Módulo 9: Procesos Downstream PDF

Módulo 9: Procesos “downstream” BIOT 6230 2 Introducción al Módulo 9 u Luego del cultivo de las células productoras (y que se completen los procesos “upstream”), la siguiente etapa en los bioprocesos industriales es la etapa “downstream”. En este nuevo módulo del curso, que también es relativame...

Módulo 9: Procesos “downstream” BIOT 6230 2 Introducción al Módulo 9 u Luego del cultivo de las células productoras (y que se completen los procesos “upstream”), la siguiente etapa en los bioprocesos industriales es la etapa “downstream”. En este nuevo módulo del curso, que también es relativamente extenso, se presentan los aspectos relacionados a las operaciones “downstream”. u El módulo 8 inicia con una descripción generalizada de las operaciones “downstream”. Luego va a describir con mayores detalles los principales objetivos y sub-etapas dentro de estas operaciones y enfatizará la importancia de estos procesos dentro del ciclo de generación de un bioproducto. u Al igual que pasó con las etapas “upstream”, en este módulo no se podrá entrar en todos los detalles específicos de una operación “downstream” porque eso puede tomar un curso entero. No obstante, se presentan los temas principales referentes al mismo y que es necesario que ustedes dominen. u Además, se presentarán algunos de los retos principales que están asociados a las operaciones “downstream”. Objetivos del Tema 3 • Reconocer la utilidad del procesamiento “downstream” en los bioprocesos industriales. • Explicar el orden lógico que debe seguir un procesamiento “dowsntream”. • Explicar los objetivos de las tres etapas principales dentro el procesamiento “dowsntream”. • Describir las tecnologías principales que son utilizadas en las operaciones “downstream”. • Explicar por qué las operaciones “dowsnstream” son costosas, lentas y variables. • Identificar los problemas principales que pueden estar relacionados con el procesamiento “dowsntream”. • Diferenciar los distintos tipos de cromatografía que pueden ser aplicados en las operaciones “downstream”. • Evaluar la importancia de las unidades de purificación para la distribución de productos que cumplan con los requisitos regulatorios. • Reconocer que las operaciones “downstream” pueden variar dependiendo del tipo de producto. 4 Aclarando el concepto: “Downstream” § Como pudieron ver en el tema de las operaciones “upstream”, los bioprocesos se pueden sub-dividir en dos fases: las iniciales (“upstream”) y las finales. Estas finales son las llamadas “downstream”. Es decir, las etapas que siguen una vez las células han crecido en el biorreactor/fermentador. u Así que se puede decir que: u Upstream: llegar a la generación de la molécula de interés a través de los cultivos celulares. u Downstream: recuperar, purificar y pulir esa molécula de interés (API) hasta tener el producto final deseado, que cumple con los requisitos de ley. 5 ¿Cuándo inicia la etapa “downstream”? u En efecto, la respuesta a la pregunta puede parecer obvia, no obstante, en ocasiones tiende a haber confusiones. u En términos del consenso general, en los bioprocesos, downstream incluye tres etapas principales: u Recuperación o cosecha u Purificación intermedia u Pulido final 6 Importancia de las etapas “downstream” § El cultivo de células es un proceso complejo. Requiere la adición de numerosas sustancias, el control de diversos parámetros y la inversión de dinero y esfuerzo para que las condiciones puedan permitir el mayor número de células creciendo en el biorreactor. Una vez eso se logra, el objetivo de obtener el producto deseado aún no se cumple. § Los productos típicos que se derivan de los bioprocesos industriales requieren un nivel elevado de pureza, tienen que cumplir un propósito lo más específico posible, y no pueden estar mezclados con otras moléculas semejantes. § Es otras palabras, tienen que tener una identidad, una pureza, una efectividad y una calidad conviencentes. Con la operación “upstream” eso no se logra. Por lo tanto, esa molécula (sea cual sea) que se genera gracias a las operaciones iniciales, necesita ser procesada de forma tal que cumpla con unas condiciones requeridas por ley, y eso es lo que entre otras cosas guiará los objetivos del procesamiento “downstream”. ¿Qué pasa en las operaciones “upstream” que hace necesario un procesamiento “dowsntream”? § Generación de moléculas de interés que se mezclan con otras moléculas: § § 7 Ya sea porque son secretadas directamente al medio de cultivo donde crecen las células o porque están localizadas en una estructura intracelular, que al ser destruida pasa a mezclarse con la molécula de interés. Hay muchos desechos del metabolismo celular, de células que mueren, hay trazas de sustancias que son normales en “upstream”, y eso está en el mismo medio donde está la molécula de interés, por o tanto el objetivo es básico: hay que separar lo que se desea de lo que no se desea. Eso se logra con diferentes intervenciones que serán parte de una etapa de procesamiento “downstream”. 