieu en présence d'une amine tertiaire forte pour capturer l'alcool (un phénol acide) formé. R'-NH2 + R-COOR" + DIEA → R-CONH-R' + O-DIEAH Les esters de pentafluorophénol (Fmoc-AA- oPfp) sont commerciaux, ou peuvent être préparés par couplage par un carbodilmide, puis isolés par cristallisation. Ils donnent des couplages très rapides. Leur prix est très élevé. Les esters de DHBT sont aussi des réactifs très performants. Les esters actifs de DHBT sont aussi des réactifs très performants. 23 Les esters actifs de HOBT (hydroxybenrotriazole) peuvent être formés in-situ, soit en passant par l'anhydride symétrique, soit en utilisant un réactif "moderne" tel que le réactif de Castro (Bop et évolutions PyBop) ou le réactif de Knorr (TBtu et évolutions HAtu). La présence de HOBT semble diminuer des réactions secondaires de racémisations. Des agents de couplage aux noms exotiques apparaissent régulièrement dans les catalogues. Nous avons utilisé en interne la plupart des réactifs cités sur de grands nombres de peptides sans trouver de réactif "miracle" et notre choix a été orienté par le coût, la simplicité, et l'innocuité, plus que par des avantages d'efficacité. Chaque laboratoire a ses préférences pour les stratégies d'activation et l'on peut dire que l'activation n'est pas le principal problème en synthèse peptidique. Le support de synthèse Elément crucial, le support de synthèse est un polymère synthétique qui doit présenter une bonne solvatation dans les solvants organiques employés au cours du cycle d'élongation (DMF, pipéridine/DMF), sans être solubilisée. La résine doit gonfler et être bien perméable pour exposer tous les sites aux réactifs de synthèse. Les supports polystyrène (PS) utilisés jusque dans les années 80 (résines de Merrifield) se tassent dans les solvants polaires (DMF et enfouissent le peptide, et à l'inverse gonflent dans les solvants apolaires, condition où le peptide polaire se replie en pelote et réagit difficilement. Le tassement bouche les colonnes de synthèse et fait apparaître de fortes pressions dans les appareils à flux continu. Plusieurs évolutions ont grandement amélioré la situation: Enrobage de gains de silice comme support mécanique (résines K), greffage de bras porteurs polaires comme le polyéthylène glycol (résines PEG-PS) ou changement de polymère pour des polymères--de type polyacryliques et copolimères polyacryliques /ß Alanine (résines Expansine), polyacrylamide/polystyrène, polyacrylamide/polyéthylène glycol. Nous utilisons en routine des résines de type PEG-PS, K et Expansine pour les synthèses en flux continu et des résines Expansine, PS et PEG-PS pour les synthèses en "batch". Le maillon Le clivage du maillon permet de récupérer le peptide libre en fin de synthèse. En stratégie Fmoc, le maillon est clivé par le TFA, en même temps que les chaînes latérales. Selon la nature de la liaison du premier acide aminé au maillon on obtiendra soit un peptide au COOH libre (liaison ester) soit un peptide-amide (liaison amide). La mise au point d'un bon maillon est délicate, à cause de nombreuses réactions secondaires. (racémisation, cyclisations, alkylations). Selon la nature de l'acide aminé C terminal, le peptidiste est amerié à utiliser des maillons différents pour éviter ces problèmes. Citons enfin l'existence de maillons hyperlabiles qui permettent de récupérer les peptides sans déprotection des chaînes latérales. Ces peptides protégés pourront être couplés entre eux, ce qui permet d'accéder à des peptides de tailles très importantes. Les catalogues des fournisseurs spécialisés dans la synthèse peptidique offrent un grand choix de résines dérivées par 24 des maillons et des acides aminés protégés adaptés aux diverses stratégies de synthèse et clivage. Parmi les maillons les plus employés, en synthèse Fmoc, citons le maillon MBHA-Rink- amide, les maillons HMBA, HMPA, HMPB. Protections latérales : Les protections standard des chaînes latérales en synthèse Fmoc sont stables en milieu basique et clivables par l'acide trifluoroacétique. Les protections standard en synthèse Boc doivent résister au TFA 50% et sont clivées par HF liquide ou TFMSA, sauf Acm, clivé par l'iode/méthanol et Tos, clivé par HOBT 1 M. Le tableau suivant liste les protections utilisées classiquement. On est amené à utiliser des schémas de protections différents, qui permettent des déprotections sélectives, par exemple pour la formation de ponts dissulfure ou la phosphorylation. Déprotection-clivage Cette opération