סיכום מבוא לביוטכנולוגיה מולקולרית 2021 PDF

‫מבוא לביוטכנולוגיה מולקולרית‪:‬‬ ‫מבנה של חומצות גרעין‪:‬‬ ‫תכונות חשובות עבור מולקולה שנושאת מידע תורשתי‪:‬‬ ‫‪.1‬חשוב שתהיה יציבה אך עדיין בעלת יכולת לעבור שינויים‬...

‫מבוא לביוטכנולוגיה מולקולרית‪:‬‬ ‫מבנה של חומצות גרעין‪:‬‬ ‫תכונות חשובות עבור מולקולה שנושאת מידע תורשתי‪:‬‬ ‫‪.1‬חשוב שתהיה יציבה אך עדיין בעלת יכולת לעבור שינויים‬ ‫ומודיפיקציות‬ ‫‪.2‬צריכה להיות בעלת מבנה‪/‬תבנית שניתנת להעתקה ושכפול‬ ‫‪.3‬בעלת יכולת קיבול על מנת להכיל את כל האינפורמציה‬ ‫התורשתית‬ ‫‪.4‬בעלת יכולת כיווץ ו"אריזה" למצב קומפקטי‬ ‫כל חומצת גרעין מורכבת משלושה חלקים‪:‬‬ ‫‪.1‬בסיס – פורין או פרימידין (‪)A,T,C,G,U‬‬ ‫‪.2‬סוכר – ‪ribose or deoxyribose‬‬ ‫‪.3‬פוספט – ‪mono, di, three‬‬ ‫הבסיס‪:‬‬ ‫הבסיסים יכולים להיות פורינים או פרימידינים‪.‬‬ ‫ ‬ ‫הבסיסים הם מולקולות אורגניות המכילות אטום חנקן והן בעלות תכונות כימיות של בסיס‬ ‫ ‬ ‫היות ולאטום החנקן זוג גלמוד של אלק'‪.‬אמנם‬ ‫הבסיסים בעלי ‪ pKa‬נמוך המעיד על היותם‬ ‫בסיס חלש‪.‬‬ ‫הבסיסים בעלי מבנה שטוח (פלנרי) ונוקשה‪.‬‬ ‫ ‬ ‫הבסיסים עוברים טאוטומריזציה – טאוטומרים‬ ‫ ‬ ‫הם זוג או יותר של איזומרים מבניים שנמצאים‬ ‫בש"מ ויכולים לעבור ללא קושי מאיזומר אחד‬ ‫לאחר‪.‬מתבצע בו זמנית חילוף של מימנים‬ ‫ואלקטרונים‪.‬הטאוטומריזציה היא מקור‬ ‫למוטציות שאין לנו שליטה עליהן (התהליך‬ ‫ספונטני ומתרחש כל הזמן)‪.‬‬ ‫ההשפעה העיקרית של הטאוטומריזציה היא בקשרי המימן‬ ‫שיכולים להיווצר‪ ,‬כאשר‬ ‫ישנו איזומר מועדף שרק‬ ‫הוא יוכל להיקשר‬ ‫לבסיס המתאים לו‪.‬‬  ‫זיווג הבסיסים נקבע לפי קשרי המימן שיכולים להיווצר בין צורות‬ ‫ ‬ ‫הטאוטומרים היציבות של הבסיסים‪.‬צורת ה‪ keto‬היא היציבה עבור‬ ‫הפורינים וצורת ה‪ amino‬היא היציבה עבור הפרימידינים‪ :‬קשרי המימן‬ ‫נוצרים בין הבסיסים ‪.A-T , G-C‬‬ ‫הבסיסים הן מולקולות יחסית הידרופוביות למרות שכן יוצרים קשרי‬ ‫ ‬ ‫מימן‪.‬‬ ‫כאשר אין הרבה מים בסביבה הבסיסים יצרו קשרי מימן זה עם זה ויערמו‬ ‫ ‬ ‫אחד על גבי השני‪(.‬המים מתחרים על קשרי המימן עם הבסיסים)‪.‬‬ ‫הערה‪:‬‬ ‫בבסיס ציטוזין – הפחמן עלול לעבור התקפה נוקליאופילית ע"י מים‬ ‫והקבוצה האמינית עוזבת‪ ,‬הבסיס יהפוך מציטוזין ואורציל‪.‬‬ ‫מבחינה אבולוציונית המשמעות היא שה‪ RNA‬נוצר ראשון‪ ,‬אחריו‬ ‫החלבונים ורק לבסוף ה‪ ,DNA‬את זה אנו יודעים מאחר ויש צורך‬ ‫בחלבונים שידעו להחזיר את אורציל להיות בחזרה ציטוזין (ישנן‬ ‫דוגמאות נוספות לשינויים שחלבונים מבצעים על ה‪.)DNA‬‬ ‫קשרי מימן‪:‬‬ ‫סוג מיוחד של אינטראקציות דיפול‪-‬דיפול שמתרחשת כאשר מימן קשור לאטום בעל אלקטרושליליות‬ ‫גבוהה נמצא בסמיכות לאטום אלקטרושלילי אחר בעל זוג גלמוד‪.