Mikrobiológia: Folyamatok és Kinetika

Biotechnológia - Upstream/Downstream folyamatok

• A biotechnológia upstream/downstream folyamatait mutatja be
• A folyamat első lépése a szubsztrát elkészítése
• Ezután következik a fermentáció (aerob/anaerob) szakasz
• A fermentációt sterilizálással követik
• Az upstream folyamat eredményeként biomassza jön létre
• A downstream folyamat célja a biomassza elválasztása
• Ezt követi a termék elválasztása és tisztítása
• Végül a termék kiszerelésre kerül

Upstream - Termékek előállítása

• Az anyagcsere C+N+O + energia = biomassza+CO2+H2O
• Az anabolizmus és a katabolizmus meghatározó a folyamatban
• Az autotróf, heterótróf, litotróf és organotróf szervezetek fontos szerepet játszanak
• A folyamat feltételeit a diagram mutatja.

Mikrobák növekedési rátája

• A grafikon a mikrobák biomassza és specifikus növekedési rátájának változását mutatja a tenyésztési idő függvényében.
• A növekedés különböző fázisokat (I, II, III, IV, V, VI) mutat a grafikonon.

Mikrobák növesztésének általános feltételei

• A hőmérséklet kritikus tényező
• A mikrobák hőmérsékleti követelményeinek tágabb skálája látható (psychrophiles, mesophiles, thermophiles és extreme thermophiles)
• A sejt növekedése során a pH is változik
• Fontos a pH általános tűréshatárának ±2 értéke.
• A mikrobák növekedése számos tényezőtől függ, mind a szén-, nitrogénforrásoktól, illetve oxigénigénytől.
• Monod kinetika fogalmak is fontos részei a folyamatnak.

Prokarióták, szén- és nitrogén forrás

• A szénforrás monokinétka szerint zajlik:
• μ = µmax x S / (ks + S)
• A nitrogén lehet szervetlen, vagy szerves formájú.
• Aerob, vagy anaerob életmód.

Prokarióták, oxigénforrás

• Aerob -O2,szuperoxid(H₂O₂), oxigén rossz oldékonysága
• Anaerob - NO3-,SO42-

ATP - Energia

• Aerob: 36-38 ATP/glükóz
• Anaerob: 1-3 ATP/glükóz

Mikrobák növesztése - Nitrogén forrás

• Az aminosavak, peptidek, fehérjék, ammónia, és a N2 fontos nitrogénforrás

Mikrobák növesztése - Szénforrás

• Dextrin, szacharóz, laktóz, xilóz, mannitol, szorbitol, növényi olajok, szerves savak, szén-dioxid

Mikrobák növesztése: baktériumok, archeák, tápoldat komponensek

• Pufferek pl. foszfát, TRIS
• Sók: pl. NaCl, KCl, MgCl, CaCl
• Nyomelemek: pl.ZnSO4, H3BO3, NiCl, FeSO4, Na2, SeO3, Na2WO4
• Vitaminok pl. biotin, fólsav, nikotinsav, B12 vitamin, pantoténsav
• Redukálószer pl. cisztein-hidroklorid, H₂S
• Indikátor: pl. rezazurin

Mikrobák növesztése, tápoldattal szembeni kritériumok

• A sejtek jól növekedjenek
• Termék képződését könnyítik
• Olcsó legyen
• Állandó minőségű
• Termék kinyerését ne akadályozza

Archeák tápoldat összetevői

• A modified Wolin és Wolin vitamin megoldás a mikrobák növesztésének specifikus követelményeit elégíti ki

Ipari komplex tápok prokarióták növesztéséhez

• Melasz (cukorforrás): kristályosítás utáni maradék viszkózus folyadék
• Kukorica szirup: keményítő kinyerése során keletkezik
• Manióka

Ipari komplex tápok: lignocellulóz

• lignin, hemicellulóz, cellulóz komponenseket tartalmazó biomassza
• növényi sejtfal alkotó

Cellulóz

• Lineáris biopolimer
• ß-D-glükóz alegységekből épül fel
• stabil vegyület

Hemicellulóz és lignin

• Heterogén polimer
• Aromás vegyület
• Fenilpropanoid alegység
• Különböző típusú kovalens kötés
• Szilárdság, ellenállás kialakítása
• Nem kristályos, szabálytalan szerkezet

Ipari komplex tápok: tejsavó

• Sajtgyártás mellékterméke
• Laktózt, lipideket és vitaminokat tartalmaz
• Ásványi anyagokat tartalmaz

Eukarióta tápok

• Vízminőség fontos
• Szükséges kis molekulák (6C cukrok, N forrás: Gln, Glu, Asn, Asp)
• Vitaminok, lipidek, szervetlen sók
• Fetal Bovine Serum, Drága, ismeretlen összetétel, Downstream folyamatot zavarja

