Capacità antiossidante: chimica analitica

Obiettivi della Valutazione della Capacità Antiossidante

• L'attività antiossidante è uno degli obiettivi principali.
• I saggi di valutazione delle capacità antiossidanti sono fondamentali.
• Metodi HAT, SET e FOLIN sono tra i saggi utilizzati.

Chimica Analitica e Capacità Antiossidante

• Studi hanno evidenziato l'importanza dei composti antiossidanti per contrastare lo stress ossidativo e proteggere la salute umana.
• Standardizzare la quantificazione della capacità antiossidante di diverse sostanze è necessario.
• La chimica analitica sviluppa metodi standardizzati per valutare e misurare la capacità antiossidante (AOC) in campioni alimentari e clinico-biologici.

Attività Antiossidante

• L'attività antiossidante si riferisce alla costante cinetica di un singolo composto antiossidante verso un radicale libero specifico.
• Questo significa la capacità di una molecola antiossidante di bloccare e contrastare diversi meccanismi radicalici.
• Confrontare prodotti commerciali, alimentari e controllare lo stato di salute dei pazienti, ha portato a metodi standard per valutare l'AOC.

Metodologia Standard

• Le misurazioni chimiche devono essere applicabili a campioni reali.
• Le reazioni devono avvenire preferibilmente nei sistemi viventi per la generazione di specie radicaliche.
• La metodologia deve essere semplice, rapida e facilmente applicabile per analisi di routine e controllo qualità.
• Richiede strumentazione analitica facilmente reperibile, poco costosa e di facile impiego.
• Deve avvenire secondo un preciso meccanismo chimico di reazione, essere riproducibile e robusto.
• Deve essere adattabile a antiossidanti idrofilici e lipofilici.

Antiossidanti negli Alimenti

• L'attività antiossidante di un alimento dipende da diversi componenti che agiscono in sinergia, non in modo additivo.
• Misurare la concentrazione di un singolo componente o di diversi non è indicativo della capacità antiossidante totale.
• Si misurano in vitro la capacità antiossidante totale.
• I risultati in vitro valutano situazioni diverse e non sono comparabili tra metodi diversi.
• I risultati di test per lo stesso alimento possono variare.
• Nessuno può rappresentare l'attività antiossidante totale dell'alimento.
• La somma dei risultati in ambienti lipofili e idrofili non fornisce il quadro completo a causa della mancanza di considerazione dei sinergismi.
• Bisogna dimostrare che l'efficacia in vitro corrisponda all'efficacia antiossidante in un sistema biologico.
• Data la complessità, non esiste un metodo assoluto per l'AOC; sono tutti metodi relativi.
• L'efficacia in vivo è la capacità di prevenire o limitare il danno ossidativo in un sistema biologico.
• Per determinare l'efficacia antiossidante di un alimento, è fondamentale eseguire misurazioni su sistemi biologici.

Caratteristiche dei Metodi

• Ogni metodo presenta un substrato con caratteristiche chimico-fisiche specifiche, che subisce attacchi radicalici.
• Utilizza un agente ossidante o iniziatore di radicali.
• Impiega una molecola antiossidante o un campione per testare l'AOC.
• Un sistema strumentale monitora nel tempo le proprietà della soluzione che variano con lo sviluppo.
• Viene valutata la produzione di radicali.

Modalità di Espressione dell'AOC e Risultati

• Tempo di induzione o "lag phase" (minuti, secondi).
• Tempo per raggiungere un livello specifico di ossidazione/degradazione (minuti, secondi).
• Velocità di ossidazione/degradazione (mol/(litri*secondi)).
• Concentrazione per un effetto antiossidante equivalente a una molecola standard (mequivalenti, mol/l).
• Concentrazione di gruppi funzionali dopo un tempo fisso (mequivalenti, mol/l).
• Concentrazione del prodotto ossidante dopo un tempo fisso (mequivalenti, mol/l).
• Variazione di proprietà della soluzione dopo un tempo fisso (assorbanza, conducibilità, emissione fluorescente, differenza di potenziale).

Saggi di Valutazione

• Si utilizzano diversi test per valutare il potenziale antiossidante.
• Molti di questi richiedono misurazioni spettrofotometriche per quantificare particolari composti.
• Si misurano i prodotti in un certo tempo di reazione per ottenere risultati riproducibili.
• Esempi di saggi includono ABTS, DPPH, FRAP e ORAC.

Saggi HAT

• Si basano sulla reazione competitiva per il radicale perossidico tra una sostanza antiossidante e un substrato.
• ORAC e TRAP usano un radicale iniziatore per generare un radicale perossile.

Metodo ORAC

• Serve per determinare l'attività antiossidante totale di sostanze naturali.

• Il saggio ORAC valuta la perdita di fluorescenza causata da radicali idrossilici e perossidici.

• Perossidici, come il 2,2'-azobis (2-amidinopropano) diidrocloruro (AAPH) a 37°C.

• Gli antiossidanti nel campione bloccano e inibiscono l'azione del radicale libero.

• Quando gli antiossidanti non bloccano i radicali alchil perossidici, questi attaccano la fluoresceina.

• Causa un brusco calo dell'intensità di emissione.

• Il parametro monitorato è la perdita di fluorescenza, misurata con uno spettrofluorimetro.

• L'aumento della concentrazione di antiossidante prolunga la "lag phase" (tempo di protezione) prima che i radicali ROO· attacchino la fluoresceina.