‬‬ ‫הבסיסים יכולים לעבור שינויים‪:‬‬ ‫ ‬ ‫בהרבה מקרים הבסיסים יכולים לעבור שינויים‪ ,‬בדרך כלל לאחר השיעתוק‪.‬לשינויים אלה‬ ‫חשיבות גדולה למשל בהבחנה בין גדילי ‪ DNA‬חדשים וישנים‪ ,‬זיהוי ‪ DNA‬זר או ויראלי ובקרה על‬ ‫הגנום‪.‬‬ ‫בחיידקים למשל‪ 5-methyl cytosine ,‬משמש להגנה על ה‪ DNA‬מפני אנזים שחותך את ה‪.DNA‬‬ ‫באדם‪ ,‬הבסיסים המכילים מתיל מעורבים ברגולציה של ביטוי גנים‪.‬‬ ‫לסיכום‪:‬‬ ‫‪ −‬הבסיסים יכולים להיות פורינים או פרימידינים הבנויים מטבעות ארומטיות המכילות חנקן‪.‬‬ ‫‪ −‬לבסיסים יש איזומרים מבניים (עוברים טאוטומריזציה)‬ ‫‪ −‬הם יכולים ליצור קשרי מימן‬ ‫‪ −‬בעלי מבנה נוקשה‪ ,‬הידרופוביים‬ ‫‪ −‬יכולים להיערם‬ ‫‪ −‬יכולים לעבור שינויים‬  ‫הסוכר‪:‬‬ ‫הסוכרים בחומצות הגרעין יכולים להיות ריבוז או דיאוקסיריבוז‪.‬‬ ‫דאוקסיריבוז נוצר בעקבות הורדת החמצן מהריבוז ע"י האנזים‬ ‫ריבונוקליאוטיד רדוקטאז (‪.)ribonucleotide reductase‬האנזים אחראי‬ ‫על תהליך דאוקסידציה‪.‬הדאוקסידציה מתבצעת על פחמן מספר ‪.'2‬‬ ‫תהליך הדאוקסידציה מייצב את המולק'‪ ,‬ניתן לכן להבין מדוע ב‪DNA‬‬ ‫קיים הדאוקסיריבוז וב‪ RNA‬קיים הריבוז‪.‬‬ ‫העובדה כי תהליך הדאוקסידציה מתבצע ע"י אנזים היא הוכחה נוספת‬ ‫לכך שהחלבונים נוצרו לפני ה‪.DNA‬‬ ‫בתור סוכר חופשי (מולק' סוכר בודדת) הוא יכול להשתנות תחת תנאים מסוימים מפורנוז (טבעת ‪)5‬‬ ‫לפירנוז (טבעת ‪ ,)6‬ב‪ DNA‬הסוכר מקובע בצורתו כפורנוז‪.‬‬ ‫‪:Sugar Puckering‬‬ ‫בשונה מטבעת ‪ ,6‬טבעת ‪ 5‬היא בעלת גמישות‪ ,‬התכונה הזו מעניקה לסוכר‬ ‫חופש מסוים‪ ,‬תופעה זו נקראת ‪.sugar puckering‬‬ ‫חמשת האטומים של הפנטוז אינם קו‪-‬פלנריים‪ ,‬בדרך כלל אחד או שניים‬ ‫מהם נמצאים מחוץ למישור הטבעת‪.‬‬ ‫‪:β-N-glycosidic bond‬‬ ‫הקשר בין הבסיס לסוכר מתרחש בין פחמן ‪ '1‬של הסוכר לבין‬ ‫חנקן בבסיס (‪ '9‬בפורינים ו‪ '1‬בפרימידינים)‪.‬הקשר הזה נקרא ‪-‬‬ ‫‪.N-glycosidic bond‬‬ ‫סוכר שמחובר לבסיס נקרא נוקליאוזיד‪.‬‬ ‫ישנם שני אנומרים לנוקליאוזיד‪.‬אנומר ביתא – כאשר הבסיס‬ ‫נמצא מעל למישור הטבעת ואנומר אלפא – כאשר הבסיס נמצא‬ ‫מתחת למישור הטבעת‪.‬מעבר בין האנומרים דורש פירוק של‬ ‫קשר קוולנטי ולכן הדבר לא סביר‪ ,‬ב‪ DNA‬נמצא את אנומר ‪.β‬‬  ‫קונפורמציות אנטי וסין בקשר הגליקוזידי‪:‬‬ ‫סיבוב סביב הקשר הגליקוזידי מעביר‬ ‫את המולקולה מקונפורמציות אנטי‬ ‫לסין‪ ,‬הסיבוב סביב הקשר מוגבל‬ ‫וקונפורמר האנטי מועדף בעיקר‬ ‫משיקולים סטריים‪.