8 Operaciones “downstream” § Tienden a retrasar el proceso general de producción de moléculas de interés porque requieren muchas tecnologías. Además, las producciones “upstream” son muy grandes y todo ese volumen de material tiene que pasar por procesamiento “dowsntream”. Así que estas etapas “downstream” tienden a crear un “tapón” en la producción ya que es mucho el volumen producido y las tecnologías “downstream” no logran ser tan rápidas para poder procesar todo lo más rápido posible. § Ese problema crea un efecto del cuello de botella, que es un reto en cada bioproceso industrial. § En la actualidad la aceleración y automatización de algunas tecnologías “dowsntream”, así como el uso de materiales desechables están agilizando un poco las operaciones finales, pero aun así queda mucho por mejorar. Pureza: El producto o sustancia de interés está libre de otras sustancias o moléculas que no son deseadas (y que son consideradas contaminantes). Conceptos importantes relacionados a “downstream” 9 Identidad: Que al final de la purificación la proteína o la molécula de interés que es obtenida conserve sus características y su naturaleza esperada. (Que no tenga modificaciones no deseadas) Estabilidad: cuán susceptible puede ser una molécula a diferentes condiciones (y cómo eso le afecta). Mientras más estable menos su vulnerabilidad a factores externos. Rendimiento: Cuánta cantidad hay presente del producto o sustancia de interés, luego de cada etapa de procesamiento. Actividad: Se relaciona con la capacidad que tiene una molécula de actuar de una forma específica. En el caso de productos terapéuticos, es la habilidad del mismo para llevar a cabo el efecto deseado o esperado (efecto terapéutico). 10 Así que en resumen las metas esenciales de las etapas “dowsntream” son: u Recuperación: involucra la separación del producto de interés de las células productoras en el biorreactor. u Purificación Intermedia: procesos que se llevan a cabo para la remoción de contaminantes como macromoléculas celulares (ADN, proteínas, lípidos, entre otros), la eliminación de posibles virus, así como cualquier posible contaminante que esté en el medio a consecuencia de lo necesario para el cultivo celular (buffers, solventes, entre otras sustancias). u Pulido final: incluye la última etapa de la operación “downstream” en la que se aplican tecnologías que ayudarán a eliminar posibles contaminantes que se encuentren en trazas (por ejemplo, isoformas proteicas, péptidos incorrectamente asociados, entre algunos otros ejemplos). 11 Proceso de clarificación § Antes del proceso de recuperación, las compañías suelen llevar a cabo unos procesos de clarificación. Dicho proceso va antes de la recuperación, y en muchas ocasiones se le asocia con las operaciones “upstream”, en otras instancias se dice que la clarificación es la etapa inicial “downstream”. § No obstante, suele ser una etapa de transición entre las operaciones “upstream” y las “downstream”. § Los procesos de clarificación incluyen la filtración del medio de cultivo en el biorreactor con el fin de eliminar materiales sólidos no deseados del medio, que puedan relacionarse con el producto de interés y así afectar el procesamiento de purificación que sigue posteriormente. Esta etapa va bien cerca de la recuperación. Uno de los objetivos primordiales es ir eliminando materiales que pudieran hacer más difícil el proceso de recuperación y purificación. Para las tecnologías de recuperación se tiene que considerar varios puntos importantes § El primer aspecto es tener claro qué tipo de molécula o sustancia es la que se genera. § De igual forma es imprescindible tener claro a qué se puede y a qué no se puede exponer la molécula/sustancia de interés. Por ejemplo: § ¿Es delicada a altas temperaturas? § ¿La agitación exagerada es dañina para el producto? § Adicionalmente se debe tener en consideración si el material deseado puede estar sujeto a contaminación con los materiales del cultivo celular y si esa mezcla lo hace más difícil luego para purificar. § Finalmente, otro punto que es clave para el establecimiento de procesos de recuperación es la localización final de la molécula de interés. Como parte de un cultivo celular, las moléculas de interés pueden ser secretadas directamente al medio de cultivo (algunas pueden permanecer en la matriz extracelular), otras pasan al medio. Sin embargo, hay moléculas que se pueden quedar dentro de la célula productora. § Por lo general, las células que poseen pared celular tienden a generar las moléculas de interés en su interior (con algunas excepciones), mientras que las células sin pared celular, como las de mamíferos, tienden a secretar los productos hacia el medio en el biorreactor. 