Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante PDF

Docente Alessandra De Bruno Lezione Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø Attività antiossidante; Ø Saggi di valutazione delle capacità...

Docente Alessandra De Bruno Lezione Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø Attività antiossidante; Ø Saggi di valutazione delle capacità antiossidante: Ø Metodi HAT; Ø Metodi SET; Ø Metodi FOLIN Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 2 di 29  Alessandra De Bruno 1. La chimica analitica e la determinazione della capacità antiossidante In seguito a diversi studi, rivolti ad evidenziare l’importanza dei composti antiossidanti, per quel che concerne lo stress ….la necessità di poter quantificare in modo standardizzato la capacità ossidativo e le sue drastiche conseguenze sulla salute antiossidante di diversi composti e umana, sta diventando sempre più di interesse scientifico …. sostanze. Il ruolo della chimica analitica è stato infatti quello di mettere a punto metodiche standardizzate, in grado di valutare e misurare la capacità antiossidante (AOC) di campioni reali come quelli alimentari (quali frutta, cibo, bevande ed estratti naturali) e quelli clinico-biologici quali plasma sanguigno, urine e siero. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 3 di 29  Alessandra De Bruno 2. Attività antiossidante Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 4 di 29  Alessandra De Bruno Col termine attività antiossidante: si intende la costante cinetica di un singolo composto antiossidante nei confronti di un preciso radicale libero; ci si riferisce cioè alla capacità di una particolare molecola antiossidante, di bloccare e contrastare i vari meccanismi radicalici. La necessità di poter confrontare diversi prodotti commerciali e agroalimentari e di controllare lo stato di salute di pazienti, ha permesso l’ottimizzazione e la messa a punto di metodiche standard per la valutazione dell’AOC. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 5 di 29  Alessandra De Bruno 2.1 Una metodica standard per la determinazione dell’Attività antiossidante, dovrebbe presentare e rispettare i seguenti requisiti: 1. Riguardare misurazioni chimiche applicabili a campioni reali; 2. Impiegare reazioni che avvengono preferenzialmente nei sistemi viventi per la generazione di specie radicaliche; 3. Essere semplice, rapido e facilmente applicabile per analisi routinarie e di controllo qualità; 4. Richiedere l’utilizzo di una strumentazione analitica facilmente reperibile, poco costosa e di facile impiego; 5. Avvenire secondo un preciso meccanismo chimico di reazione; 6. Essere altamente riproducibile e robusto; 7. Essere adattabile preferenzialmente per antiossidanti idrofilici e lipofilici. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 6 di 29  Alessandra De Bruno L’attività antiossidante di un alimento non è determinata da una sola componente, ma da diversi componenti che agiscono non in modo additivo ma sinergico. Pertanto la concentrazione di un componente non è indicativa della capacità antiossidante di un alimento, ma non lo è nemmeno la determinazione della concentrazione di diversi componenti, in quanto essa non è in grado di definire l’eventuale sinergismo. Pertanto, si è ricorsi a metodi che misurano in vitro la capacità antiossidante totale dell’alimento. I metodi in vitro sono molteplici, il loro limite è che essi valutano situazioni diverse, per cui i risultati ottenuti con un metodo non possono essere comparabili a quelli ottenuti con altri metodi Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 7 di 29  Alessandra De Bruno Per tali ragioni, per lo stesso alimento, si ottengono risultati diversi, nessuno dei quali rappresenta realmente l’attività antiossidante totale dell’alimento. Nemmeno la somma dei risultati ottenuti in ambiente lipofilo ed idrofilo rappresenta l’attività totale, in quanto non si tiene conto dei sinergismi (Pellegrini et al., 2003). Quando si ritiene di aver raggiunto un livello accettabile di capacità antiossidante di un alimento, bisogna dimostrare che questa corrisponde all’efficacia antiossidante in un sistema biologico. Data la complessità e la vastità dell’argomento, non è possibile applicare un metodo assoluto per valutare il valore dell’AOC; i metodi proposti, infatti, portano a risultati molto diversi, per cui si può parlare solo di metodi relativi Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 8 di 29  Alessandra De Bruno L’efficacia in vivo può essere considerata la capacità di prevenire/ limitare il danno ossidativo in un sistema biologico. Per determinare l’efficacia antiossidante di un alimento è fondamentale, quindi, eseguire misurazioni su sistemi biologici. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 9 di 29  Alessandra De Bruno 2.2 Ogni metodo solitamente presenta le seguenti caratteristiche: - un substrato, ovvero una molecola con particolari caratteristiche chimico-fisiche, che deve subire l’attacco di specie radicaliche, - un agente ossidante o iniziatore di radicali, - una molecola antiossidante o un campione di cui si vuole testare l’AOC - un sistema strumentale in grado di monitorare nel tempo una proprietà della soluzione che viene fatta variare con lo sviluppo e produzione di radicali. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 10 di 29  Alessandra De Bruno Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 11 di 29  Alessandra De Bruno 3.Saggi di valutazione delle capacità antiossidante Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 12 di 29  Alessandra De Bruno Per la valutazione del potenziale antiossidante differenti test vengono utilizzati. Molti di questi richiedono misurazioni spettrofotometriche, per quantificare particolari composti, e un certo tempo di reazione, per misurare i prodotti e per ottenere risultati riproducibili Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 13 di 29  Alessandra De Bruno 3.1 Saggi di valutazione della capacità antiossidante che sfruttano il trasferimento di atomi di idrogeno (HAT) Questi saggi sono basati sulla reazione competitiva per il radicale perossidico tra una sostanza antiossidante e un substrato. Un esempio è rappresentato dal saggio ORAC e dal TRAP, che utilizzano un radicale iniziatore per generare un radicale perossile Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 14 di 29  Alessandra De Bruno 3.1.1 Metodo ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity) Saggio maggiormente utilizzato per determinare l’attività antiossidante totale di sostanze naturali, estratti vegetali ed alimenti. Tale saggio ORAC valuta la perdita di fluorescenza in presenza di generatori di radicali idrossilici e perossidici, come il 2,2’-azobis (2-amidinopropano) diidrocloruro, (AAPH), ad una temperatura di 37°C. Le molecole antiossidanti presenti nel campione bloccano e inibiscono l’azione del radicale libero. Quando le molecole di antiossidante non sono più sufficienti a bloccare Il metodo originario utilizzava come “molecola probe” di fluorescenza la l’azione dei radicali alchil perossidici, questi attaccano la fluoresceina, β- Ficoeritrina. In seguito è stato proposto di cambiare il marker di fluorescenza utilizzando la più comune Fluoresceina. Quest’ultima, oltre causando un netto e repentino calo dell’intensità di emissione. ad essere più facilmente reperibile ed economica, è estremamente vantaggiosa perchè è più stabile della β-ficoeritrina e permette di ottenere una maggiore sensibilità e selettività del metodo. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 15 di 29  Alessandra De Bruno Il parametro monitorato nel tempo, attraverso uno spettrofluorimetro, è la perdita di fluorescenza (“loss of fluorescence”). Ovviamente all’aumentare della concentrazione di antiossidante, aumenta il valore della “lag phase” o “lag time”, ovvero il tempo di protezione da parte dell’antiossidante, prima dell’ attacco alla fluoresceina da parte dei radicali ROO·, con conseguente diminuzione dell’intensità di luce emessa. I valori dell’effetto protettivo dell’antiossidante verso il probe di fluorescenza, è dato dalla misura dell’area sottesa alla curva di decadimento dell’intensità emissiva, sottratta del valore del bianco.. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 16 di 29  Alessandra De Bruno che è una molecola sintetica I valori ORAC per i campioni reali vengono quindi espressi come impiegata come standard di riferimento nelle analisi, la quale corrisponde all’analogo micromoli di Trolox equivalenti (TE), valutati per litro o grammo di idrosolubile della Vitamina E, poichè la lunga catena alchilica apolare è stata sostituita da un campione ([µmol di TE/g] o [µmol di TE/L]). gruppo carbossilico fortemente polare. Il metodo ORAC è stato largamente applicato e adattato da diverse aziende per la quantificazione dell’AOC, e viene anche riportato sull’etichetta di diversi prodotti alimentari. Sulla base di tale metodo è stato stimato che ogni individuo, al fine di poter contrastare gli effetti deleteri dei ROS e le conseguenze che ne derivano, debba assumere una quantità di frutta, verdura e alimenti vari, che gli consentano di raggiungere quotidianamente un valore di unità ORAC pari a circa 5000. Per questo motivo, medici e nutrizionisti consigliano di consumare 5 pasti al giorno di frutta e verdura. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 17 di 29  Alessandra De Bruno Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 18 di 29  Alessandra De Bruno 3.1.2 Metodo TRAP (Total Radical Trapping Antioxidant Parameter) Il metodo TRAP è un sistema, come l’ORAC, in grado di determinare la capacità antiossidante di campioni quali siero (plasma), prodotti alimentari e prodotti farmaceutici. Questo è un metodo basato sulla fluorescenza, in cui il livello di perossidazione indotto dal 2,2’azobis (2- amidinopropano) dicloridrato (AAPH), azocomposto solubile in acqua che si decompone termicamente portando alla formazione, a velocità costante, di radicali perossidici acquosi, viene evidenziato mediante la riduzione di fluorescenza della proteina marker R-ficoeritrina (R-PE) (Ghiselli et al., 2000). Anche in questo caso il tempo di decadimento della fluorescenza risulta essere proporzionale alla quantità ed attività degli antiossidanti presenti nel campione in analisi. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 19 di 29  Alessandra De Bruno 3.2 Saggi di valutazione della capacità antiossidante che sfruttano il trasferimento di singoli elettroni (SET) Queste sono reazioni caratterizzate dal trasferimento elettronico ed i metodi sono basati sulla capacità di una sostanza antiossidante di ridurre una specie test. Un esempio possono essere il saggio FRAP e il TEAC, dove gli antiossidanti sono ossidati dagli agenti ossidanti, come il Fe (III) o l’ABTS+. Come risultato, un singolo elettrone è trasferito dalla molecola antiossidante all’ossidante. Il cambio di assorbanza dell’antiossidante o dell’ossidante è misurato da uno spettrometro UV-visibile e il valore di assorbanza è usato come misura quantitativa della capacità riducente di un antiossidante. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 20 di 29  Alessandra De Bruno 3.2.1 Metodo ABTS-TEAC La prova permette di determinare il potere antiossidante di diverse matrici biologiche tramite la reazione fra il campione da analizzare con un radicale catione. In questo saggio (Re et al., 1999) il radicale catione colorato stabile (R +) viene generato mediante l’ossidazione del sale di diammonio dell’acido 2,2ʹ-azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico (ABTS) per mezzo di una soluzione di potassio persolfato (K2S2O8). Composti antiossidanti (AOH) che sono capaci di trasferire un atomo di idrogeno o un elettrone al radicale catione, causano una decolorazione della soluzione. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 21 di 29  Alessandra De Bruno Si analizza quindi all’UV-Vis la diminuzione del picco a 734 nm del radicale catione (ABTS+) dopo un tempo di incubazione prestabilito. Questa diminuzione (decolorazione) è proporzionale alla carica antiossidante presente nel campione. La capacità antiossidante verrà determinata calcolando la percentuale di inibizione Poichè l’ABTS è ben solubile sia in ambiente acquoso che in solvente organico, la metodica può essere sfruttata ampiamente per la determinazione dell’AOC sia per composti idrofilici che lipofilici. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 22 di 29  Alessandra De Bruno Metodo TEAC (Trolox Equivalence Antioxidant Capacity) La quantificazione dell’AOC per un generico composto antiossidante, si ottiene da una retta di calibrazione, che mette in relazione la perdita del segnale di assorbanza con la concentrazione di antiossidante aggiunto in cuvetta. Il metodo prende anche il nome di TEAC (acronimo di Trolox® Equivalent Antioxidant Capacity), perchè riporta i valori di AOC dei vari campioni, come Trolox® equivalenti, ovvero la concentrazione millimolare di una soluzione di Trolox® che ha la stessa capacità antiossidante di una soluzione 1mM della soluzione del composto o miscela da investigare. Il Trolox® viene utilizzato anche come probe di riferimento per confrontare i valori dei vari AOC, relativi ai diversi composti antiossidanti, al fine di poter definire un trend di capacità antiossidante tra le varie molecole. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 23 di 29  Alessandra De Bruno 3.2.2 Metodo DPPH La prova permette di determinate il potere antiossidante facendo reagire il campione da analizzare con una soluzione (generalmente metanolica) di DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Composti antiossidanti, che sono capaci di trasferire un atomo di idrogeno al radicale, causano una decolorazione della soluzione. Si analizza quindi all’UV-Vis la diminuzione del picco a 515 nm del radicale (DPPH) dopo un tempo di incubazione prestabilito, inoltre la reazione viene effettuata a temperatura ambiente per eliminare il rischio di degradazione termica (Bondet et al., 1997). Questa diminuzione (decolorazione) è proporzionale alla carica antiossidante presente nel campione. La concentrazione finale di antiossidanti totali, può essere calcolata come % di inibizione del radicale DPPH Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 24 di 29  Alessandra De Bruno La concentrazione finale di antiossidanti totali, può essere calcolata come % di inibizione del radicale DPPH, attraverso la seguente formula: dove: Acontrollo= assorbanza al tempo 0 Acampione: assorbanza del campione misurato dopo 60 minuti. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 25 di 29  Alessandra De Bruno 3.2.3 Metodo FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) Il metodo FRAP, come il metodo TEAC, è un sistema in grado di determinare la capacità antiossidante di fluidi biologici basato sulla reazione di trasferimento di un singolo elettrone. Tale protocollo fu proposto da Scottish Crop Research Institute e riadattato da Benzie e Strain (1996). Il test misura la riduzione della 2,4,6-tripiridil-s-triazina ferrica (TPTZ) a formare un prodotto colorato blu intenso. Il potere riducente è relazionato al grado di idrossilazione ed estensione della coniugazione nei polifenoli. Tuttavia il FRAP non è in grado di rivelare composti che agiscono per trasferimento di idrogeno (radical quenching), come tioli e proteine. L’assorbanza della soluzione a 593 nm riflette l’estensione della riduzione. Il potere riducente è normalmente comparato con quello dell’ammonio ferro-solfato ma altri antiossidanti idrofilici, come il trolox, analogo della vitamina E, vengono usati come standard alternativi Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 26 di 29  Alessandra De Bruno 4. Metodo Folin-Ciocalteu Questo metodo si basa sull’ossidazione chimica dei composti fenolici da parte di una miscela ossidante, chiamata reattivo di Folin, costituita da acido fosfotungstico e fosfomolibdico che, riducendosi, forma una miscela di ossidi di colore blu, l’intensità della colorazione (blu) è proporzionale al numero di residui fenolici. (Singleton et al., 1999). Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 27 di 29  Alessandra De Bruno La procedura di analisi consiste nell’aggiungere il reagente di colore giallo (Folin) all’estratto diluito e, poiché è preferibile che l’ambiente sia sufficientemente alcalino, viene aggiunta una soluzione satura di carbonato di sodio, affinché si raggiunga un pH di circa 10. Le soluzioni vengono lasciate a temperatura ambiente per un certo periodo di tempo e i fenoli totali vengono determinati colorimetricamente ad una lunghezza d’onda di 725 nm (Pilarski et al., 2006). Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 28 di 29  Alessandra De Bruno Nella procedura di Singleton et al., viene usato come standard con cui esprimere il contenuto totale di fenoli l’acido gallico, per cui si parla di acido gallico equivalenti o GAE(Gallic Acid Equivalents); in particolar modo per le sostanze pure si usa l’unità di misura mmol/L di acido gallico equivalenti e per i campioni reali si adotta l’unità di misura in mg/L di acido gallico equivalenti. Spesso attraverso questo metodo si possono ottenere risultati sovrastimati per il contenuto totale di polifenoli. Metodiche analitiche per la valutazione della capacità antiossidante 29 di 29