• diminuisce così l'intensità luminosa.

• Il valore dell'effetto protettivo è dato dall'area sotto la curva di decadimento dell'intensità emissiva, sottratta del bianco.

• I valori ORAC si esprimono in micromoli di Trolox equivalenti (TE) per litro o grammo di campione.

• Trolox è uno standard di riferimento idrosolubile.

• Il metodo ORAC è stato ampiamente applicato e adattato per la quantificazione dell'AOC, venendo riportato anche sull'etichetta di diversi prodotti alimentari

• Secondo le stime con questo metodo, ogni individuo per contrastare gli effetti deleteri dei ROS dovrebbe raggiungrere quotidianamente un valore di unità ORAC circa 5000

• Per questo motivo, medici e nutrizionisti consigliano di consumare 5 pasti al giorno di frutta e verdura.

Metodo TRAP

• È un sistema, come l'ORAC, per determinare la capacità antiossidante di campioni come siero, prodotti alimentari e farmaceutici.
• È basato sulla fluorescenza e misura la perossidazione indotta dal 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH).
• Questo azocomposto solubile in acqua si decompone termicamente, formando radicali perossidici acquosi.
• Si evidenzia la riduzione di fluorescenza della proteina marker R-ficoeritrina (R-PE).
• Il tempo di decadimento della fluorescenza è proporzionale alla quantità e attività degli antiossidanti.

SAGGI SET

• Sono reazioni caratterizzate dal trasferimento elettronico.
• I metodi si basano capacità di una sostanza di ridurre una specie test.
• FRAP e TEAC sono degli esempi.
• Gli antiossidanti vengono ossidati da agenti ossidanti, come Fe (III) o ABTS+.
• Un elettrone viene trasferito dalla molecola antiossidante all'ossidante.
• Le variazioni di assorbanza vengono misurate con uno spettrometro UV-visibile ed è usata come misura quantitativa della capacità riducente.

Metodo ABTS-TEAC

• Serve a determinare il potere antiossidante nelle matrici biologiche, tramite reazione con un radicale catione.
• Il radicale catione colorato stabile (R+) viene generato ossidando il sale di diammonio con ABTS tramite una soluzione di persolfato di potassio (K2S2O8).
• Gli antiossidanti (AOH) trasferiscono un atomo di idrogeno per causare una decolorazione della soluzione.
• Si analizza all'UV-Vis la diminuzione del picco a 734 nm del radicale catione dopo un tempo di incubazione.
• La diminuzione della decolorazione è proporzionale alla carica antiossidante nel campione.
• Si calcola la percentuale di inibizione per determinare la capacità antiossidante.
• L'ABTS è solubile sia in acqua che in solventi organici.
• La metodica può individuare l'AOC sia per composti idrofilici che lipofilici.

Metodo DPPH

• Serve a determinare il potere antiossidante facendo reagire il campione con DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazile) in soluzione metanolica.
• I composti antiossidanti trasferiscono idrogeno al radicale e causano la decolorazione della soluzione.
• Si valuta all'UV-Vis la diminuzione del picco a 515 nm del radicale DPPH dopo incubazione.
• La reazione avviene a temperatura ambiente per evitare degradazione termica.
• La diminuzione della decolorazione è proporzionale alla carica antiossidante nel campione.
• La concentrazione finale si esprime come % di inibizione del radicale DPPH.

Metodo FRAP

• Il metodo FRAP, come il TEAC, determina la capacità antiossidante di fluidi biologici, basandosi sul trasferimento di un singolo eletronico
• Il protocollo è stato effettuato per la prima volta da Benzie e Strain (1996)
• Il test misura la riduzione della 2,4,6-tripiridil-s-triazina ferrica (TPTZ) per formare un prodotto colorato indaco
• Il grado di idrossilazione e l'estensione della combinazione dei polifenoli è collegata al potere riducente
• Il FRAP non rivela composti che agiscono per trasferimento di idrogeno
• Il grado di estensione della riduzione viene riflesso dall'assorbanza della soluzione a 592nm
• Il potere riducente viene comparato con il trolox, un analogo idrofilico della vitamina E

Metodo Folin-Ciocalteu

• Il metodo si basa sull'ossidazione chimica dei composti fenolici.
• Utilizza il reattivo di Folin, composto da acido fosfotungstico e fosfomolibdico che, riducendosi, formano ossidi di colore blu.
• L'intensità della colorazione è proporzionale ai residui fenolici.
• La procedura prevede l'aggiunta del reattivo giallo (Folin) all'estratto diluito. Poiché l'ambiente deve essere alcalino, si aggiunge carbonato di sodio per un pH di circa 10.
• Le soluzioni rimangono a temperatura ambiente, e i fenoli totali vengono determinati colorimetricamente a 725 nm.
• Come standard si usa l'acido gallico, e si parla di acido gallico equivalenti (GAE).
• Per le sostanze pure si usa mmol/L, per i campioni reali mg/L.
• Questo metodo puo' sovrastimare leggermente il conteuto totale di polifenoli

Esplora il ruolo della chimica analitica nello studio della capacità antiossidante, definendo il termine 'attività antiossidante'. Scopri l'importanza crescente dei composti antiossidanti e le metodologie analitiche per valutare campioni reali. Esamina i requisiti essenziali per una metodica standard di determinazione dell'AOC.