Upstream Biotechnológia PDF

Biotechnológia Upstream / downstream folyamatok  Upstream – Downstream folyamatok Szubsztrát Biomassza elkészítése elválasztása Upstream Fermentlé Termék elkészítés...

Biotechnológia Upstream / downstream folyamatok  Upstream – Downstream folyamatok Szubsztrát Biomassza elkészítése elválasztása Upstream Fermentlé Termék elkészítés elválasztása Sterilezés Termék tisztítása Downstream Fermentáció : aerob, Termék anaerob kiszerelés  Upstream = termékek előállítása Anyagcsere C+N+O+energia biomassza+CO2+H2O Anabolizmus, Katabolizmus Autotróf, Heterotróf Litotróf, Organotróf Fototróf, Kemotróf Mikrobák növekedési rátája  Mikrobák növesztésének általános feltételei Hőmérséklet – Követelmény: folyékony halmazállapotú, szabad víz legyen – ±15 ºC pH – Tűréshatár általában ±2, sejtek növekedése közben változik  Mikrobák növesztésének általános feltételei Prokarióták – Szénforrás – Monod kinetika µ = µmax x S / (ks + S) µ: specifikus növekedési sebesség (biomassza/idő) – Nitrogén forrás Lehet szervetlen, szerves – Oxigén forrás Aerob – O2 – Szuperoxid, H2O2, – Oxigénnek rossz az oldékonysága vízben Anaerob életmód: NO3-, SO42—légzés  Mikrobák növesztésének általános feltételei ATP - energia Aerob – 36-38 ATP/glükóz Anaerob – 1-3 ATP/glükóz  Mikrobák növesztése Nitrogén források: – aminonsavak – peptidek, fehérjék – ammóna – N2 Szénforrások: – glükóz – dextrin – lassabban hasznosul – szacharóz – glükóz + fruktóz – laktóz – galaktóz + glükóz – xilóz, mannitol, szorbitol – növényi olajok – szerves savak – szén-dioxid  Mikrobák növesztése: baktériumok, archeák Tápoldat komponensek – Pufferek: pl. foszfát, TRIS – Sók: pl. NaCl, KCl, MgCl, CaCl – Nyomelemek: pl. ZnSO4, H3BO3, NiCl, FeSO4, Na2, SeO3, Na2WO4 – Vitaminok: pl. biotin, fólsav, nikotinsav, B12 vitamin, pantoténsav – Redukálószer: pl. cisztein-hidroklorid, H2S – Indikátor: pl. rezazurin  Mikrobák növesztése Tápoldattal szembeni kritériumok: – Jól növekedjenek a sejtek – A termék képződését elősegítség – Olcsó legyen – Állandó minőségű legyen – Termék kinyerését ne akadályozza  Archea tápoldat összetevői KCl 0.34 g Modified Wolin’s mineral solution: Wolin’s vitamin solution: MgCl2 x 6 H2O 4.00 g Nitrilotriacetic acid 1.50 g Biotin 2.00 mg MgSO4 x 7 H2O 3.00 g Folic acid 2.00 mg MgSO4 x 7 H2O 3.45 g MnSO4 x H2O 0.50 g Pyridoxine-HCl 10.00 mg NH4Cl 0.25 g NaCl 1.00 g Thiamine-HCl 5.00 mg CaCl2 x 2 H2O 0.14 g FeSO4 x 7 H2O 0.10 g Riboflavin 5.00 mg K2HPO4 0.14 g CoSO4 x 7 H2O 0.18 g Nicotinic acid 5.00 mg NaCl 18.00 g CaCl2 x 2 H2O 0.10 g Ca-D-pantothenate 5.00 mg ZnSO4 x 7 H2O 0.18 g Vitamin B12 0.10 mg Modified Wolin’s mineral solution (see below) CuSO4 x 5 H2O 0.01 g p-Aminobenzoic acid 5.00 mg 10.00 ml KAl(SO4)2 x 12 H2O 0.02 g (±)-α-Lipoic acid 5.00 mg Fe(NH4)2(SO4)2 x 6 H2O solution (0.1% w/v) H3BO3 0.01 g 2.00 ml Distilled water 1000.00 ml Na2MoO4 x 2 H2O 0.01 g Na-acetate 1.00 g NiCl2 x 6 H2O 0.03 g Yeast extract (OXOID) 2.00 g Na2SeO3 x 5 H2O 0.30 mg Trypticase peptone (BD BBL) 2.00 g Na2WO4 x 2 H2O 0.40 mg Distilled water 1000.00 ml Na-resazurin solution (0.1% w/v) 0.50 ml NaHCO3 5.00 g Wolin’s vitamin solution (see below) 10.00 ml L-Cysteine-HCl x H2O 0.50 g Na2S x 9 H2O 0.50 g Distilled water 1000.00 ml túl összetett és drága: megoldás