12 13 Procesos de recuperación § El proceso de recuperación es delicado, específicamente si los productos deseados son de naturaleza proteica. § Las técnicas específicas que se necesitan utilizar en esta tarea de recuperación varían según el producto y la industria. No obstante, por regla general, los métodos para recuperar metabolitos intracelulares no son los mismos que para recuperar aquellos que fueron secretados fuera de la célula. § Lógicamente un producto que se mantiene intracelular requiere más esfuerzos y más tecnologías para poder ser recuperado, que si se compara con un producto que es extracelular. § Así que los productos generados dentro de la célula tienen que ser liberados, y para ello existen diversos métodos, que no estaremos discutiendo en detalle, pero de los que pueden buscar más información según las fuentes de información sugeridas. 14 A nivel de costsos… u ¿Qué etapas “downstream” prefiere una compañía? 15 Técnicas aplicadas en la etapa de recuperación Productos intracelulares Productos secretados directamente al medio Puede llevarse a cabo por procesos mecánicos (que destruyen las células) para liberar las moléculas de interés No son utilizadas las metodologías para destruir células ni para permeabilizar las mismas. Se pueden llevar a cabo por procesos no mecánicos (buscan sacar la molécula de interés al hacer poros en las células) Se aplican metodologías de separación Una vez las moléculas de interés son liberadas del interior, se aplican métodos de separación. 16 Ejemplo de metodologías para la obtención de moléculas intracelulares Centrifugación Homogenización Métodos mecánicos Desestabilización ultrasónica Uso de equipo con material abrasivo (“ bead mills”) 17 Ejemplos de métodos no-mecánicos para la permeabilización de las células Métodos no mecánicos Uso de enzimas Proteasas, Uso de agentes químicos para permeabilizar la membrana Detergentes, solventes, agentes caotrópicos, antibióticos que afectan pared y membrana, EDTA Otros métodos no mecánicos Choque osmótico, patrones de congelamiento y descongelamiento Las células de mamífero y los procesos de recuperación de células 18 § Este tipo de células, que son muy usadas en industrias biofarmacéuticas, por lo general, secretan las moléculas al medio (en realidad las generan fuera de la célula-zona de matriz extracelular). § Así que los métodos de recuperación son más sencillos en el sentido de que no se requiere la destrucción/permeabilización de la membrana celular. § § Por consiguiente, hay menos desechos o menos moléculas contaminantes que tengan que ser eliminadas en las etapas siguientes de purificación. § Eso hace que los costos operacionales sean un poco menores que aquellos procesos que requieren metodologías de destrucción celular. Es necesario tener en perspectiva que tanto los procesos “upstream” como las tecnologías aplicadas en la recuperación de moléculas tienen una influencia directa sobre cómo será la etapa de purificación que va luego de la recuperación en los procesos “dowsntream”. Unidades operacionales más importantes en las etapas “downsteam”: La filtración § 19 Las moléculas biológicas no pueden resistir los métodos tradicionales de esterilización como calor, irradiación con rayos gama, entre otros. Y ¿qué se puede hacer entonces? § Como vimos en módulos anteriores, se tiene que trabajar en áreas controladas con diseños y facilidades que garanticen una calidad elevada. También se puede aplicar el uso de filtración. § Así que el uso de filtros es indispensable en las diferentes etapas del procesamiento “dowsntream”, desde la recuperación hasta el pulido final de una molécula dada. § Existen distintos tipos de filtros que funcionan con dinámicas diferentes y que son aplicados en fases específicas de la operación “downstream”. § Los filtros ayudan a separar las moléculas deseadas de las no deseadas, claro está hay que tener en consideración que en el biorreactor hay moléculas de diferentes tamaños (incluyendo las células completas, los desechos