‬‬ ‫סיכום‪:‬‬ ‫‪ −‬בנוקליאוטידים הסוכר יהיה ריבוז או דאוקסיריבוז (על פחמן ‪)'2‬‬ ‫‪ −‬הסוכר נמצא בקונפיגורציה של טבעת פורנוז (‪ )5‬ובקונפיגורציית ‪β‬‬ ‫‪ −‬הסוכר קשור דרך פחמן ‪ '1‬לבסיס בקשר ‪ – N‬גליקוזידי‬ ‫‪ −‬סיבוב סביב הקשר הגליקוזידי מעביר מקונפורמציית אנטי לסין‬ ‫פוספט‪:‬‬ ‫הפוספט מתחבר לסוכר ומתקבל הנוקליאוטיד‪.‬‬ ‫הפוספט מוסיף מטען שלילי‪ ,‬לכן נוקליאוטידים (חומצות‬ ‫גרעין) הם חומצות‪.‬‬ ‫אם הנוקליאוטיד בעל יותר מפוספט אחד הם יסומנו‬ ‫באלפא ביתא וגמא‪.‬‬ ‫ה‪ DNA‬מורכב משרשראות פולינוקליאוטידיות כאשר‬ ‫הנוקליאוטידים מחוברים דרך קשרים פוספו‪-‬די‪-‬אסטרים‬ ‫(‪.)phosphodiester linkage‬הקשר הפוספו‪-‬די‪-‬אסטרי‬ ‫נוצר בין עמדה ‪ '3‬בסוכר של נוק' אחד לבין עמדה ‪ '5‬של‬ ‫סוכר בנוק' שכן‪ ,‬בניית ה‪ DNA‬מתבצעת מקצה ‪ '5‬ל‪.'3-‬‬ ‫לקשר הפוספו‪-‬די‪-‬אסטרי יש חופש סיבוב‪.‬‬ ‫כל נוקליאוטיד מכיל מספר קשרים שיכולים להסתובב‪,‬‬ ‫אמנם ישנן מגבלות הנובעות מאינטראקציות בין‬ ‫הנוקליאוטידים לבין מים‪ ,‬יונים וחלבונים‪.‬‬ ‫הגמישות במבנה‬ ‫הנוקליאוטידים מאפשרת להם‬ ‫לשנות את המבנה שלהם‬ ‫לדוגמא בזמן תרגום ושיעתוק‪.‬‬  ‫נומנקלטורה – ‪:Nomenclature‬‬ ‫בסיס‪+‬סוכר = נוקליאוזיד‬ ‫בסיס‪+‬סוכר‪+‬פוספט = נוקליאוטיד‬ ‫נוקליאוטידים מקוצרים ע"י ראשי תיבות‪:‬‬ ‫‪AMP = adenosine monophosphate‬‬ ‫‪dAMP = deoxyadenosine monophosphate‬‬ ‫‪UDP = uridine diphosphate‬‬ ‫‪ATP = adenosine triphosphate‬‬ ‫סיכום‪:‬‬ ‫‪ −‬הפוספט בעל מטען שלילי‪ ,‬לכן הנוקליאוטיד הוא חומצה‪.‬‬ ‫‪ −‬הפוספט יכול להימצא בעמדה ‪ '3‬או ‪ '5‬בסוכר‪.‬‬ ‫‪ −‬לקשר הפוספו‪-‬די‪-‬אסטרי יש חופש סיבוב‪.‬‬ ‫‪ −‬לנוקליאוטידים שימושים רבים – קואנזימים‪ ,‬מטבע אנרגיה ועוד‪...‬‬  ‫מבנה ה‪:DNA-‬‬ ‫ה‪ DNA-‬מורכב משני גדילים של נוקליאוטידים הבונים מבנה של‬ ‫סליל הליקלי‪.‬ל‪ DNA -‬פולריות הפוכה‪ ,‬הבסיסים פונים כלפי פנים‬ ‫מאחר והם הידרופוביים‪ ,‬הסוכרים והפוספטים פונים כלפי חוץ‬ ‫משום שם הידרופיליים (כלומר‪ ,‬ה‪ DNA‬הוא מולק' אמפיפטית)‪.‬‬ ‫השלד של ה‪ DNA‬הוא אנטי פרללי‪.‬הגלידים בעלי רצפים משלימים‪.‬‬ ‫ה‪ DNA‬מיוצב על ידי שני סוגים של אינטראקציות בין הבסיסים‪:‬‬ ‫‪ :Base Pairing‬זיווג בסיסים‪.‬קשרי מימן בין הבסיסים‪ ,‬הגדילים‬ ‫מתחברים ומולק' מים נדחפות החוצה ‪ ‬האנטרופיה של המערכת‬ ‫עולה‪.‬‬ ‫‪ :Base Stacking interactions‬אינטראקציות בין ענני אלק' של‬ ‫הבסיסים‪.