est possible en une seule étape en chimie Fmoc: Le maillon employé entre la résine et le peptide est lui aussi labile dans le TFÀ. En chimie Boc, plusieurs étapes sont nécessaires. Lors du clivage, les groupements protecteurs enlevés forment des carbocations très réactifs qu'il faut piéger par l'adjonction de scavengers (phénol, thiols, silanes, eau) afin des les empêcher de se fixer sur des sites sensibles du peptide. C'est notamment le cas avec le Pmc et le Pbf qui ont tendance à attaquer le tryptophane, s'il n'est pas protégé, et le tBu qui peut alkyler la tyrosine. Les thiols sont employés pour empêcher l'oxydation de la méthionine. Après avoir incubé le peptide-résine dans la mixture de déprotection, la résine est enlevée par filtration, le "jus" de protection contient le peptide,les scavengers, l'agent de clivage, les protections piégées. Il faut alors procéder à la séparation du peptide, soit par précipitation à l'éther et lavages, soit par extractions liquide/liquide puis Iyophilisation. On obtient ainsi le peptide brut. II.3. Etude d’interactions ligand-récepteur, applications. Catalyse enzymatique : principes et applications en chimie thérapeutiques. https://facmed.univ-constantine3.dz/wp- content/uploads/2022/01/INTERACTION-LIGAND-RECEPTEUR.pdf I- Introduction Le signal extracellulaire peut activer une réponse cellulaire par des mécanismes ne faisant pas intervenir initialement une variation du potentiel membranaire. Dans ce cas le messager extracellulaire dit ligand agit sur un récepteur spécifique et l’interaction ligand – récepteur après plusieurs étapes intermédiaires génère la réponse cellulaire. A- Les ligands : ce sont des molécules de signalisation, qui en se fixant sur des récepteurs spécifiques et déterminent une réponse cellulaire. Ces signaux chimiques peuvent être des médiateurs chimiques locaux, des hormones ou des neurotransmetteurs. On distingue 25  plusieurs types de ligands : Les ligands qui se lient à des récepteurs de surface membranaire (hydrosoluble) Les neurotransmetteurs : la noradrénaline, l’histamine…. Les hormones peptidiques : insuline…. Les facteurs de croissance : NGF….. Les molécules de signalisation lipophiles : les prostaglandines… Les ligands qui se lient à des récepteurs intracellulaires (liposolubles) Les hormones qui diffusent à travers la membrane plasmique et interagissent avec des récepteurs dans le cytosol ou le noyau : hormones stéroïdes, la thyroxine, l’acide rétinoïque, l’oxyde nitrique. ✓ B- Les récepteurs : ce sont des protéines, soit exprimées à la surface ou à l’intérieur des cellules cibles. Ils ont une double capacité : reconnaitre spécifiquement une molécule de signalisation, et induire des modifications à la surface ou à l’intérieur de la cellule suite à l’occupation du récepteur par le ligand. Il existe plusieurs types de récepteurs : Les récepteurs de surface Récepteurs canaux Récepteurs couplés aux protéines G Récepteurs enzymes Les récepteurs intracellulaires : situés soit dans le cytosol ou dans le noyau. II- Conséquences des interactions ligand – récepteur : L’interaction ligand – récepteur génère une réponse cellulaire, c'est-à-dire des modifications du comportement cellulaire qui sont de trois types : ✓ Changement de la perméabilité membranaire vis-à-vis des ions et de l’eau ✓ Modification des activités enzymatiques à la surface et à l’intérieur de la cellule ✓ Modification des activités transcriptionnelles III- Mode d’action Selon le type de récepteurs, on distingue plusieurs mécanismes : 1- Récepteurs canaux (récepteurs ionotropiques) : Ce mécanisme concerne essentiellement les cellules excitables comme les neurones ou les fibres musculaires. Ces récepteurs sont des protéines canaux transmembranaires qui possèdent des sites de fixation du ligand. La fixation de ce dernier provoque la modification de la conformation de la protéine canal qui devient perméable à certains ions (Ex : récepteur 26  nicotinique cholinergique). L’Activation du canal ionique peut générer la réponse cellulaire par deux mécanismes : ✓ L’ouverture du canal peut permettre un influx d’ions en quantité suffisante pour provoquer directement la réponse. ✓ Soit un mouvement d’ions de faible amplitude qui cependant modifie la répartition des charges de part et d’autre de la membrane et donc le potentiel de membrane et peut activer les canaux ioniques potentiels dépendants ce qui permet de déclencher un potentiel d’action 2- Récepteurs couplés aux protéines G : ce sont des