celulares más grandes y las moléculas más pequeñas). Por lo tanto, hay que utilizar diferentes tipos de filtros para separar cada una. u Aplicaciones de la filtración en el procesamiento “downstream” Algunos de los usos principales de la filtración en las etapas "downstream" incluyen: u Filtración de "buffers", aditivos para medios, medios de cultivo u Remoción de microorganismos, virus y otras partículas contaminantes u Preparación de aguas de calidad para productos terapéuticos u Antes y después de procesos de cromatografía (para maximizar la calidad del proceso) u Recuperar células u Recuperar productos u Pulir productos finales-eliminar contaminantes en trazas 20 Modos de funcionamiento de la filtración Los filtros pueden funcionar de dos formas principales: u u En modo normal o en modo tangencial. u La filtración de flujo normal (“Normal Flow Filtration”- siglas: N.F.F.)- es conocida, además, como: filtración de flujo directo (DFF) o como filtración sin salida (“dead end filtration”). u u Este tipo de proceso es el más común. Filtración de flujo tangencial ("Tangential Flow Filtration”-T.F.F.): u Es también conocida la filtración de flujo cruzado (CFF"cross flow filtration"). u Es muy utilizada para bioprocesos de proteínas terapéuticas. 21 22 Filtración de flujo normal u Es el modo tradicional de aplicación de filtros. La solución o material que va a ser filtrado atraviesa una membrana o elemento filtrante que está localizado de forma perpendicular al flujo de la solución que es filtrada. u El total o el 100 % del material atraviesa la superficie del filtro, en el que las partículas más grandes se retienen y las que tienen un diámetro menor al de los poros del filtro, pasan con el material filtrado. u Este tipo de filtros se tiende a tapar con el tiempo. Ejemplos de filtros utilizados en las etapas “downstream” que tienen la dinámica de Flujo normal § Filtros gruesos o profundos (“depth filters”) § Filtros finos o de superficie (“surface filters”) § Filtros de membrana (“membrane filters”) 23 24 Filtración de flujo tangencial (FFT) En este tipo de proceso, el material a ser filtrado pasa de forma paralela a la superficie de la membrana o el elemento filtrante. Una porción pasa a través de la membrana, mientras que la otra porción es recirculada. El flujo tangencial o cruzado, promueve una acción de barrido que ayuda a evitar que el material tape la membrana (proceso más eficiente).Es un proceso útil para filtrar soluciones que contienen un alto contenido de partículas muy pequeñas. La filtración de flujo tangencial o cruzado tiene dos aplicaciones comunes dependiendo del tamaño de los poros de las membranas que se utilizan. • Estos son los procesos de microfiltración (MF) y de ultrafiltración (UF). Filtración de Flujo normal vs. Flujo cruzado 25 http://www.spectrumlabs.com/filtration/Edge.html Procesos comunes de filtración en la operación “downstream” § Microfiltración (MF): los poros del filtro tienen diámetros de entre 0.1 y 10 µm. Este tipo de membranas pueden ser útiles en la remoción de células enteras, algunas estructuras internas, partículas grandes y la gran mayoría de los microorganismos. Puede ser aplicada en operación de flujo normal o de flujo tangencial. § Ultrafiltración (UF): es efectivo en la retención de moléculas pequeñas ya que los poros de este tipo de membranas van de 1 a 20 nm. Es decir, son lo suficientemente pequeños como para retener proteínas pequeñas y de bajo peso molecular. § En realidad, cuando se trabaja con el proceso de UF se acostumbra a utilizar las siglas MWCO- “Molecular Weight Cut Off”), indicativo de la capacidad de retener moléculas, algo que no es posible en los otros tipos de tecnologías de filtración. § El MWCO es en sí el soluto con un peso molecular más bajo, que queda retenido en la membrana en un 90 a 95%. Los valores MWCO no son absolutos. La ultrafiltración es altamente utilizada para la concentración del material en las etapas iniciales de purificación. § UF solo trabaja en flujo tangencial. 26 ¿Por qué la filtración es tan usada en “downstream”? u En especial en industrias biofarmecéuticas u Bueno es por la naturaleza del producto u Las proteínas no pueden pasar por procesos convencionales de esterilización u u Así que la filtración va a ser una metodología de mucha utilidad en este tipo de procesos Pero no es un proceso libre de riesgos u Es decir, siempre hay riesgos de mala manipulación y posible contaminación de las soluciones 27 28 Son las que siguen a la recuperación. Tienen un rol esencial en la eliminación de materiales no deseados en la producción. Por ejemplo: Etapas de purificación •Estructuras celulares grandes (desechos-debris de las células) •Ácidos nucleicos •Proteínas no deseadas •Agregados proteicos •Productos de naturaleza lípida •Virus •Endotoxinas •Microorganismos •Desechos de sustancias utilizadas en la operación “upstream” •Otros Este tipo de procesos buscan cumplir con las regulaciones que exigen calidad y pureza elevada de los productos. Los procesos de purificación requieren de un costo elevado por la naturaleza de las intervenciones y tecnologías que deben ser aplicadas. 