Farmacevtska kemija III PDF

FARMACEVTSKA KEMIJA III Radikali, verižne radikalske reakcije, ROS, RNS, RSS, oksidativni stres in antioksidanti Izr. prof. dr. Janez Mravljak, mag. farm. 16. 1. 2025  Literatura, umestitev predavanj Učbenik: S. Pečar in J. Mravljak: Šumi življenja ali radikali in druge reaktivne snovi v t...

FARMACEVTSKA KEMIJA III Radikali, verižne radikalske reakcije, ROS, RNS, RSS, oksidativni stres in antioksidanti Izr. prof. dr. Janez Mravljak, mag. farm. 16. 1. 2025  Literatura, umestitev predavanj Učbenik: S. Pečar in J. Mravljak: Šumi življenja ali radikali in druge reaktivne snovi v telesu; SFD, 2015 http://ecx.images-amazon.com/images/I/51HoQJpFpKL._SX381_BO1,204,203,200_.jpg Učbenik: B. Halliwell, J. Gutteridge: Free radicals in biology and medicine; 4. izdaja, 2007; 5. izdaja 2015 Minerali, vitamini in druge izbrane snovi; SFD, 2020. Vaje: Sinteza askorbilpalmitata, Sinteza mimetika encima superoksid dismutaze, Vrednotenje antioksidativnih lastnosti  ŽIVI ORGANIZMI IN MOLEKULARNI KISIK „Življenje ni nič drugega kot vzbujen elektron, ki išče mesto za počitek.“ Albert Szent-György Reaktivne kisikove zvrsti Elektronska konfiguracija 3O2  Reaktivne kisikove zvrsti Toksičnost O2 – 1. Reagira z [FeS] klastri – encimskimi kofaktorji Iron-sulfur clusters as oxygen-responsive molecular switches | Nature Chemical Biology Senzor O2 ali ROS H+ 2. NO + O2 - → ONOO– ⇌ HOONO → NO2 + HO peroksinitrit Reaktivne kisikove zvrsti (ROS) Radikali: Ne-radikali: O2 - Superoksidni r. H2O2 Vodikov peroksid OH Hidroksilni r. HOCl Hipoklorna kislina ROO Peroksilni r. O3 Ozon RO Alkoksilni r. 1O 2 Singletni kisik HOO Hidroperoksilni r. ONOO- Peroksinitrit  Dušikov oksid NO Sintaza dušikovega oksida (NOS) Elektronska konfiguracija NO Tri izoformne oblike encima NOS: – Endotelijska NOS (eNOS) – Nevralna NOS (nNOS) – Inducibilna ali inflamatorna NOS (iNOS) Gvanilat ciklaza in NO/cGMP-signalna pot sildenafil Topna GC  Učinki NO na kardiovaskularni sistem Levkocit ↓ agregacija Trombocit ↓ adhezija ↓sproščanje mediatorjev ↓ sproščanje citokinov ↓ adhezija endotelij NO ↑ vazodilatacija ↓ proliferacija ↓migracija Žilne gladko mišične celice Alfred Nobel in NO Dinamit Angina pectoris Donorji NO, ki se uporabljajo v terapiji  Reaktivne dušikove zvrsti (RNS) Reakcije NO s kisikom [Hb-Fe2+-O2 Hb-Fe3+-O2 -] + NO → Hb-Fe3+ + NO3- k = 3,7 × 107 M-1s-1 2 NO + O2 → ON-O-O-NO → 2 NO2 dušikov dioksid 2 NO2 ⇌ N2O4 k = 4,5 × 108 M-1s-1 didušikov tetraoksid N2O4 + H2O → NO2- + NO3- + 2H+ k = 1 × 103 M-1s-1 N2O4 ⇌ NO3- + NO+ nitrat in nitrozil kation  Reaktivne dušikove zvrsti (RNS) Reakcije NO in NO2 NO2 + NO → N2O3 didušikov trioksid N2O3 ⇌ NO2- + NO+ nitrit in nitrozil kation N2O3 + H2O ⇌ 2NO2- + 2H+ Nitritni anion se z Hb ali Mb oksidira do nitrata: Hb-Fe2+-O2 + NO2ˉ + H+ → Hb-Fe3+-OOH + NO2 Hb-Fe3+-OOH + NO2ˉ → Hb-Fe4+O + NO2 + HOˉ Hb-Fe4+O + NO2ˉ + 2 H+ → Hb-Fe3+ + NO2 + H2O Hb-Fe2+-O2 + NO2 + H2O → Hb-Fe2+-OOH + NO3ˉ + H+ Reakcija NO in O2 ˉ NO + O2 - → ONOO– k = 1010 M-1s-1 Peroksinitrit –OONO + H+ ⇌ HOONO pKa = 6,8; 8,0 (Z,E) Peroksidušikova(III) kislina HOONO → [ NO2 + HO ] → NO3– + H+ izomerizacija (70%) HOONO → NO2 + HO homolitska cepitev (30%) –OONO + CO2 → ONOOCOO– nitrozoperoksikarbonat ONOOCOO– → O2NOCOO– premestitev O2NOCOO– + H2O → NO3– + HCO2– + H+ 65% ONOOCOO– → NO2 + CO3 - 35%  Reaktivne dušikove zvrsti (RNS) Ne-radikali: Radikali: ONOO- Peroksinitrit ROONO Alkil-peroksinitriti NO Dušikov oksid N2O3 Didušikov trioksid NO2 Dušikov dioksid N2O4 Didušikov tetraoksid HNO2 Dušikova(III) kislina NO2+ Nitronijev kation NO- Nitroksilni anion NO+ Nitrozilni (nitrozonijev) kation  Oksidacijska stanje in nekatere lastnosti preprostih dušikovih spojin ter RNS Ime Formula Oksidacijsko stanje dušika Fizikalne in biološke lastnosti V vodi topen plin, raztopina