‬דיפול מושרה‪ ,‬ואן‪-‬דר‪-‬ולס ואינטראקציות הידרופוביות‪.‬‬ ‫קשרי המימן נוצרים בין טאוטומרים נפוצים של הבסיסים‪.‬‬ ‫לשני הבסיסים יש מרחק דומה בין פחמן ‪ '1‬של הסוכר ויש להם סימטריה כפולה‪,‬‬ ‫כלומר‪ ,‬סיבוב של ‪ 180‬מעלות יחזיר את פחמן ‪ '1‬לאותו מקום‪.‬‬ ‫כל בסיס ממוקם ‪ 36⁰‬ביחס לבסיס השכן שלו ו‪ 0.34 nm -‬מעליו‪.‬אחרי כ‪ 10-‬בסיסים מסתיים סיבוב‬ ‫שלם ואנו חוזרים לאותה נקודה‪.‬‬ ‫המבנה הדו גדילי בעל גמישות‪.‬‬ ‫הסיבוב של ה‪ DNA‬הוא סיבוב ימני‪.‬‬ ‫התעלות של ה‪:DNA-‬‬ ‫התעלות נוצרות כתוצאה מהגאומטריה של צימוד הבסיסים‪.‬הזווית בין שני‬ ‫הקשרים הגליקוזידיים היא בערך ‪ 120⁰‬בזווית הצרה ו‪ 240⁰-‬בזווית הרחבה‪.‬‬ ‫התעלה הצרה מכילה פחות מידע מאשר התעלה הרחבה‪ ,‬לכן‪ ,‬חלבונים‬ ‫הנקשרים לרצפים ספציפיים ב‪ DNA‬יבצעו את הקשירה הזו דרך התעלה הרחבה‪,‬‬ ‫לעומת זאת‪ ,‬חלבונים מייצבים הנקשרים ל‪ DNA‬ללא ספציפיות לרצף כלשהו‬ ‫יקשרו דרך התעלה הצרה‪.‬‬  ‫התעלה הרחבה יכולה להכיל בתוכה גם מבנים שניוניים גדולים יותר כמו סלילי אלפא ומשטחי ביתא‬ ‫של חלבונים‪.‬‬ ‫‪A – Hydrogen bond acceptor‬‬ ‫‪D – Hydrogen bond donor‬‬ ‫‪H – non polar hydrogen‬‬ ‫‪M – non polar methyl group‬‬ ‫מדוע ה‪ DNA‬מקבל צורה של סליל הליקס?‬ ‫במצב בו הבסיסים מחוברים אחד לשני האופן ישר (המזכיר סולם) ישנו רווח יחסית גדול בין הבסיסים‪,‬‬ ‫הרווח הזה מאפשר כניסה של מים שמפריעה לאינטראקציות בין הבסיסים‬ ‫ובכך פוגעת ביציבות של המולקולה‪.‬‬ ‫לכן הבסיסים מסתדרים בצורה אלכסונית ומסובבת על מנת להקטין את‬ ‫הרווח בין הבסיסים ולשפר את האינטראקציות ביניהם‪.‬‬ ‫מבנה ההליקס הכפול מופיע במספר קונפורמציות‪:‬‬ ‫‪– B DNA‬‬ ‫זו הצורה הנפוצה בתאים‪.‬‬ ‫הצורה הזו של ה‪ DNA‬היא מבנה‬ ‫ממוצע ומראה את הוריאציות במבנה‬ ‫המדויק‪.‬‬ ‫מאחר וקיים סיבוב חופשי בקשר בין‬ ‫הבסיס לסוכר ישנה תנועה מסוימת של‬ ‫הבסיסים סביב קשר זה‪ ,‬תנועה זו‬ ‫תתבצע על מנת לשפר את‬ ‫האינטראקציות בין הבסיסים‪.‬‬  ‫‪– A DNA‬‬ ‫מבנה יותר קומפקטי עם ‪ 11‬זוגות בסיסים כל סיבוב‪.‬ישנה הטייה של זוגות הבסיסים‬ ‫ביחס לציר הסימטריה של הסליל‪.‬‬ ‫בקונפורמציה זו ישנו חור במרכז הסליל‪.‬קונפורמציה זו נפוצה בסלילי‬ ‫‪ RNA-DNA‬או ‪.RNA-RNA‬‬ ‫‪– Z DNA‬‬ ‫למבנה זה סיבוב שמאלי ומראה "זיג‪-‬זגי"‪.‬‬ ‫הקשר הקליקוזידי הוא בקונפיגורציית אנטי בפרימידין וסין בפורין‪ ,‬זה מה שיוצר את המבנה‬ ‫הזיג‪-‬זגי‪.‬‬ ‫לא ברור מה החשיבות הביולוגית שלו והאם הוא קיים באופן טבעי‪ ,‬אך ניתן‬ ‫לסנתז אותו במעבדה‪.