29 Purificación El objetivo fundamental de los procesos de purificación es generar proteína pura (es decir, libre de contaminantes), activa (que tenga el efecto terapéutico deseado), de una identidad confirmada (que sea solo la proteína que se quiere y como se quiere) y en un alto rendimiento (es decir con una suficiente cantidad obtenida). En una operación “downstream”, se aplicarán las metodologías mínimas necesarias para cumplir con las metas de regulación, así como de producción. No se utilizan procesos innecesarios ya que, por regla, a mayor procesamiento por el que pasen las moléculas de interés, aunque se consigue mayor pureza, se sacrifica el rendimiento (es decir, se pierde producto). El rendimiento es el porciento de la cantidad inicial de producto, que se teorizaba se iba a generar, que al final puede ser obtenida o recuperada en estado puro al utilizar unas tecnologías dadas. Es decir, cuánta cantidad del producto inicial proyectado se logra obtener al final de toda la operación “downstream”. Aspectos importantes que inciden en cómo son las etapas de purificación Pureza Bioactividad Molécula de interés Identidad Rendimiento 30 31 Etapas de purificación § Hay muchas tecnologías que pueden ser aplicadas en las etapas de purificación dentro del proceso “downstream”. La filtración es una de las más frecuentes, sin embargo, existe una metodología que es preferida en las etapas de purificación: La cromatografía. § La cromatografía es una técnica relativamente sencilla, que ha tenido mucho éxito en la purificación industrial. En este curso no vamos a entrar en los aspectos básicos del proceso de cromatografía, sin embargo, en la siguiente diapositiva se resumen algunos conceptos básicos de la cromatografía. u Los componentes separados de la mezcla son distribuidos entre dos fases: u u u Puntos básicos sobre cromatografía Fase móvil Adsorción: proceso por el cual átomos, iones o moléculas son retenidos en la superficie de un material que tiene unas propiedades específicas. u u Fase estacionaria No es igual que la absorción (que es relacionado a volumen). Elución: es el enjuagado con solventes, que facilita la liberación o movilización de las moléculas (que pueden ser por lo general, las de interés) y que estaban adheridas a la fase estacionaria. u Si el proceso es en columna, se ejecuta en el mismo sistema con el uso de varios solventes, el solvente eluyente es el último que se aplica. u Se puede remover el material sólido empacado y someterlo al proceso de adición de solventes hasta que la sustancia de interés finalmente sea eluída. 32 33 u Puntos básicos sobre cromatografía u Fase Estacionaria: material sólido (mayormente) por el cual se desplazará la fase móvil y que puede retener moléculas o sustancias. u Puede ser también un líquido (contenido en una matriz sólida) u Contiene la sustancia adsorbente (por lo general materiales altamente polares) u Se puede unir con la muestra que va a procesarse, dependiendo del grado de atracción que exista. Fase Móvil: la mezcla es llevada a un líquido o gas (los solventes) que se va a mover a través de una columna u A ese solvente se le conoce como el eluyente u La separación ocurre cuando una sustancia es retenida de una manera más efectiva por la fase estacionaria que las otras. u Las sustancias con menos afinidad por la fase estacionaria se desplazarán junto con el eluyente más rápidamente con la fase móvil (son eluídas primero). 34 Ejemplo de cromatograma http://www.cobertassoc.com/hpgrm64.htm Puntos básicos sobre cromatografía § Todo proceso de separación mediante el uso de cromatografía tiene una resolución específica. La resolución expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema de cromatografía para dos o más componentes que están en una mezcla. § La resolución se puede apreciar en un cromatograma, que es una representación gráfica donde se pueden descifrar las moléculas que son separadas y la efectividad de esa separación en un tiempo dado. § La eficiencia de la columna (conocida como N) es lo mismo que su resolución: § Es directamente proporcional al largo de la columna (L), dividido entre un factor H (# de platos teóricos) § Mientras más cortas las columnas mejor es la resolución , por eso a mayores escalas de procesamiento se requieren unas adaptaciones para que los sistemas de cromatografía sean lo más eficientes posible. 