je šibka baza. Nastaja z bakterijsko redukcijo dušika ob znatnem vložku Amonijak NH3 -3 energije, pri razgradnji sečnine in aminokislin. Domnevno plinska signalna molekula. Hidroksilamin NH2OH -1 Bazična snov, pri človeku nepomemben. Dušik N2 0 Nereaktiven plin, nekatere bakterije ga reducirajo v NH3. Didušikov oksid N2O +1 Plin, uporaben kot anestetik, možna plinasta signalna molekula pri ljudeh. Nitroksilni anion NOˉ +1 Nastane z redukcijo NO, možna vloga v biokemiji celice. Dušikov oksid NO +2 Paramagnetni plin, nastaja iz L-arginina. Zelo pomembna signalna molekula. Nitrozilni kation (nitrozonijev kation) NO+ +3 Nastane z oksidacijo NO. Kation, ki nitrozira tiole in amine. Didušikov trioksid N2O3 +3 Pri nizkih temperaturah modra trdna snov, domnevno udeležen pri S-nitroziranju. Nitrit NO2- +3 Stabilen anion, možen vir NO pri človeku. Dušikov dioksid NO +4 Paramagnetni plin, onesnaževalec zraka, v ravnotežju z N2O4 2 Nitronijev kation NO2+ +5 Reaktivni kation, pogosto del procesov nitriranja. Didušikov pentaoksid N2O5 +5 Nestabilna trdna spojina, formalno je anhidrid dušikove(V) kisline Nitrat NO3- +5 Stabilen anion, končno stanje dušikovega cikla, najdemo ga v zemlji, možen vir NO pri človeku. Reaktivne dušikove zvrsti (RNS) Reaktivne kisikove/dušikove zvrsti in njihova reaktivnost Reaktivna zvrst t1/2 Vodikov peroksid Organski hidroperoksidi ~ minute Hipoklorna kislina Peroksilni radikali ~ sekunde Dušikov oksid Peroksinitrit ~ milisekunde Superoksidni anion Singletni kisik ~ mikrosekunde Alkoksilni radikali Hidroksilni radikal ~ nanosekunde  Tipi radikalskih reakcij 1. ODTEGNITEV vodikovega atoma (hydrogen atom abstraction ali hydrogen atom transfer (HAT)) /R1/ HO + R-H → HO-H + R Hitrostne konstante HO so 108 – 1011 Lmol-1s-1 Energija kovalentne vezi C-H  Tipi radikalskih reakcij 1. b) Prenos (pritegnitev) posameznega elektrona Single electron transfer (SET): R + ArNH2 → R- + ArNH2 + Tipi radikalskih reakcij - primer reakcij s HO 2. ADICIJA radikala na dvojno vez /R2/ HO + CH2=CH-R → HO-CH2- CH-R Hitrostne konstante HO so 108 Lmol-1s-1 Tipi radikalskih reakcij - primer reakcij s HO 3. Reakcija dveh radikalov, dimerizacija, zaključek /termination/ /R3/ HO + R → HO-R 3O 2 + R → OO-R Tipi radikalskih reakcij - primer reakcij s HO 4. Disproporcionacija Dismutacija ali disproporcionacija je redoks reakcija, kjer se izhodna spojina hkrati oksidira in reducira v dva različna produkta. 2 R-CH2-CH2 → R-CH2-CH3 + R-CH=CH2 Tipi radikalskih reakcij - primer reakcij s HO 5. Izomerizacija Neparni e- se znotraj molekule radikala premesti. Nov radikal je stabilnejši glede na prvotnega. R-CH2-CH2 ⇌ R-CH -CH3 delokalizacija elektrona  Endogeni vir ROS Energetski celično dihanje, transport O2 s Hb Reaktivni oksidativni izbruh – del obrambe imunskega sistema Metabolni metabolizem telesu lastnih spojin in ksenobiotikov, z udeležbo O2  Endogeni vir ROS mikrosomalna oksidacija: flavoproteini, CYP NADPH oksidaze mieloperoksidata ksantin oksidaza, (fagociti) NOS citoplazma endoplazmatski lizosomi retikulum Fe2+ oksidaze, prehodne kovine flavoproteini Cu+ peroksisomi mitohondriji membrana elektronski transport lipooksigenaze, prostaglandin sintaze NADPH oksidaze  Endogeni vir ROS – MITOHONDRIJI Nastajanje ROS v dihalni verigi Odstranjevanje ROS z encimskimi sistemi SOD O2 – + O2 – →+ O2 + H2O2 2H CAT 2 H2O2 → O2 + 2 H2O GPx ROOH + 2 GSH → ROH + H2O + GSSG MnSOD GPx katalaza H2O2 H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG Dihalna veriga Electron transport chain ATP synthase in action Fumarat Vsaj 1% e- (~3 mol/dan) pobegne iz dihalne verige. uhajanje elektronov Najpomembnejši vir O2 - in vivo za večino aerobnih celic.  