Eukarióta tápok: Hormonok és szervetlen komponensek

• Hormonok, növekedési faktorok
• Szervetlen komponensek (pH stabilizálására)
• pH=7.3-7.5
• HEPES, fenolvörös

Sterilezés

• Tápfolyadékok és bevezethető gázok sterilizálása szükséges.
• Gázok - sterilizálást követően
• Folyadékok - szűrés, inaktiváció, sugárzással.
• Szűrések, inaktiváció és sugárzás fontos részei

Sterilezés - Szűrés

• Hőérzékeny anyagok esetében
• Nagy nyomás külöbség szűrés esetén.
• Nitrocellulóz és más műanyagok szűrőanyagok
• Szűrlet

Sterilezés - Inaktiválás

• NaCIO (hipó) - bomlik: NaCl és naszcens oxigén
• Perecetsav - erős oxidálószer
• Hő (1 atm – 121 °C - 20-30 perc, 2 atm – 134 °C - 10-20 perc)
• csak hőstabil anyagokra

Sterilezés - Elektromágneses sugárzás

• UV, röntgen, gamma sugárzás; változó áthatóképességű

Felhasználható mikrobák

• Izolált mikrobák (bioremediáció)
• Szelektiv, módosított mikrobák

Szakaszos üzemű reaktor

• Szabályozás: pH, hőmérséklet, oxigén telítettség, bemenő anyag mennyisége
• Mérés: redox potenciál, turbiditás, keverés, gázbevezetés (aerob/anaerob)

Folyamatos üzemű reaktor

• Szabályozás: pH, hőmérséklet, oxigén telítettség, bemenő tápanyag mennyisége, redox potenciál, turbiditás, keverés, gázbevezetés (aerob/anaerob)

Oxigén adagolása

• Anyagtranszport limitál; O₂ oldékonysága vízben rossz (7 ppm, 35 °C) esetén a mikrobák növekedése korlátozott lesz.

Downstream

• Biomassza (sejtek) kinyerése
• Sejt feltárás
• Extrakció
• Makromolekulák elválasztása
• Kiszerelés

Sejtek elválasztása: centrifuga

• Szakaszos üzemű: kis mennyiségekre, centrifugális erő a nyugalmi gravitációs gyorsulás sokszorosa, sejtek esetében: 10-15000 g
• Ülepedés függ: sűrűség, méret, tömeg, alak
• Sűrűséggradiens centrifuga: eltérő sűrűségű anyagok elválasztása

Elválasztás: centrifuga

• Átfolyó henger, folyamatos üzem, rövid tartózkodás, kis helyigény, zárt rendszer

Sejtek, termékek elválasztása: szűrés

• Alapelv: szűrendő szuszpenzió, iszaplepény, szűrőközeg, tartórács
• Szűrlet (filtrátum)

Szűrési elvek

• Abszolút szűrők, típusok (ultra, mikro, makroporózus), mechanizmusok
• Méret szerinti kizárás, hídképződés, adszorpció

Sejtek, termékek elválasztása: szűrés (felszíni és mélységi)

• Felszíni: szitahatás, szűrő, iszaplepény, hatásfok/sebesség
• Mélységi: szűrőközeg kapillárisa nagyobbak a részecskéknél, fizikai erők

Sejtek, termékek elválasztása: szűrés-membránszűrők

• Hagyományos/Tangenciális szűrés ,
• Változtatható paraméterek
• Pórusátmérő, nyomás

Hemodialízis

• Véralvadásgátló, használt dialízis folyadék, filter (szűrő), friss dialízis folyadék

Sejt feltárás

• Fizikai (mechanikus): French press (hengeres tartály, nagy nyomás)
• Kémiai (vegyszeres): szerves oldószer (toluol, etanol, aceton), detergens, guanidin HCI, lúg, sav, enzim (lizozim)

Termékek kinyerése, tisztítása (kis molekulákra alkalmas módszerek)

• Extrakció (micellák, reverz micella, kristályosítás), desztilláció (frakcionált)

Termékek kinyerése, tisztítása-extrakció, desztilláció

• Extrakció, módszerek, folyamatok (szétválasztás, folyadékok)
• Desztilláció (frakcionált), módszerek, folyamatok

Szuperkritikus extrakció

• Szuperkritikus állapot (CO2 esetében)
• Extrakciós oldószer(fluid állapotú gáz)
• Hőmérséklet, nyomás
• Bármilyen anyag egy kritikus nyomás és hőmérséklet felett
• Szilárd anyagban diffundál, mint a gázok, anyagokat old, mint a folyadékok
• Szuperkritikusa egymással korlátlanul elegyednek

Szuperkritikus extrakció - előnyök és hátránya

• Előnyök: jó oldékonyság, oldószer maradéktalanul elválasztható, visszanyerhető, gyors;
• Hátrány: drága

Szuperkritikus extrakció - példák

• Koffeinmentes kávé, nikotinmentes cigaretta, lupulin kinyerése komlóból

Koleszterin mentes termékek előállítása szuperkritikus extrakcióval