récepteurs liés à une protéine G, cette dernière est composée de trois sous unités α (αs ou αi), β et γ. La sous unités α possède un site de liaison avec le GDP/GTP. Au repos la sous unités α est liée à la GDP (αs- GDP), Lorsqu’un ligand se fixe sur la portion extracellulaire du récepteur, la protéine G sera activée et le complexe (αs-GDP) sera remplacé par le complexe (αs-GTP), ce dernier active à son tour une enzyme appelée effecteur dont le résultat est la formation d’un second messager, qui active les protéines kinase. Ces derniers peuvent provoquer indirectement l’ouverture d’un canal ionique ou par une cascade biochimique activer (ou inhiber) les activités transcriptionnelles. Nb : dans le cas du complexe αi-GTP le résultat sera l’inhibition de la formation du second messager 3- Récepteurs enzymes : ces récepteurs présentent un domaine extracellulaire qui se lie avec le ligand et un domaine cytoplasmique enzyme. La fixation du ligand entraine l’activation du domaine enzymatique cytoplasmique qui provoque la phosphorylation de certaines protéines. 27 C- Mise en jeu des seconds messagers Les seconds messagers sont de petites molécules synthétisées (ou libérées) dans la cellule en réponse aux molécules de signalisation extracellulaires. Les principaux seconds messagers sont : 1- AMPc : Elle est formée à partir de l’ATP grâce à une enzyme : l’adénilate cyclase dont l’activité est contrôlée par l’interaction ligand – récepteur, en présence de guanosine triphosphate GTP qui agit par l’intermédiaire d’une protéine G. après sa synthèse l’AMPc se fixe à un récepteur intra cytoplasmique qui est une protéine kinase contenant une sous unité catalytique, qui va se libérée suite à cette fixation et peut phosphoryler une protéine. Cette dernière est une molécule informative qui permet de transformer un substrat A précurseur en une forme différente B qui représente la réponse cellulaire. La spécificité du message cellulaire est donc assurée non pas par l’AMPc qui est un substrat ubiquitaire mais par la spécificité du récepteur auquel elle se lie. 2- Inositol triphosphate (IP3), diacyl glycérol (DG), Ca+2 : l’hydrolyse de l’inositol poly phosphate (IPP) intra membranaire par une phospholipase C intra membranaire déclenchée par l’interaction ligand – récepteur conduit à la formation de diacyl glycérol (DG) et de l’inositol triphosphate (IP3). Ce dernier pourrait être le messager permettant la libération du Ca++ stocké dans la cellule. Le DG formé à un double rôle : ✓ Source d’acide arachidonique précurseur des prostaglandines et de leukotriène ✓ Lui-même second messager car il active spécifiquement une protéine kinase : la protéine kinase C (PKC), cette activation dépend également du Ca+2. Le complexe DG-PKc-Ca+2 catalyse la phosphorylation des protéines intervenant dans certaine réponses cellulaires. 3- L’ion Ca+2 : C’est un second messager d’action plus complexe. Les mécanismes qui augmentent sa concentration intracellulaire sont multiples : un influe de Ca+2 extracellulaire à travers les canaux calciques potentiels ou récepteurs dépendants ou bien la libération du Ca+2 stocké dans le compartiment intracellulaire. L’augmentation de la concentration calcique intracellulaire permet au Ca+2 de se lier à différents types de protéines dites calciprotéines. Dans certains cas le complexe Ca+2- calciprotéine active une série 28  de réactions enzymatiques qui conduit à la réponse cellulaire (Ca+2- calmoduline). Dans d’autre cas ce complexe est une enzyme. 4- GMPc : produit à partir du guanosine triphosphate (GTP) par la guanylate cyclase et dégradé en GMP par une phosphodiestérase. 29 III. BIOTECHNOLOGIE ENVIRONNEMENTALE : Le traitement biologique, qu’il concerne des terres excavées ou des sols et nappes phréatiques encore en place, consiste à utiliser des micro-organismes pour transformer des substances chimiques toxiques en substances non toxiques. Les micro-organismes sollicités sont souvent des bactéries bien que les champignons jouent un rôle dans certains traitements ex situ. 1. DEFINITION DE BIORESTAURATION : La biorestauration est une action de restauration d'un écosystème dégradé par le recours à des organismes vivants (microbes par exemple) pour éliminer les déchets toxiques qui s'y trouvent. Exemple : Dans le cadre d’une bioremédiation, des roseaux peuvent par exemple être plantés en bordure d’un plan d’eau dans le but d’en extraire des phosphates présents en trop grande concentration. Figure : Des roseaux plantés en bordure