Endogeni vir ROS – PEROKSISOMI ϐ oksidacija v peroksisomih Nastajanje ROS v procesu oksidacije: maščobnih kislin, ksantinov, nekaterih AK Schader & Fahimi, Histochem Cell Biol, 2004  Endogeni vir ROS – PEROKSIDAZE VRSTE PEROKSIDAZ KATALITSKI MEHANIZEM PEROKSIDAZ (hemski proteini) (Mielo)peroksidaze → redoks reakcije → cepitev H2O2 na kisik in vodo, cepitev organskih peroksidov v alkohol in vodo Tvorba HOCl Pretvorba tirozina, drugih fenolov in anilinov v radikale Posredno - kloriranje, nitriranje različnih spojin (npr. AK, lipidov)  Endogeni vir ROS – PEROKSIDAZE Namesto Cl- lahko tudi Br-, I-, ali SCN- Reakcije HClO: R-NH2 + HClO → R-NH-Cl + H2O kloramin R-SH + HClO → R-S-Cl + H2O sulfenilklorid H2O2 + HClO → 1O2 + Cl- + H2O + H+ Cl- + H+ + HClO ⇌ Cl2 + H2O + H+ (v kislem) Endogeni vir ROS – PEROKSIDAZE adukti s proteini/lipidi/DNA  Endogeni vir ROS – NADPH oksidaze (NOX) NADPH O2 NADPH... O2 Oksidativni izbruh ob. - NADP+ aktivaciji imunskega NADP+ O2 O2 - sistema zunaj znotraj Fagocitna vakuola (fagosom) Eksogeni viri ROS Sevanja UV, x-žarki, γ-žarki Spojine, ki tvorijo perokside Ozon, singletni kisik Spojine, ki se metabolizirajo do radikalov Polihalogenirani alkani, fenoli, aminofenoli Spojine, ki so sposobne redoks kroženja Kinoni, nitroaromati, bipirimidinijevi herbicidi Spojine, ki interagirajo z dihalno verigo v mitohondrijih  SPOJINE, KI SE METABOLIZIRAJO DO RADIKALOV Primer: doksorubicin Protirakava učinkovina za zdravljenje: rak dojke, Redoks kroženje rak mehurja, Kaposijev sarkom, limfom akutna limfocitna levkemija KARDIOTOKSIČNOST  SPOJINE, KI SE METABOLIZIRAJO DO RADIKALOV Primer: primakin → aminofenoli, hidroksilamini Redoks kroženje  REDOKS AKTIVNE KOVINE in ROS Nastajanje ROS v prisotnosti redoks aktivnih kovin Fe2+, Fe3+; Cu+, Cu2+ Haber-Weissova reakcija: Seštevek obeh reakcij: Fe3+ + O2 − ⇌ Fe2+ + O2 H2O2 + O2 − → O2 + OH + HO− Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO + HO− FENTON-ova reakcija Vloga antioksidantov pri nastajanju ROS z redoks kovinami 2 Fe3+ + askorbat → 2 Fe2+ + dehidroaskorbat Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO + HO−  REDOKS AKTIVNE KOVINE in ROS Bleomicin - koordinativna vezava kovinskih ionov kovinski ion vezavna domena Fe, Cu, Mn DNA vezavna domena  OKSIDATIVNI STRES Fiziološko ravnovesje zagotovi dovolj reaktivnih zvrsti za redoks signaliziranje. Oksidativni stres je motnja v ravnovesju med prooksidanti in antioksidanti v korist prvih, kar vodi v možne (oksidativne) poškodbe.  OKSIDATIVNI STRES »Oxidative stress is an imbalance between oxidants and antioxidants in favour of the oxidants, leading to a disruption of redox signalling and control and/or molecular damage« (often called oxidative damage) (H. Sies, 1985) Helmut Sies Oksidativni stres: "Redox Pioneer" ↓ antioksidativna obramba in/ali ↑ tvorba RS VZROKI za OKSIDATIVNI STRES mutacije ali zmanjšanje prisotnosti encimov (SOD, glutation peroksidaza) zmanjšan/moten vnos antioksidantov v telo s hrano povečan vnos železovih in nekaterih drugih kovinskih ionov ekstremne fizične obremenitve netreniranega organizma stres radioaktivno sevanje, toksini in reaktivni ksenobiotiki aktivacija imunskega sistema pri kroničnih vnetnih procesih OKSIDATIVNI STRES Distres znaten in dolgotrajen oksidativni stres Eustres v zgodnjem obdobju ne kaže simptomov, nima blag in kratkotrajen oksidativni stres tipične klinične slike, ki bi opozorila na njegovo poveča učinkovitost obrambnih in popravljalnih prisotnost v organizmu mehanizmov vodi v smrt ali senescenco celice preko redoks signaliziranja zviša raven izražanja pusti dolgotrajne posledice, pospeši staranje encimov antioksidantov in encimov za popravilo DNA je vzrok ali spremljevalec številnih kroničnih bolezni → porast koncentracije endogenih antioksidantov → Treba je odpraviti vzroke za oksidativni stres (npr. kronično vnetje). „Kar te ne ubije, te okrepi!”  