‬‬ ‫ה‪ DNA‬יכול לעבור דנטורציה ורנטורציה‪:‬‬ ‫אם נשים שני גדילים משלימים זה לצד זה הם יעברו היברידיזציה באופן ספונטני‪.‬‬ ‫ניתן להפריד בין גדילים ע"י‪:‬‬ ‫‪.1‬טמפרטורה גבוהה – הגורמת להפרדה של קשרי המימן‬ ‫‪.2‬ריכוז מלח נמוך ‪ -‬כאשר אין מלח קבוצת הפוספט (בעלות מטען שלילי) דוחות אחת השנייה‬ ‫ולכן ה‪ DNA-‬מתיישר‪ ,‬כפי שכבר‬ ‫הזכרנו קודם מצב זה מאפשר כניסה‬ ‫של מולק' מים בין הבסיסים ולכן‬ ‫ה‪ DNA‬פחות יציב‪.‬‬ ‫‪.3‬רצף ה‪ - DNA‬ככל שיש ברצף יותר‬ ‫זוגות של ‪ C‬ו‪ G‬נק' ההתכה יותר‬ ‫גבוהה‪ ,‬זאת מכיוון שבין ‪ C‬ל‪ G‬נוצרים‬ ‫‪ 3‬קשרי מימן לעומת ‪ 2‬קשרי מימן בין‬ ‫‪ A‬ל‪.T‬‬ ‫‪ – PH.4‬קשרי המימן מתפרקים כאשר ה‪ PH-‬בסיסי‪.‬‬ ‫כאשר אנו מבצעים דנטורציה ל‪ DNA‬ניתן לבחון האם כל ה‪DNA‬‬ ‫עבר דנטורציה ע"י כמות האור הנבלע‪ ,‬לגדילים כאשר הם בנפרד יש‬ ‫בליעה גדולה יותר מאשר לסליל הכפול‪.‬‬ ‫לכל בסיס יש בליעה שונה וכך אפשר גם לבדוק כמה בסיסים מכל‬ ‫סוג קיימים בגדיל ה‪.DNA‬‬ ‫הטמפ' בה חצי ממולק' ה‪ DNA‬עברו דנטורציה נקראת נק' ההתכה‪.‬‬ ‫‪:Southern Slot‬‬ ‫שיטה המאפשרת זיהוי רצפים ספציפיים של ה‪.DNA-‬הזיהוי מתבצע ע"י קישור "פרובים פלורסנטיים"‬ ‫ספציפיים לרצף לאחר הפרדה בין הגדילים‪.‬‬  ‫שיטות עבודה‪ :‬הפרדת מקטעי ‪:DNA‬‬ ‫ג'ל אלקטרופורזה‪:‬‬ ‫שיטה להפרדת מאקרו‪-‬מולקולות (‪ DNA‬ו‪)RNA-‬‬ ‫ ‬ ‫ההפרדה מתבססת על מטען וגודל‬ ‫ ‬ ‫המדיום המפריד הוא ג'ל עשוי אגרוז המכיל אתידיום ברומיד (מולק' פלורסנטית המאפשרת‬ ‫ ‬ ‫לראות את ה‪.)DNA‬‬ ‫את הג'ל מניחים בתוך נוזל בו עובר זרם חשמלי‪.‬‬ ‫ ‬ ‫המטען השלילי של ה‪ DNA‬יביא לתנועתו מהאנודה לקטודה‪.‬‬ ‫ ‬ ‫משיטת ההפרדה ניתן ללמוד על הגודל המקטעים ועל ריכוז ה‪.DNA‬‬ ‫חיתוך ‪ DNA‬בעזרת ‪:DNase‬‬ ‫‪ DNase‬הוא אנזים מסוג דהאוקסי ריבונוקליאז‪ ,‬הוא חותך את ה‪ DNA‬בשלד הפוספו‪-‬די אסתרי בצורה‬ ‫לא ספציפית‪ ,‬האזנים יכול לחתוך גדיל בודד או סליל כפול וכרומטין‪.‬‬ ‫ניסוי ‪-MICA‬‬ ‫החומר ‪ MICA‬קושר את סליל ה‪ ,DNA‬לאחר מכן הוסיפו את‬ ‫האנזים ‪ DNase‬וראו שהתקבלו מולק' ‪ DNA‬באורכים שהם‬ ‫כפולות של ‪ 10‬או ‪.11‬כלומר‪ ,‬מסקנת הניסוי הייתה כי אורך של‬ ‫סיבוב שלהם של ה‪ DNA-‬הוא ‪ 10.5‬זוגות בסיסים‪.‬‬ ‫טופולוגיה של ‪:DNA‬‬ ‫טופולוגיה היא המדע המתמטי של צורות ואזורים טופולוגיות‪.‬‬ ‫מבנה ה‪ DNA-‬הוא גמיש והפרמטרים המבניים שלו תלויים בתנאי הסביבה היונית ובחלבונים‬ ‫שקשורים אליו‪.‬‬ ‫מולקולות ביולוגיות הן מוגבלות טופולוגית‪:‬‬ ‫מולקולות סגורות – מוגבלות בגלל קשרים קוולנטיים שסוגרים אותן‪.