d’un plan. 2. TYPES DE BIORESTAURATION : Les principaux types de biorestauration sont les suivants : ▪ Biostimulation -- Ajout de substances nutritives et d´oxygène, sous forme liquide ou gazeuse, aux eaux usées ou aux sols contaminés pour favoriser la croissance et le développement de bactéries déjà présentes dans le milieu. La disparition des contaminants est contrôlée afin de garantir l´efficacité des mesures correctives. ▪ Bioaugmentation -- Ajout de micro-organismes aptes à nettoyer un polluant particulier aux eaux ou aux sols contaminés. La bioaugmentation est généralement utilisée avec succès sur des polluants retirés de leur site d´origine, comme par exemple dans des installations municipales de traitement des eaux usées. Jusqu'à présent, cette méthode n'a pas eu beaucoup de succès dans les sites pollués, en raison de la difficulté de contrôler les conditions du site pour optimiser la croissance des micro-organismes introduits. Comme les scientifiques n'ont pas encore compris tous les mécanismes que comporte la biorestauration, les organismes introduits dans un environnement étranger ont parfois de la difficulté à survivre. 30  ▪ Biorestauration intrinsèque -- Aussi connue sous le nom d´atténuation naturelle, ce type de biorestauration se produit naturellement dans les sols et les eaux contaminés. Cette biorestauration naturelle est le travail de micro-organismes que l'on retrouve dans les sites contaminés par des produits pétroliers, tels que les anciennes stations d'essence dont les réservoirs souterrains fuyaient. Les chercheurs tentent de déterminer si la biorestauration intrinsèque se produit dans des zones contaminées par d'autres types de produits chimiques. L'application de cette technique exige un contrôle étroit de la dégradation des polluants afin de veiller à la protection de l'environnement et de la santé humaine. Chacun des trois types de biorestauration peut être utilisé sur le site contaminé (in situ) ou sur des produits contaminés prélevés sur le site et transportés ailleurs (ex situ). Dans le cas de sols, de sédiments et de boues pollués, la technique peut nécessiter la préparation de la terre afin que les micro-organismes soient bien pourvus en substances nutritives et en oxygène. 2.1. FONCTIONNEMENT DE LA BIORESTAURATION : La biorestauration repose sur les processus biologiques naturels des micro-organismes, dont le métabolisme. 1. Métabolisme microbien : Le métabolisme est l'ensemble de toutes les réactions chimiques qui se produisent dans une cellule ou un organisme. Tous les processus de la vie sont basés sur une série complexe de réactions chimiques. Le processus métabolique se divise en deux phases : l´anabolisme, qui élabore des structures moléculaires complexes à partir de molécules plus simples, et le catabolisme, qui dégrade les molécules complexes en molécules plus simples. Les produits chimiques des sites pollués peuvent être dégradés par l'un ou l'autre de ces processus, ou les deux. 2. Anabolisme – la construction : Dans le cas de l'anabolisme, les produits chimiques absorbés par le micro-organisme sont utilisés pour bâtir diverses parties de la cellule. Le carbone et l'azote sont les produits chimiques de base des protéines, des sucres et des acides nucléiques qui composent les cellules microbiennes. Les micro-organismes puisent le carbone et l'azote du sol, de l'eau et de l'air qui les entourent. Pour absorber les substances nutritives et les transformer en éléments de cellules, les micro- organismes ont besoin d'énergie. C'est là que le catabolisme entre en jeu. 3. Catabolisme – la dégradation : Le catabolisme permet aux micro-organismes de puiser de l'énergie dans les produits chimiques disponibles dans l'environnement. Bien que la plupart des micro-organismes soient exposés à la lumière et aux sources chimiques d'énergie, ils comptent généralement sur les produits chimiques pour se doter d'énergie. Lorsque les produits chimiques se dégradent, ils 31 libèrent de l'énergie, que les micro-organismes utilisent pour effectuer des fonctions cellulaires telles que celles de l'anabolisme. 2.2. ROLE DE L'ANABOLISME ET DU CATABOLISME EN BIORESTAURATION : Les produits chimiques présents dans les sites contaminés prennent part aux processus d'anabolisme et de catabolisme. Par exemple, les hydrocarbures (qui sont des dérivés du carbone) présents sur les sites renfermant des produits pétroliers peuvent être absorbés par les micro- organismes, qui les utilisent comme éléments cellulaires de base. Les micro-organismes ont besoin de certains autres produits chimiques,notamment les composés chimiques associés au phosphore, au potassium, au calciumet au sodium. Les micro-organismes ont également besoin d´infimes quantités de certains autres éléments chimiques, y compris le chrome, le cobalt, le cuivre et le fer, disponibles en abondance dans les sites contaminés. 