Antioksidativni (reduktivni) stres prekomeren vnos antioksidantov s prehranskimi dopolnili Preden svetujemo jemanje dodatnih antioksidantov, je treba izmeriti stopnjo oksidativnega stresa (ali vsaj ugotoviti pomanjkanje antioksidanta)! Oksidativni stres in redoks signaliziranje EUSTRES DISTRES Sies, H. Oxidative Stress: Eustress and Distress in Redox Homeostasis. Hbk Stress Ser 2019, 3, 153-163. DOI: 10.1016/B978-0-12-813146-6.00013-8  OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC ROS, RNS OKSIDATIVNI STRES aktivacija kemokinov oksidativne poškodbe oksidativne poškodbe oksidativne poškodbe DNA proteinov lipidov apoptoza nekroza OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA Oksidacija baz in sladkorjev Oksidacija jedrne in mitohondrijske DNA OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA 3O 2 1‘ peroksilni radikal OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA a – odcep nukleinske baze b – pretrganje verige c – vezava proteina na DNA OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA ali OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA Nizke koncentracije 3O2! OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA Nizke koncentracije 3O2! OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA kaliheamicin bi π radikal OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA ADP-riboza POSLEDICE OKSIDACIJE DNA DNA adukti/abazična(AP) mesta/cepitev verige Mutacije Iniciacija rakave pretvorbe Poli-ADP-riboza polimeraza (PARP) Encim, ki sodeluje pri popravilu Stimulacija popravljanja DNA poškodovane DNA: se veže na poškodovano DNA in prenaša ADP- Neuravnotežena indukcija DNA popravljalnih encimov ribozo na jedrne proteine → ADP-riboziliranje proteinov pospeši Zmanjšanje energetskih rezerv (aktivacija PARP) popravilo DNA Za popravilo DNA troši energetsko bogate molekule ATP in NAD+ Aktivacija drugih signalnih poti v celici (npr. p53) Obsežne poškodbe vodijo v porabo zalog ATP → “samomorilski odgovor celice” OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA Mutacije: 8-OH G lahko povzroči GC → TA transverzijo:  OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija DNA DNA v celici tarča oksidativnih procesov (1,5 × 105/celico; 1019/ posameznika) Oksidiran gvanozin (8-hidroksi-gvanin) v urinu je merilo oksidativnih poškodb. Jedrna DNA: 1/130.000, mitohondrijska DNA: 1/8.000 gvaninskih preostankov OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov Mesta oksidativnih okvar proteinov What is a Protein? How Enzymes Work OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov Eliminacija! OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov – cistein OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov - cistein Reaktivne žveplove zvrsti (RSS) OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov – metionin MSR Metionin sulfoksid reduktaze (MSR) regenerirajo metionin (R- in S- stereospecifične) s pomočjo tioredoksina in tioredoksin reduktaz. OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov - tirozin Oksidirajo se predvsem naslednji AK preostanki v proteinih: cistein, metionin, histidin, triptofan, tirozin, fenilalanin OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov – Hys, Trp, Phe fenilalanin  OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija proteinov Posledice oksidacije: Sprememba konformacije proteinov Premreženje (disulfidni mostički!) Porabljanje glutationa Zmanjšana aktivnost regulatornih proteinov Motena vloga strukturnih proteinov Povečana možnost proteolize Imunogenost OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov Lipidni aldehidi OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov - izoprostani Pomembni označevalci/markerji lipidne peroksidacije Nastanejo iz maščobnih kislin z vsaj 3 = vezmi (linolenska k., AA → F2, EPA → F3, DHA → F4). Večinoma še vedno pripeti na fosfolipid z estrsko vezjo, lipaze jih sproščajo, t½= 20 min Se metabolizirajo in izločajo z urinom Povečana tvorba pri mnogih boleznih Nekateri izoprostani lahko izkazujejo biološke učinke podobne PAF,... Učinki kot pri signalnih molekulah (eikozanoidih), niso vedno slabi. OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov - izoprostani Vezava na proteine  OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov - izoprostani PLESNIČAR, Tjaša, MRAVLJAK, Janez. Izoprostani in nevroprostani kot biološki označevalci oksidativnega. Farmacevtski vestnik. 