az ipari komplex tápok alkalmazása  Ipari komplex tápok prokarióták növesztéséhez Melasz 50% cukor Kristályosítás után maradó viszkózus folyadék Kevés szabad vizet tartalmaz Nitrogén, ásványi anyagokban dús Boston 1919  Ipari komplex tápok prokarióták növesztéséhez Kukorica szirup Keményítő kinyerés során keletkezik Régebben: főzés sósav jelenlétében Ma: enzimes kezeléssl állítják elő – α-amiláz: oligoszacharidok – glükoamiláz: glükóz – xilóz izomeráz: glükózból fruktóz N és C forrás Ásványi anyagokat is tartalmaz  Ipari komplex tápok: manióka Manióka Keményítőben gazdag Sok fehérje: 18-22% Ehető gumós növény Cianidot tartalmaz Olcsó, szubtrópuson, trópuson termesztik Igénytelen Afrikában fő táplálék (40%) Ipari komplex tápok: lignocellulóz  Ipari komplex tápok: lignocellulóz  növényi sejtfal alkotó  cellulóz 35-50%  hemicellulóz (20-35%)  lignin (5-30%)  Cellulóz  lineáris biopolimer  ß-D-glükóz alegységekből épül fel  ß-1,4 glikozidos kötés  cellobióz egységekből  mikrofibrillumok  makrofibrillumook (rostok)  stabil vegyület  Hemicellulóz és lignin  hemicellulóz  poliszaharid  glükánok, xiloglükánok, mannánok alkotják  keresztkötések kialakítása, térhálós szerkezet  lignin  heterogén polimer  aromás vegyület  fenilpropanoid alegység  különböző típusú kovalens kötések (aril-éter, aril-aril, szén-szén)  szilárdság, ellenállás kialakítása  nem kristályos, szabálytalan szerkezet  Ipari komplex tápok: tejsavó Tejsavó Sajtgyártás mellékterméke Laktózt Lipideket, Vitaminokat Ásványi anyagokat tartalmaz  Eukarióta tápok Vízminőség fontos Szükséges kis molekulák Szénforrás – 6C cukrok N forrás – Gln, Glu, Asn, Asp Vitaminok Lipidek Szervetlen sók Fetal Bovine Serum Drága Ismeretlen összetétel Downstream folyamatot zavarja Működik  Eukarióta tápok Hormonok, növekedési faktorok is szükségesek Szervetlen komponensek: pH stabilizálására – pH=7.3-7.5 – HEPES (puffer) + fenolvörös Fejlesztési irányok – Szérum mentes tápok  Sterilezés Tápfolyadékot, bevezetett gázokat sterilezni kell – Gázok Szűrés – Folyadékok Szűrés Inaktiválás Sugárzás  Sterilezés – Szűrés Hőérzékeny anyagokra használják elsősorban Nagy nyomáskülönbség szükséges (szűrendő oldat, szűrlet) Csak szilárd sejtfallal rendelkezőkre jó (pl. mycoplasma-ra, vírusra nem jó) Nitrocellulóz, műanyag lehet a szűrő anyaga Sterilezés  Sterilezés – Inaktiválás NaClO – „hipó” – Bomlik: NaCl és naszcens oxigén Perecetsav – Erős oxidálószer – Eszközök sterilizáslása Hő – +1 atm – 121 °C – 20–30 perc – +2 atm – 134 °C – 10–20 perc – Indikátorok: elszíneződik (megfelelő volt a sterilizálás) – Csak hőstabil anyagokra  Sterilezés Elektromágneses sugárzás:  UV sugárzás (kis áthatolóképesség)  röntgen sugárzás  gamma-sugárzás (nagy áthatolóképesség)  Felhasználható mikrobák Izolált mikrobák (pl. bioremediáció céljára) Adott feladatra szelektált, módosított mikrobák (pl. tejsav kultúrák) Mikroba gyűjtemények – DSMZ – Németország – ATCC – USA – JCM - Japán  Szakaszos üzemű reaktor - Szabályozás: - pH - hőmérséklet - oxigén telítettség - Mérés: - redox potenciál - turbiditás - keverés - gázbevezetés (aerob/anaerob)  Folyamatos üzemű reaktor - Szabályozás: - pH - hőmérséklet - oxigén telítettség - bemenő tápanyag mennyisége - Mérés: - redox potenciál - turbiditás - keverés - gázbevezetés (aerob/anaerob)  Oxigén adagolás Anyagtranszport limitál O2 oldékonysága vízben rossz (7 ppm, 35°C) Ezzel mindig baj van  Downstream Biomassza (sejtek) kinyerés Sejt feltárás Extrakció Makromolekulák elválasztása Kiszerelés  Sejtek elválasztása: centrifuga Szakaszos üzemű – Kis mennyiségekre – Centrifugális erő a nyugalmi gravitációs gyorsulás sokszorosa – Sejtek esetében: 10-15000g – Ülepedés függ: sűrűség, méret, tömeg, alak – Sűrűséggradiens centrifuga: eltérő sűrűségű anyagok elválasztására  Elválasztás: centrifuga Átfolyó henger Folyamatos üzem Rövid tartózkodás Kis helyigény Zárt rendszer  Elválasztás: centrifuga Kamrás, vagy osztott cellás Folyamatos üzem Kis helyigény Tartózkodási idő növelése: több koncentrikus henger Nagyobb részecskék a belső kamrák falára ülnek ki Kisebb részecskék a külső kamrák falára  Elválasztás : centrifuga Dekantáló Folyamatos üzem Rövid tartózkodás Kis helyigény Elválasztás : centrifuga  Sejtek, termékek elválasztása: szűrés Alapelv: 1. szűrendő szuszpenzió 2. iszaplepény 3. szűrőközeg 4. tartórács Szűrési elvek  Sejtek, termékek elválasztása: szűrés Felszíni szűrés: – Szitahatás érvényesül – Szűrő pórusátmérője kisebb, mint a szűrendő részecske – Iszaplepény vastagszik – Hatásfok, sebesség csökken Mélységi szűrés – Szűrőközeg kapillárisai nagyobbak, mint a szűrendő részecske – Fizikai erők hatására lerakódnak  Sejtek, termékek elválasztása: szűrés Termék kinyerés – Szűrés Sokféle – Hagyományos (folyadék áramlás merőleges a szűrőre – Tangenciális (folyadék áramlása párhuzamos a szűrővel Változtatható paraméterek – Pórusátmérő, nyomás  Sejtek, termékek elválasztása: szűrés membránszűrők Hollow fiber Hemodialízis  Sejt feltárás Fizikai – Mechanikus French press – Hengeres tartályt feltöltjük a sejtkultúrával – Nagy nyomás alá helyezzük – Sejteknél kisebb pórusméreten a sejtek átpréselése: fizikailag sérülnek, feltáródnak French press – Ellenálló anyagból kell lennie a berendezésnek Ultrahang Vágókés (turmix) Golyós homogenizálók – Ellenálló anyagból – Golyók mérete megegyezik a sejtekkel – Golyók roncsolják a sejteket  Sejt feltárás Kémiai – Vegyszeres – Termék kompatibilis legyen az oldószerrel Szerves oldószer (toluol, etanol, aceton) Detergens Guanidin HCl Lúg, sav Enzim: lizozim (Gram + peptidoglükán) – drága  Termékek kinyerése, tisztítása Kis molekulákra alkalmas módszerek: – Extrakció – Micella, reverz micella – Kristályosítás – Desztilláció (frakcionált)  Termékek kinyerése, tisztítása extrakció desztilláció  Termékek kinyerése, tisztítása szuperkritikus extrakcióval Szuperkritikus állapot Extrakciós oldószer fluid állapotú gáz Hőmérséklet, nyomás emelése Bármilyen anyag egy kritikus nyomás és hőmérséklet felett szuperkritikus állapotba kerül Szilárd anyagban diffundál, mint a gázok Anyagokat old, mint a folyadékok (pl. szerves oldószerek) Szuperkritikusok egymással korlátlanul elegyednek  Szuperkritikus állapot Szuperkritikus állapot – CO2 esetében: Tc = 31.1 °C, Pc = 73.8 bar CO2 alkalmazása  Szuperkritikus extrakció Szuperkritikus állapotú CO2 használatának előnyei: – Alacsony a kritikus nyomás – Alacsony a kritikus hőmérséklet – Olcsón beszerezhető, tisztán előállítható – Környezetbarát – Könnyen kinyerhető és újrahasználható – Nem toxikus, nem lép kémiai reakcióba –