2.3. TRAITEMENT DES EAUX USEES : 2.3.1. DEFINITION DE LA POLLUTION DE L’EAU : La pollution de l'eau toute modification chimique, physique ou biologique de la qualité de l'eau qui a un effet nocif les êtres vivants la consommant. Quand les êtres humains consomment de l'eau polluée, il y a en général des conséquences sérieuses pour leur santé. La pollution de l'eau peut aussi rendre l'eau inutilisable pour l'usage désiré. 2.3.2. LES PARAMETRES QUI DEFINISSENT LA QUALITE DE L’EAU : Les paramètres fréquemment réglementés sont : la qualité organoleptique (couleur, turbidité, odeur, saveur) ; certains paramètres physico-chimiques naturels substances de(température, pH, chlorures : 200 mg/l, sulfates : 250 mg/l, etc.) ;la présence de dites indésirables (nitrates : 50 mg/l, nitrites, pesticides, etc.) ; la présence substances toxiques (arsenic, cadmium, plomb, hydrocarbures, etc.) ; Certains paramètres microbiologiques ; l'eau ne doit pas contenir d'organismes pathogènes, notamment de coliformes fécaux). Ces paramètres peuvent être assurés par un traitement spécifique de l’eau ; dans certains cas il pourra s'agir d'un simple stockage en milieu hermétique (citerne souple) ou autre, permettant la stabilisation biologique. 2.3.3. LES PRINCIPAUX TYPES DE POLLUTIONS : A. POLLUTION PHYSIQUE : Il s'agit d'une pollution qui se traduit par la présence des particules de taille et de matière très variés dans l’eau, qui lui confèrent un caractère trouble. On distingue aussi les matières décantées (plus lourdes que l’eau), les matières flottables (plus légères que l'eau) et les matières non 32 séparables (de même densité que l'eau). La pollution physique désigne l’autre type de pollution, telle que la pollution thermique due aux températures élevées qui cause une diminution de la teneur en oxygène dissous ainsi qu’une réduction de la solubilité des gaz et la pollution radioactive. B. POLLUTION CHIMIQUE : La pollution chimique de l’eau est due essentiellement aux déversements de polluants organiques et des sels de métaux lourds par les unités industrielles. L’enrichissement des sols pour intensifier l’agriculture par diverses catégories d’engrais et de pesticides est également à l’origine de la pollution chimique des sources et des nappes souterraines. Ces substances exercent un effet toxique sur les matières organiques et les rendent plus dangereuse. Les polluants chimiques sont classés en cinq catégories : ✓ Les polluants chimiques dits indésirables (nitrate, les composés phosphorés et les sels ammoniacaux). ✓ Les polluants chimiques toxiques. ✓ Les pesticides et produits apparentés. ✓ Les hydrocarbures. ✓ Les détergents. 2.3.4. LES DIFFERENTS PROCEDES D’EPURATION DES EAUX USEES : Il existe différents procédés d’épuration des eaux usées des agglomérations. A. LES STATIONS D’EPURATION : Principe de fonctionnement d’une station d’épuration urbaine. Il existe différents procédés d’épuration des eaux usées des agglomérations. Si les petites collectivités peuvent recourir à des procédés dits « rustiques » (lagunages naturels, lits à macrophytes, filtres à sable,....). La chaîne de traitement des effluents urbains comprend en général dans l’ordre : Une première phase d’élimination des petits déchets flottants et des matières en suspension : 1. le dégrillage : passage des effluents à travers un crible pour enlever les petits déchets (morceaux de plastique, de papiers,...) 2. Le dessableur : fosse ou sont piégés par gravité les graviers et sables. Cette opération permet que ces éléments durs ne provoquent pas de dégâts dans les installations d’épuration et notamment les pompes. 