2019, letn. 70, št. 3, str. 205-211 PLESNIČAR, Tjaša, MRAVLJAK, Janez. Izoprostani in nevroprostani kot biološki označevalci oksidativnega. Farmacevtski vestnik. 2019, letn. 70, št. 3, str. 205-211 OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija holesterola OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija holesterola Oksisteroli OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov Strukturne spremembe v membranah Sprememba fluidnosti in aktivnosti kanalčkov Sprememba v membrani vezanih signalnih proteinov (receptorji) Povečana permeabilnost za ione Produkti lipidne oksidacije tvorijo adukte Proteini in DNA Direktna toksičnost produktov lipidne peroksidacije Preprečeno je signaliziranje, ki je membransko odvisno. DNA poškodba → mutageneza/genotoksičnost OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov  Di-deuteriran etilni ester linolne kisline kinetični izotopni efekt! Čeprav je devterirana spojina enaka naravni linolni kislini, je bolj odporna na lipidno peroksidacijo, zato ščiti celico. Leta 2017 je FDA odobrila RT001 kot zdravilo siroto za zdravljenje nevrodegeneracije, povezane s fosfolipazo 2G6 (PLAN). Leta 2020 je FDA odobrila RT001 kot zdravilo siroto za zdravljenje bolnikov s progresivno supranuklearno paralizo (PSP). https://en.wikipedia.org/wiki/Di-deuterated_linoleic_acid_ethyl_ester Diskusija Kako bi opisali predstavljeno zdravilno učinkovino? Kakšno strukturo (molekulo) predstavlja „zelena vžigalica“ v biološki membrani? etilni ester linolne kisline (učinkovina) fosfolipid z linolno kislino fosfolipidi z linolno in daljšimi ω-6 maščobnimi kislinami nič od navedenega Antioksidanti - definicija Antioksidant je vsaka snov, ki upočasni, prepreči ali odstrani oksidativno poškodbo tarčne molekule. (Halliwell, Gutteridge) Antioksidanti v tehnologiji: Inhibitorji oksidacije Pomožne snovi v farmacevtski tehnologiji Hierarhija antioksidantov Razdelitev antioksidantov glede na : ❑FI/KE lastnosti: ❑zmožnost regeneracije ❑lipofilni, ❑obnovljivi ❑hidrofilni ❑neobnovljivi ❑Izvor: ❑ mehanizem delovanja: ❑endogeni, ❑ neposredni: prekine verižno reakcijo ❑eksogeni (reducenti), encimi ❑ posredni: kelatorji kovinskih ionov  Mehanizem antioksidativnega delovanja 1. Reducenti: donorji of H ali e- 2. „Mehki“ nukleofili: Glutation (GSH) 3. Kelatorji kovinskih ionov (Fe or Cu): Fitinska kislina Antioksidativna mreža Antioksidativni obrambni sistem Encimi - antioksidanti Superoksid dismutaza (SOD), SOD mimetiki Katalaza (CAT) Glutation peroksidaza (GPx) Glutation S-transferaza Glutation reduktaza Endogeni neencimski antioksidanti Glutation (GSH) Superoksid dismutaza Funkcija: odstranjuje O2 - 2 O2 - + 2 H+ → H2O2 + O2 k ~ 2-4 ×109 M-1s-1 Edini poznani encim, ki reagira s O2 -, kinetično eden najhitrejših encimov v naravi – hitrost dismutacije je omejena le z difuzijo. Več izoencimov SOD: v aktivnem mestu lahko imajo Cu-Zn, Mn, Fe ali Ni (prokarionti) Toksičnost O2 - ?  