‬‬ ‫מולקולות לינאריות – מוגבלות מפאת אורכן‪ ,‬אריזתן בכרומטין ואינטראקציות עם מרכיבים תאיים‬ ‫אחרים‪.‬‬ ‫‪:Supercoiling‬‬ ‫הפרדה בין שני גדילי ה‪ DNA‬בזמן שעתוק יגרום להיווצרות של "פיתולי‬ ‫על" חיוביים באזורים שלא נפרדו‪.‬‬ ‫בתא‪ ,‬גם ‪ DNA‬ישר נמצא תחת אילוצים טופולוגיים‪.‬‬ ‫בסליל ההליקס הכפול שני גדילי ה‪ DNA‬מלופפים זה סביב זה‪.‬‬ ‫הגדילים יכולים להיפרד (ע"י חימום למשל)‪.‬‬ ‫גדילים ב‪ DNA‬שסגורים קוולנטית (‪ )ccc DNA – covalently closed circle‬לא יכולים להיפרד זה מזה‬ ‫עקב מגבלות טופולוגיות‪.‬‬  ‫בתא‪ ,‬אפילו ‪ DNA‬לינארי נמצא תחת מגבלות טופולוגיות‪.‬המגבלות הטופולוגיות רלוונטיות עבור‬ ‫"אריזה" של ה‪ ,DNA‬פרימה שלו בזמן שכפול ושעתוק וכן ליציבות ה‪.DNA‬‬ ‫ל‪ cccDNA-‬יש מספר סוגים של סיבובים הקשורים זה לזה במשוואה‪:‬‬ ‫‪ :Linking number‬מסומן ‪.Lk‬מספר הפעמים שגדיל אחד צריך להסתובב סביב הגדיל‬ ‫השני על מנת להפריד ביניהם לחלוטין‪ ,‬או במילים אחרות‪ ,‬מספר הפעמים שיש "לפתוח"‬ ‫קשר קוולנטי על מנת לנתק בין שני הגדילים‪.‬המספר הזה מורכב משני מרכיבים‬ ‫גיאומטריים – ‪ Twist‬ו‪.Writhe -‬המספר הזה תמיד יהיה מספר שלם ולא ישתנה כל עוד‬ ‫לא נשברו קשרים קוולנטיים‪.‬‬ ‫‪ :Twist number‬מסומן ‪.Tw‬מספר הסיבובים של ‪ 360⁰‬שהגדיל הכפול משלים‪.‬זה המספר של‬ ‫הסיבובים שקיימים בין שני גדילים "פתוחים" מבחינה טופולוגית שנמצאים בצורה חופשית בתמיסה‪.‬‬ ‫לרוב יהיה מספר לא שלם‪.‬‬ ‫𝑝𝑏 𝑓𝑜 𝑟𝑒𝑏𝑚𝑢𝑛 𝑙𝑎𝑡𝑜𝑡‬ ‫יחושב ע"י 𝑛𝑟𝑢𝑡 𝑟𝑒𝑝 𝑠𝑒𝑠𝑎𝑏 𝑓𝑜 𝑟𝑒𝑏𝑚𝑢𝑛 = 𝑤𝑇‬ ‫‪ :Writhe number‬מסומן ‪.Wr‬המספר הכולל של "פיתולי על" ב‪.cccDNA-‬יכול לקבל ערכים שלילים או‬ ‫חיוביים‪.‬‬ ‫נבדיל בין שני סוגי ‪writhe:‬‬ ‫‪ – Interwound writhe‬פיתול של‬ ‫המולקולה סביב עצמה‪.‬‬ ‫סיבוב ימני‪Wr>0 :‬‬ ‫סיבוב שמאלי‪Wr0‬‬ ‫סיבוב שמאלי ‪Wr ∆Lk‬פיתול על חיובי‬ ‫‪  0< ∆Lk‬פיתול על שלילי‬ ‫המשוואה המקשרת בין הגדלים‪:‬‬ ‫𝒓𝑾 ‪𝑳𝒌 = 𝑻𝒘 +‬‬ ‫במולקולה רפויה ‪.Wr=0 ,Lk=Tw‬ערך זה של ‪ Lk‬נקרא גם ‪.Lk⁰‬‬ ‫כאשר ‪ Wr‬ו‪ Tw-‬הם לאותו הכיוון יש פחות מתח במולק'‪.‬‬ ‫אצל רוב היצורים החיים ה‪ Wr-‬יהיה שלילי‪.‬זאת מכיוון שבמהלך הרפליקציה (כשה‪ DNA‬נפתח)‬ ‫נוצרים פיתולים חיוביים‪.‬ישנם אנזימים שמייצרים ב‪ DNA‬פיתולי על חיוביים על מנת לשמור על יציבות‬ ‫ה‪ DNA‬של חיידקים שחיים בגייזרים או בתנאים של טמפ' מאוד גבוהות‪.‬‬  ‫ישנה מולקולה בשם ‪.ethidium‬מולקולה זו נכנסת בין הבסיסים‬ ‫ויוצרת איתם אינטראקציות הידרופוביות (לכן לא מפריעה להם)‪.‬‬ ‫המולקולה מגדילה את הרווחים בין הבסיסים ולכן כל סיבוב‬ ‫יכיל פחות בסיסים‪.