35 La cromatografía en bioprocesos u Los sistemas de cromatografía más comunes son los que tienen configuración de columna. u Los procesos de cromatografía a nivel industrial requieren la selección y utilización adecuadas de: u Las columnas y el material a empacarse ( la fase estacionaria) u Resinas o membranas u Solventes u Sistemas automatizados u “Buffers” 36 37 La cromatografía en las operaciones “downstream” Por lo general, existen múltiples unidades de cromatografía en las etapas de purificación. Es decir, se combinan múltiples sistemas en un solo procesamiento “downstream”. Eso es así para permitir una mejor selectividad y una mayor oportunidad para aumentar la pureza en cada paso. El proceso de cromatografía requiere un “scale up” al igual que el proceso de cultivo celular. En términos de la cromatografía se sube en la escala de procesamiento de una forma lineal. Se mantiene la altura de la columna (L) de forma constate, pero se va aumentando en el diámetro de la misma. 38 Hay diferentes tipos de cromatografía Se pueden clasificar por su dinámica de separación en: u Métodos no adsortivos o de partición – La separación está basada en tamaño de moléculas y componentes por difusión. u u Por ejemplo: Método de exclusión por tamaño Métodos adsortivos – Las moléculas son separadas al adherirse a la fase estacionaria. u Por ejemplo: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica. OJO: la palabra es adsortivos (no absorbidos)-tienen significados diferentes Cromatografía por exclusión de tamaño § En esta técnica, la separación se basa en las diferencias en el peso molecular (especialmente para mezclas con componentes de alto peso molecular) y de forma de las proteínas. § Para llevar a cabo este proceso, la mezcla a ser separada pasa por una columna que contiene una matriz porosa (como un gel) y las moléculas con mayor peso molecular son removidas primero ya que no pueden entrar a los poros que son más pequeños. § Las moléculas de menor tamaño y que pueden entrar a los poros, eluyen últimas. Es muy utilizada en la purificación de proteínas, ácidos nucleicos. § Utiliza una matriz de gel inerte, que tiene una distribución de poros cuidadosamente estructurada. Los materiales más comunes de los que son hechas las geles son: § Dextrán, agarosa y poliacrilamida 39 40 Metodologías de cromatografía por adsorción 41 Cromatografía de intercambio iónico Es una de las más utilizadas en las operaciones “downstream” junto con la cromatografía de afinidad. Esta técnica utiliza la atracción electrostática entre la molécula deseada (la molécula blanco) que tiene una carga a un pH determinado, y la resina que también tiene cargas. El producto es retenido inicialmente, y luego eluye cuando se cambia el pH o la fuerza iónica al utilizar el proceso de elución por gradiente (cambios sucesivos de pH en la columna). § Cromatografía de intercambio iónico Así que el proceso de cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las atracciones electrostáticas (reversibles) de una molécula cargada, contra una matriz sólida (la resina) que tiene enlazados grupos con las cargas opuestas a las de la molécula de interés. § Es decir, la fase estacionaria va a tener unas moléculas enlazadas que tienen cargas opuestas a las de la proteína de interés, de manera que estas últimas se queden pegadas, mientras que las que tienen cargas similares no se pueden pegar y eluyen primero. § Posteriormente entonces, se pueden añadir “buffers” con cargas opuestas a las de la resina y así facilitar la elución de las moléculas que se quedaron pegadas inicialmente. § Otra forma de modificar los “buffers” es aumentando su concentración de sal. Las sales en los “buffers” son usadas para separar proteínas al final, y su concentración necesaria es directamente proporcional a la fortaleza con la que quedó atrapada esa molécula en la resina inicialmente. 42 43 Cromatografía de intercambio iónico u Las matrices de las columnas del proceso de cromatografía por intercambio iónico pueden tener moléculas con cargas positivas y se les conoce entonces como cromatografía de intercambio aniónico (ya que las moléculas negativas (aniones) son las que se van a quedar pegadas a la misma. u Por otra parte, las columnas pudieran tener moléculas cargadas negativamente, y se les denomina cromatografía de intercambio catiónico porque son los cationes (moléculas cargadas positivamente) los que se quedarán pegados a la matriz. 