Mehanizem delovanja SOD SOD-katalizirano dismutacijo superoksidnega radikala lahko zapišemo s sledečima polovičnima reakcijama: M(n+1)+-SOD + O2 - → Mn+-SOD + O2 kred Mn+-SOD + O2 - + 2 H+ → M(n+1)+-SOD + H2O2 kox Kjer je M = Cu (n=1) ; Mn (n=2) ; Fe (n=2) ; Ni (n=2). V tej reakciji oksidacijsko število kovinskega kationa oscilira med n in n+1. Aktivno mesto encima lahko naenkrat sprejme eno molekulo O2 -, zato je produkt encimske redoks reakcije odvisen od oksidacijskega stanja kovinskega iona “ping-pong” mehanizem  Lokacija izoencimov SOD v celici CuZn-SOD (SOD1) Citoplazma, jedro, lizosomi Mn-SOD (SOD2) Matriks mitohondrijev EC-SOD [CuZn] (SOD3) Ekstracelularno, celična membrana EC Mn-SOD Ekstracelularno, celična membrana Fe-SOD, Ni-SOD – samo pri prokariontih  http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fc/Arctica_islandica_valves.jpg/220px-Arctica_islandica_valves.jpg Aktivnost izoencimov SOD So tkivno specifični. Največja encimska aktivnost SOD1 je v jetrih, kjer je visoka obremenitev s O2 - zaradi intenzivnega metabolizma. Ekstracelularna aktivnost SOD je največja v pljučih, kar kaže na njeno fiziološko vlogo v medceličnih prostorih pljuč pri preprečevanju pljučnih obolenj Aktivnost SOD se z leti zmanjšuje (naglo po koncu rodne dobe) STARANJE IZJEMA: školjka vrste Arctica islandica doseže v naravi starost 400 let! Aktivnost SOD ostane na visokem nivoju celo življenje. Katalitični antioksidanti Širša opredelitev, vključuje tudi mimetike SOD Mimetiki SOD selektivno oponašajo delovanje SOD (nimajo katalazne aktivnosti) → selektivni SOD mimetiki „Umetni encimi“, so nadomestek nativnega encima: encimomimetiki (ang. synzymes - sintezni encimi). Prve potencialne učinkovine so v fazah kliničnega testiranja na ljudeh. Makrociklični mimetiki SOD Mehanizem delovanja Manganovi(II) pentaaza-makrociklični SOD-mimetiki: Mn(II)-L(H2O)2+ + O2 - + 2 H+ → Mn(III)-L(H2O)3+ + H2O2 kox Mn(III)-L(H2O)3+ + O2 - → Mn(II)-L(H2O)2+ + O2 kred Obraten mehanizem kot pri SOD! Saleni Saleni so substituirani aromatski N,N–bis(saliciliden)etilendiaminski kovinski kompleksi z Mn3+. Metaloporfirini Mezo-substiturirani protoporfirini z manganovim Mn3+ ali železovim Fe3+ ionom v sredini porfirinskega obroča, ki ga koordinirajo štirje aksialni dušikovi atomi. Zakaj prevladujejo Mn kompleksi?  Nitroksidi – SOD mimetiki Nitroksidi oz. hidroksilamini (reducirana oblika) vstopajo v eno-elektronske redoks reakcije s O2 - in pospešijo dismutacijo. V kliničnem preizkušanju so TEMPO, TEMPOL, TEMPON Npr. za preprečevanje poškodb po ishemiji/reperfuziji.  Katalaza (CAT) Funkcija: odstranjuje H2O2 2 H2O2 → 2 H2O + O2 k ~ 2 ×107 M-1s-1 Encim sestavljen iz 4 podenot, ki imajo Fe3+-hem v aktivnih mestih. Nahaja se intracelularno predvsem v peroksisomih, manj v mitohondrijih  Mehanizem delovanja katalaze Ko H2O2 vstopi v aktivno mesto, interagira z asparaginom in histidinom, ki vežeta proton. Prost kisikov atom se koordinativno veže na Fe atom, sprosti pa se nastala voda. Fe(IV)=O reagira z drugo molekulo H2O2 nazaj do Fe(III) in tvori vodo in kisik. Mehanizem delovanja ni v celoti pojasnjen; reakcija poteče v dveh delih: H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E( +) H2O2 + O=Fe(IV)-E( +) → H2O + Fe(III)-E + O2 Fe(IV)-E( +) je mezomerna oblika Fe(V)-E, kar pomeni da železo ni popolnoma oksidirano do 5+; “manjkajoči elektron" prejme od hemskega liganda. Ta hem mora biti zato označen kot radikal kation ( +).  Glutation (GSH) GSH γ-L-Glu-L-Cys-Gly ~ 5 mM v celici GSSG GSH je reducent, ki lahko neposredno reagira z radikali ali pa vstopa v encimsko katalizirane redukcije. Je tudi nukleofil, ki reagira z reaktivnimi elektofili in kelator kovinski ionov.  Glutation S-transferaza RX + GSH → R-SG + HX Razstrupljanje (detoksifikacija) elektrofilnih ksenobiotikov: katalizirajo reakcijo med nukleofilno –SH skupino GSH in elektrofilnimi skupinami ksenobiotikov; tako preprečijo morebitno kovalentno reakcijo ksenobiotika s ključnimi celičnimi proteini in nukleinskimi kislinami.  