‬כלומר היא מקטינה את ה‪.Tw-‬שימו לב‬ ‫שה‪ Wr-‬יעלה בהתאם על מנת לשמור על ‪.Lk‬‬ ‫ניתן להפריד ולהבחין בין ‪ DNA‬במצבי קיפול שונים ע"י העברתו‬ ‫בג'ל אלקטרו‪-‬פורזה‪.‬‬ ‫המהירות שבה מולק' ‪ DNA‬נודדת בג'ל עולה ככל שמספר "פיתולי העל" שלה גדל‪.‬‬ ‫ישנם שני אנזימים שיכולים לשנות את ה‪ Lk‬של ה‪:DNA‬‬ ‫‪ – Topoisomerase I.1‬חותך גדיל יחיד של‬ ‫קומפלקס ה‪ ,DNA‬מעביר אותו דרך החיתוך‬ ‫ומשחרר סיבוב אחד‪.‬התהליך מעלה את ה‪Lk-‬‬ ‫ב‪.+1-‬‬ ‫שלבי הפעילות של האנזים‪:‬‬ ‫א‪.‬שייר טירוזין באתר הפעיל עובר דה‪-‬פרוטונציה ע"י שייר של‬ ‫חומצה אמינית בסיסית שכנה באתר הפעיל‪.‬‬ ‫ב‪.‬האוקסי‪-‬אניון תוקף את קבוצת הפוספט ב‪ '3-‬בסוכר‬ ‫הסמוך ונוצר תוצר ביניים בו האנזים קשור ל‪.DNA‬‬ ‫ג‪.‬האוקסיאניון שנוצר עובר פרוטונציה משייר של חומצה‬ ‫אמינית חומצית באתר הפעיל‪.‬‬ ‫ד‪.‬האנזים עובר שינוי קונפורמציה‬ ‫המפריד את גדיל ה‪DNA‬‬ ‫ה‪.‬הגדיל שלא נחתך עובר דרך האנזים‬ ‫והאנזים משנה שוב קונפורמציה‬ ‫המקרב את קצוות הגדיל שנחתך‪.‬‬ ‫ו‪.‬הריאקציה ההפוכה מתבצעת‬ ‫לסגירת הגדיל בשנית‪.‬אנרגית הקשר נשמרת והריאקציה לא דורשת השקעת אנרגיה‪.‬‬ ‫‪ – Topoisomerase II.2‬נקשר ל‪ ,DNA‬יוצר חתך‬ ‫כפול (של שני הגדילים) ומסובב אותו פעם אחת‪.‬‬ ‫התהליך מעלה את ה‪ Lk-‬ב‪.+2-‬האנזים משתמש‬ ‫באנרגיה מ‪ ATP‬על מנת לבצע את השינוי הזה‪.‬‬ ‫ישנם טיפולי סרטן שונים השמים את האנזים הזה‬ ‫כמטרה‪.‬זאת מכיוון שלאנזימים אלו תפקיד חשוב‬ ‫בשכפול ה‪( DNA‬על מנת לאפשר הפרדה של‬ ‫הגדילים יש צורך בשחרור המתח שקיים בפיתולים‪ ,‬בנוסף שחרור הפיתולים מספק אנרגיה‬ ‫לתהליך)‪.‬לכן‪ ,‬פגיעה באנזימים אלו תפגע ביכולת השכפול של התאים ותפגע בעיקר בתאים‬ ‫המתחלקים מהר כמו תאי סרטן‪.‬‬ ‫סיכום הטופולוגיה של ה‪:DNA-‬‬ ‫ה‪ DNA‬מוגבל טופולוגית כאשר הוא בצורה של ‪ cccDNA‬או כאשר הוא מוחזק ע"י חלבונים‬ ‫ ‬ ‫מייצבים‪.‬‬ ‫טופואיזומראז יכולים לשנות את ה‪ Lk-‬של ה‪ DNA‬ובכר ליצור פיתולי על‪.‬‬ ‫ ‬ ‫הורדה של ‪ Lk‬יוצרת פיתולי על שליליים‪.‬‬ ‫ ‬ ‫מבנה ה‪:RNA‬‬ ‫‪ RNA‬מכיל ריבוז ואורציל בד"כ בנוי מגדיל אחד‪.‬‬ ‫ה‪ RNA‬בעל נטייה להתקפל על עצמו וליצור אזורים של הליקס כפול‬ ‫וכן ליצור מבנים שלישוניים מורכבים‪.‬‬ ‫אנזימים מסוימים הם ‪ ,RNA‬הוכחה נוספת לכך שה‪ RNA‬נוצר ראשון‬ ‫מבחינה אבולוציונית‪.