3. Le déshuileur : piège les huiles et les graisses qui flottent naturellement à la surface de l’eau. L’injection de bulles d’air dans l’effluent favorise la remontée des huiles à la surface, 33 4. Le décanteur primaire : est un grand bassin où les matières restantes se déposent au fond par gravité pour former des boues. Les boues sont retirées par pompage et dirigées pour être stockées en attendant leur évacuation dans un silo à boues.... Une seconde phase d’élimination des produits dissous dans les eaux : Dans le bassin d’activation, on transforme la matière organique dissoute en accélérant les processus d’autoépuration naturels qui se développent dans les rivières, par une oxygénation poussée (injection d’air ou brassage mécanique) qui va favoriser la consommation par les bactéries des matières organiques, transformées essentiellement en nitrates dissous dans l’eau. Ensuite, dans une phase de clarification (appelée aussi de « décantation secondaire »),les eaux déposent encore des boues. Une part de ces boues, très riches en micro-organismes, peut-être pompée pour être réinjectée dans le bassin d’activation pour le réensemencer, c’est à dire l’enrichir en bactéries et augmenter l’épuration. L’excédent des boues est envoyé dans le silo à boue. Après épuration, les eaux sont rejetées dans le milieu naturel. Ces eaux épurées contiennent en solution : - des nitrates provenant de la décomposition des matières organiques, des phosphates provenant en grandes parties des lessives eaux épurées contiennent en solution : - des traces de produits chimiques qui n’ont pas été dégradés ou piégés dans les boues de la station. Le rendement de la station d’épuration se mesure en comparant la charge organique des eaux à l’entrée et à la sortie de la station. Le rejet de nitrates et de phosphates favorise l’eutrophisation des rivières. Pour pallier à cette situation, certaines stations d’épuration peuvent être équipées de traitements complémentaires pour réduire la présence d’azote et de phosphore dans le rejet. La dénitrification : pour éliminer l’azote, la station d’épuration doit être équipée d’un système de dénitrification des eaux épurées avant leur rejet en le faisant passer dans un bassin spécifique d’anoxie ; On y prive d’air les bactéries d’épuration qui s’emparent des atomes d’oxygène des molécules de nitrates, ce qui libère de ce fait leurs atomes d’azote qui s’échappent sous forme gazeuse vers l’atmosphère. La déphosphatation Un floculant (chlorure ferrique, sulfate d’aluminium,) est ajouté dans le station d’épuration aux effluents. Les molécules de ce floculant fixent les particules phosphorées de suspension qui s’agglutinent pour former un floc qui précipite au fond du bassin traitement pour former de la boue d’épuration. 34  Figure : Principe de fonctionnement d’une station d’épuration. 2.3.5. LA PHYTOEPURATION : 1. LA DEFINITION DE LA PHYTOEPURATION : La phytoépuration est pour ainsi dire, un ensemble de techniques naturelles issues de la combinaison des végétaux du sol et des micro-organismes dans un écosystème qui a été créé spécifiquement pour cela. La phytoépuration permet surtout de traiter les nitrates et les phosphates, ainsi que des métaux qui sont les principaux polluants des eaux. En ce sens, le procédé de phytoépuration élimine les agents biologiques infectieux présents dans les eaux. 2. FONCTIONNEMENT DE LA PHYTOERUPTION : Tout d'abord, il conviendra de sélectionner des plantes spécifiques possédant la capacité d’absorber les polluants. Ces plantes sont accessibles par tout un chacun qui veut investir dans le procédé de phytoépuration. Les plantes épuratrices les plus communes sont les bambous, les roseaux, les massettes ou encore les laîches. Les bactéries présentes dans les racines de ces plantes ont la propriété de purifier l’eau, de par leurs spécificités organiques. En général, le procédé est constitué de trois étapes distinctes, notamment : le prétraitement, le traitement des composés chimiques et le traitement biologique de l’eau. 35 3. LES DIFFERENTES ETAPES DE PURIFICATION D’EAU PAR LA PHYTOEPURATION : 1ère étape : la première étape de ce procédé d’épuration d’eau, les petits cailloux préinstallés dans un bassin et les racines des roseaux plantés dans ce bassin gardent les macros particules à la surface de l’eau et les autres éléments se changeront ensuite en compost. 2ème étape : la deuxième étape, qui est le traitement des composés chimiques, les plantes aspirent les nitrates et les phosphates et les métaux qui sont présents dans l’eau. Cette deuxième étape assure aussi la décomposition de polluants, surtout ménagers, présents dans l’eau. 3ème étape : le traitement biologique est la phase finale pendant laquelle les bactéries décomposent les composts stockés au niveau des racines pour les modifier en matières minérales nourrissantes des plantes. En ce sens, la purification de l’eau sera effective en quelques étapes. Figure : Principe de fonctionnement de la phytoépuration. 36