Glutation peroksidaze (GPx) Funkcija: odstranjuje H2O2 in ROOH Varujejo pred lipidno peroksidacijo. V aktivnem mestu encima je AK selenocistein, za normalno delovanje encima je potrebna zadostna preskrbljenost organizma s selenom (priporočen dnevni vnos = 50 μg/dan) Družina več izoencimov: GPx1 – Gpx8 pri človeku Mehanizem delovanja GPx Reakcija odstranjevanja peroksidov poteka na selenocisteinu, ki je v R-Se‾ obliki v stanju mirovanja. Ta se oksidira do selenenske kisline (R-SeOH) ki nato reagira z molekulo GSH tako, da tvori R-Se-SG in vodo. Nato se s še eno molekulo GSH pretvori nazaj do R-SeH. Kot stranski produkt se sprosti GS- SG. R-SeH + H2O2 → R-SeOH + H2O selenenska kislina R-SeOH + GSH → R-Se-SG + H2O GS-Se-R + GSH → GS-SG + R-SeH  Glutation reduktaza GS-SG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+ Razmerje GSH/GS-SG je v celicah > 100/1. potrebna je energija v obliki NADPH Motnja v oskrbi celice z NADPH se tako odrazi tudi v povečanem oksidativnem stresu. Nizkomolekularni antioksidanti Spojine endogenega izvora Bilirubin, Koencim Q, Lipojska kislina, Sečna kislina, Melatonin Ženski spolni hormoni Spojine pridobljene s hrano Askorbinska kislina (vitamin C), Tokoferoli (vitamin E) Karotenoidi Polifenoli rastlinskega izvora  Bilirubin Metabolit hema (→ biliverdin): 80% iz hemoglobina – rumene barve ~270 mg/dan Se veže na albumin, ki ga transportira v jetra, varuje albumin pred ROS, RNS In vitro odstranjuje ROO , RO , ONOOH in 1O2. Lahko tvori 1O2 ob obsevanju s svetlobo. Koencim Q10 Nastopa v dihalni verigi v mitohondrijih In vitro lahko ubikinol (CoQH2) odstranjuje ROO in inhibira lipidno peroksidacijo. Lahko regenerira tokoferilni radikal: α-Toc + CoQH2 → CoQH + α-TocH In vivo zlasti pomemben v mitohondrijih Razmerje ubikinol/ubikinon v plazmi je lahko pokazatelj OS.  Lipojska kislina Močan reducent, ki lahko reducira GSSG, dehidroaskorbat in αToc ter številne RS: ROO , HOCl, CO3 -, NO2 , OH , ONOOH. Relativno nizke koncentracije v tkivih (12,3-43,1 ng/mL) Vezana kot lipoamid (lipoil-lizinska ročica) je esencialna komponenta nekaterih encimskih kompleksov (npr. v piruvat dehidrogenazi)  Sečna kislina pKa = 5,4 V plazmi dosega visoke koncentracije (0,2-0,4 mM), ker je pri ljudeh (in primatih) okvarjen gen za urat oksidazo. Je močan antioksidant: E0’ = +590 mV (urat/urat radikal) Učinkovito odstranjuje O3 in NO2 , ONOO- Kelira kovinske ione Fe in Cu Uratni radikal lahko izkazuje prooksidativne lastnosti – reducirajo ga številni flavonoidi (k = 106 M-1s-1) in O2 - (k = 8 ×108 M-1s-1).  Melatonin Nastaja v češariki iz serotonina, ureja cirkadiani ritem in vivo < 1 nM Ima antioksidativne učinke, lahko donira H Bolj kot neposreden antioksidant je pomemben, ker vpliva na povišan nivo eksperesije encimov-antioksidantov in zavira sintezo citokinov ter izražanje iNOS. Askorbinska kislina – vitamin C malo reaktiven pKa1 = 4,1; pKa2 = 11,6 V plazni: 30 – 90 μM Povprečna potreba (odrasli): m: 90; ž: 80 mg/dan Dopustna zgornja meja vnosa: 2000 mg/dan Esencialni vit.: mutacija gena za encim gulonolakton oksidazo Kofaktor vsaj 8 encimov: pri sintezi kolagena, pri sintezi NA iz dopamina, pri sintezi karnitina, pri metabolizmu tirozina Posredno je lahko prooksidant saj reducira Fe3+ v Fe2+ Redukcijske lastnosti askorbinske kisline pKa1r = 4,1; pKa2r = 11,6 Redoks potencial HA¯/HA = 0,72 V A2-/A ¯ = 0,015 V (pri pH 13,5) pKa2o = -0,45 A ¯/DHA = 0,22 V pKa3o = 8 Disproporcionacija A − 2 semidehidro-L-askorbat + H+ ⇌ L-askorbat + dehidro-L-askorbinska kislina Derivati askorbinske kisline  Vitamin E – tokoferoli in tokotrienoli Inhibitor lipidne peroksidacije – prekine verižno radikalsko reakcijo Lipidotopen antioksidant (v mitohondrijih je na 2100 lipidov 1 αToc) Ustrezen vnos za populacijo (odrasli): m: 13, ž: 11 mg/dan Absorbira se ga 25 - 50%, s hilomikroni (pri ↑ vnosih je ↓ absorpcija) Prooksidativni učinki ob kopičenju αToc : αToc + L-H → L + αToc-H - lahko sproži lipidno peroksidacijo αToc lahko reducira ione kovin Fe3+ in Cu2+ do Fe2+ in Cu+ OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov – vloga vitaminov E in C OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov – vloga vitaminov E in C OKSIDATIVNI STRES IN POŠKODBE CELIC – oksidacija lipidov – vloga vitaminov E in C  Derivati tokoferola Estri se uporabljajo v pripravkih (kozmetika, prehranski izdelki) namesto vitaminom E, ker so bolj stabilni za skladiščenje. Kateri derivati izkazujejo reduktivne lastnosti in vitro? Kateri derivati so antioksidanti in vivo? Karotenoidi Barvila rastlinskega izvora (preko 700) V telesu jih najdemo v adipoznem tkivu (80 %), jetrih (10 %), v corpus luteum in testisih. V plazmi: Likopen ~0,5-1,0 μM β-karoten ~0.2-0.6 μM Lutein ~0.3 μM Absorpcija je nepopolna in odvisna od vrste hrane.  Karotenoidi Nekateri so prekurzorji vitamina A Pomemben za rast in diferenciacijo celic Za vid Odstranjujejo 1O2 Kako reagirajo z radikali? ROO lahko reagira s Car na 3 načine: NO2 + Car → Car + + NO2- 1. Prenos elektrona (SET): 2 Car + → Car + Car2+ H+ + ROO + Car → Car + + R-O-OH Car + + Asc → Car + Asc + H+ 2. Odtegnitev H (HAT): Pri visokih koncentracijah O2 lahko izkazujejo Car + ROO → Car + ROOH prooksidativne učinke: Car + 3O2 → CarO2 3. Adicija radikala na dvojno vez: CarO lahko 2 sproži lipidno peroksidacijo. Car + ROO → [Car-OOR]  Prooksidativni učinki karotenoidov izomerizacija tripletni radikal Antioksidativna aktivnost β-karotena kot funkcija koncentracije O2. Samosprožilni mehanizem avtooksidacije β-karotena in sprožitev lipidne peroksidacije (Poli)fenoli rastlinskega izvora Fenolne –OH skupine so donorji H , fenolati pa e-. Nastali fenolatni radikal je bolj stabilen. V hrani: ~20 do 100 mg/dan  Flavonoidi Dobri antioksidanti in vitro, ustavijo lipidno peroksidacijo Kelatorji kovinskih ionov Lahko znižajo zaloge GSH v celicah in vitro Biološka uporabnost PP polifenoli v hrani mikro flora PP v tankem PP v debelem fenolne kisline črevesju črevesju aglikoni PP → PP-konjugati v plazmi < 1μM Hiter metabolizem in izločanje PP Hitro izločanje Nastanek številnih metabolitov Ali so PP antioksidanti in vivo? srčno žilne bolezni rakava obolenja ? ❑ epidemiologija ❑ eksperimentalno – celične kulture ❑ eksperimentalno – živalski modeli ❑ klinične študije Napotki za uporabo prehranskih dopolnil z antioksidanti I. Da bi nadzorovali OS, ni dobro uporabljati en sam antioksidant v visokih odmerkih, ker je možna prevlada pro-oksidativnega učinka nad antioksidativnim. Bolje je uporabiti (naravno) kombinacijo antioksidantov. Vsak posamezni antioksidant v kombinaciji naj se da v odmerkih blizu priporočenega dnevnega odmerka ali, če ta ni določen, v odmerkih, ki se običajno zaužijejo s hrano. Napotki II. Treba je določiti oksidativni stres v telesnih tekočinah, da se izognemo aplikaciji antioksidantov, ko ti niso potrebni. Povečano uživanje sadja in zelenjave ali zmerno uživanje živil bogatih z antioksidanti (kot npr. olivno olje, čaj, vino in kava v zmernih količinah, temna čokolada,...) naj sledi oziroma nadomešča jemanje prehranskih dopolnil. Antioksidanti lahko skrajšajo življenjsko dobo Raziskovalci so leta 2007 pregledali 68 (znanstveno rigoroznih) kliničnih raziskav o uporabi prehranskih dopolnil z antioksidanti. Rezultati 47 relevantnih raziskav so pokazali 5% porast smrtnosti. V nadaljnjih analizah so to povezali z visokimi odmerki beta- karotena, vit. A in vit. E. Scientific American, Feb. 2013 JAMA 2007;297(8):842-857. Prehranska paradigma http://images0.zurnal24.si/slika-_original-1396246629-1033754.jpg tveganje za neželene učinke AR ustrezen vnos za populacijo (AI) LTI PRI UL vnos hranila LTI – spodnji mejni vnos AR – povprečna potreba PRI – populacijska referenčna vrednost UL – dopustna zgornja meja vnosa