44 Cromatografía de Afinidad Es un proceso de cromatografía en el que la separación de la molécula de interés basado por la unión estéreo-selectiva de esta molécula a un ligando particular (que está en la columna). Las moléculas blanco son retenidas en la columna ya que se unen con particular afinidad a una molécula específica de la columna. Luego, esas moléculas blanco son eluídas ya que se cambia el pH, la fuerza iónica o la composición de los “buffers”. Esta técnica de cromatografía es altamente selectiva y es muy popular en las operaciones “downstream”. 45 Cromatografía de Afinidad http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/liquid-chromatography-principles/affinity-chromatography Cromatografía de interacción hidrofóbica (IHCpor sus siglas en inglés) § Es una técnica de cromatografía que es utilizada para la separación de proteínas de una mezcla. § Las diferencias en hidrofobicidad de las proteínas son causadas por los aminoácidos que las componen, en especial aquellos que están más expuestos en la superficie de la molécula. § Así que este tipo de cromatografía utiliza las interacciones hidrofóbicas entre los solutos de la mezcla y la resina para lograr la separación. Luego para eluir las moléculas que quedaron pegadas en la columna, se añade una fase móvil con una reducción de la concentración de sales. 46 47 Cromatografía de interacción hidrofóbica § En resumen, en este tipo de cromatografía, la matriz contiene grupos hidrofóbicos con los que se pueden asociar los grupos hidrofóbicos presentes en la superficie de ciertas proteínas. § La matriz más común empacada en la columna está hecha de agarosa, a la que se le pegan grupos hidrofóbicos de forma covalente. § La separación de proteínas con esta técnica depende de las interacciones de las proteínas, la matriz y del ambiente acuoso del solvente utilizado. Se puede aumentar la fuerza iónica de la solución al añadir sales y esto a su vez aumenta la hidrofobicidad de las proteínas. Es por esto que, a nivel operacional, este tipo de cromatografía se lleva a cabo junto con la aplicación de un solvente con elevada fuerza iónica. § § En el proceso de unión, las proteínas más hidrofóbicas se pegarán mucho más fuertemente a la fase estacionaria. Al final, cuando se va a enjuagar para liberar las proteínas retenidas, se utilizan sustancias que debilitan las condiciones hidrofóbicas, como es el caso de un “buffer” con poca fuerza iónica (reducción de sales), la adición de un detergente o la adición de etanol o glicol de etileno (ambos bajan la polaridad de los “buffers”). § Es otra técnica de cromatografía que es utilizada en las operaciones “dowsntream”. Es un proceso semejante al de Interacción Hidrofóbica, ya que también toma en consideración las diferencias en hidrofobicidad entre las moléculas y los solventes. § Este tipo de proceso se basa en el principio de que hay una distribución no-uniforme de solutos entre dos fases líquidas inmiscibles. El solvente menos polar de los dos solventes entonces se coloca en la fase estacionaria (columna). Cromatografía de fase invertida (Reversed-phase chromatography) § Esa columna brinda grupos hidrofóbicos (cadenas de grupos alquilo) de 4, 8 y 18 carbonos (C4, C8, C18) § La columna se carga al añadir una solución acuosa. § El proceso de elución se basa en aumentar la presencia de solventes hidrofóbicos orgánicos en la fase móvil, lo que va a permitir que las moléculas eluyan en orden de hidrofobicidad (las más hidrofóbicas al final de la elución). 48 § En resumen, la cromatografía de fase presenta una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar (eso es al revés de la cromatografía normal). Hay unas interacciones hidrofóbicas que permiten la separación de las moléculas, lo único que los solventes son especiales (no es lo mismo que la de interacción hidrofóbica). § La elución va a ser permitida ya que el primer solvente (fase móvil) que se usa es altamente polar por lo que las moléculas polares van a eluir primero. (Este solvente es de naturaleza acuosa). Cromatografía de fase invertida 49 50 Sistemas de HPLC (“High Performance Liquid Chromatography”) § Esta técnica es una mucho más rápida a diferencia de las técnicas de cromatografía de columna típicas que se usan en la industria, sin embargo, es utilizada para efectos analíticos, no de la biomanufactura “downstream”. Es más, para los laboratorios de QC del área Química. § Utiliza las dinámicas generales del proceso de cromatografía § § Puede tener resinas de afinidad, intercambio iónico, entre otras. Involucra el uso de equipo a menor escala, automatizado y muy sensitivo. Ayuda a realizar análisis en los laboratorios de control de calidad y de mejoramiento de procesos. 51 Una vez se ha logrado que el producto de interés pase por las etapas de recuperación y purificación, entonces, las moléculas de interés (que ahora tienen un grado elevado de pureza), pasan a ser pulidas o terminadas. Etapas de pulido final El objetivo principal de las etapas de pulido es culminar con la generación del API de una calidad establecida por las agencias reguladoras. Ya en esta etapa la mayoría de las impurezas han sido eliminadas, por lo que realmente en esta fase del proceso “downstream” se busca hacer el producto lo más apto posible para el uso humano antes de llegar a la formulación final (como el producto será distribuido al mercado). De igual forma en esta etapa de desea brindar estabilidad al producto altamente purificado. 52 Procesos incluidos en el pulido final Dependiendo del tipo de producto, por lo general, las etapas de pulido final incluyen una o varias de las siguientes: Ø Ø Cristalización Ø Estabilización Ø Secado Luego de eso pasa a las etapas de formulación final Algunos procesos comunes utilizados para el pulido final 53 Estabilización del producto: Cristalización: Se convierte la molécula de su forma soluble a una forma cristalizada (sólida) Solo a aquellos productos que puedan ser inactivados o alterados antes de su terminado (ej., proteínas). Involucra un proceso denominado formulación, donde se añaden sustancias que protegen la molécula de interés. Secado: Otros: Se remueve agua o algún solvente, del producto sólido. Es un proceso para aquellos productos que serán distribuidos en forma de gránulo. Depende del tipo de bioproceso. Puede incluir destilación (cerveza, vinos), pasteurización (alimentos), evaporación, entre otros. Resumen: Tecnologías que se pueden aplicar en las diferentes etapas “downstream” Clarificación Recuperación Purificación Terminación o pulido Filtración Algunos tipos de Cromatografía Cromatografía (varias unidades) Cristalización Centrifugación Filtración Filtración Desecación Sedimentación Si son metabolitos intracelulares: métodos mecánicos y no mecánicos de ruptura Membranas cargadas Formulación “bulk” Otros 54 Lecturas y otro material adicional recomendado u http://www.bioprocessintl.com/business/pre-clinical-and-clinical-trials/disposabledownstream-processing-for-clinical-manufacturing-315201/?pageNum=1 u https://www.emdmillipore.com/US/en/products/biopharmaceuticalmanufacturing/downstreamprocessing/chromatography/oPGb.qB.fJIAAAFAZ8hkiQpx,nav u Gottschalk, U., Brorson, K., & Shukla, A. A. (2012). The need for innovation in biomanufacturing. Nat Biotech, 30(6), 489-492. doi: 10.1038/nbt.2263 55 56 Referencias u Dutton, R.L. & Scharer, J.M., (2007). Advance technologies in biopharmaceutical processing. United Sates of America: Blackwell Publishing. Bisaria, V.S. & Kondo, A. (2014). Bioprocessing of renewable resources to commodity bioproducts. John Wiley & Sons, Incorporated. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10856811&p00=bioproces u Flickinger, M.C. (2013). Encyclopedia of Industrial Biotechnology. John Wiley & Sons Inc. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10735224 u Ho, R.Y. (2013). Biotechnology and biopharmaceuticals: transforming proteins and genes into drugs. John Wiley & Sons. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10767016 u u Niazi, S. (2017). Fundamentals of modern bioprocessing First issued in paperback. CRC Press. TP248.3. N533 2017 u Okafor, Nduka, (2007). Modern industrial microbiology and biotechnology. Sciences Publishers. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10256230 57 Plan de trabajo para el módulo 9 u Este módulo es uno extenso al igual que el anterior; el enfoque en el mismo es que sepan las etapas incluidas en todo el proceso de recuperación y purificación, luego de que ha ocurrido la generación de la molécula de interés en las etapas “upstream”. u Se espera que puedan analizar bien y proponer por ejemplo etapas “downstream” específicas a partir de ejemplos de producciones “upstream”. u Este módulo no tiene un foro integrado, sin embargo, luego de este tema tienen un trabajo asignado del curso. Deben estar al pendiente de las instrucciones y de las fechas límite. u De igual forma ya se acerca la fecha del examen 2 del curso, que cubrirá hasta el módulo 10.