‬‬ ‫ה‪ RNA-‬הוא לא חומר גנטי‪ ,‬הוא משמש בתור ‪,mRNA‬‬ ‫‪.Catalyst RNA ,regulatory RNA ,rRNA ,tRNA‬‬ ‫מבנה גדיל ה‪ RNA-‬דומה למבנה גדיל בודד של ‪,DNA‬‬ ‫ההבדלים הם בסוג הסוכר שכן ב‪ RNA-‬מדובר בריבוז‬ ‫לעומת דאוקסיריבוז ב‪ DNA-‬וכן הבסיס ‪ T‬מתחלף בבסיס‬ ‫‪.U‬‬ ‫בסיסי ה‪ RNA‬עוברים שינויים ומודיפיקציות רבות יותר‬ ‫מאשר בסיסי ה‪.DNA-‬‬ ‫קבוצת ה‪ OH‬בפחמן '‪ 2‬בריבוז היא קבוצה פונקציונלית שאינה קשורה בשלד הפוספודיאסטרי ולכן‬ ‫מאפשרת ל‪ RNA‬לבצע מגוון תגובות‪ ,‬מצד אחד ייתרון ומצד שני חיסרון מאחר והופכת את ה‪RNA‬‬ ‫למולק' פחות יציבה‪.‬‬ ‫מבנה שניוני של ה‪:RNA-‬‬ ‫במולקולת ה‪ RNA‬רצפים משלימים מתחברים ליצירת מבנה דו גדילי‬ ‫בעוד ששאר האזורים יוצרים לולאות ("‪ )"loop out‬וכך נוצרים מגוון של‬ ‫מבנים‪.‬‬ ‫ישנם גם מבנים של טטרה‪-‬לופים (‪ )tetraloops‬בהם נוצרות אינטאקציות‬ ‫מערום במייצבות את המבנה‪.‬‬  ‫מבנה שניוני נוסף הוא ‪.pseudoknot‬המבנה נוצר ע"י זיווג‬ ‫בסיסים משלימים שאינם נמצאים ברצף‪.‬‬ ‫לסיכום‪ ,‬ל‪ RNA-‬יש יכולת ליצור מגוון אינטראקציות תוך‬ ‫מולקולריות בשונה מה‪ ,DNA-‬וכך ליצור מבנים שניוניים ושלישוניים וכן אתרים פעילים‪.‬‬ ‫קישור לא ספציפי של ה‪:RNA-‬‬ ‫המבנה של הבסיסים מאפשר יצירת קשרי מימן בין גואנין ואורציל ולא רק בין אורציל וארגנין‪.‬‬ ‫מאחר ויש אפשרות ליצור קשרים לא ספציפיים ל‪ RNA-‬יש מגוון גדול יותר לזיווג בסיסים‪.‬‬ ‫‪:Regulatory RNA‬‬ ‫ביטוי גנים וירליים הרגיש תרמית‪.‬הגן הרגולטורי ‪ prfA‬בגנום‬ ‫של ליסטריה מבוקר בזמן שיעתוק ע"י אתר קישור לריבוזום‬ ‫המושפע מטמפרטורה ב‪.mRNA‬‬ ‫‪:Triple base pearing‬‬ ‫ל‪ RNA-‬אפשרויות לקישור לא רגיל בין בסיסים‪.‬למשל אורציל יכול‬ ‫להיקשר בשתי דרכים שונות לארגנין ובכך ליצר זיווג בסיסים משולש‪.‬‬ ‫הידרוליזה בסיסית של ‪:RNA‬‬ ‫בסביבה בסיסית ‪ RNA‬עובר הידרוליזה‪:‬‬ ‫‪.1‬יון הידרוקסיל תוקף את הקבוצה ההידרוסילית ב‪ 2'-‬ומשאיר חמצן‬ ‫עם זוג אלק' חופשיים‪.‬‬ ‫‪.2‬החמצן הטעון שלילית תוקף את הפוספט '‪ 3‬ומנתק את הקשר שלו‬ ‫עם ה‪ 5'-‬בריבוז הבא בשרשרת‪.‬‬ ‫‪.3‬החמצן החופשי משלים את המימן ממולקולת מים (ההופכת‬ ‫להידרוקסיל)‬ ‫לריאקציה שני תוצרים‪:‬‬ ‫א‪.‬ריבוז שאינו קשור לפוספט שנותר מחובר‬ ‫לגדיל ‪RNA‬‬ ‫ב‪.‬מצב ביניים לא יציב ‪2',3', cyclic‬‬ ‫‪ nucleoside monophosphate‬גם הוא‬ ‫נותר מחובר לגדיל ‪.RNA‬‬ ‫תוצר ב' מתפרק גם הוא‪:‬‬ ‫‪.1‬הידרוקסיל חופשי תוקף את הפוספט‬ ‫הציקלי‪.‬‬ ‫‪.2‬הפוספט מתנתק מאחד הפחמנים‬ ‫ונקשר לפחמן '‪ 2‬או לפחמן '‪.3‬‬  ‫‪:RNase P‬‬ ‫‪ RNase‬הוא אנזים הבנוי מ‪ ,RNA‬הוא נמצא במרבית היצורים החיים‪ ,‬בדרך כלל מיוצב ע"י‬ ‫חלבון אחר‪.‬תפקידו הוא לחתוך את ה‪.tRNA‬‬ ‫‪:Hammerhead Ribozyme‬‬ ‫רנ"א ראש‪-‬פטיש הוא תת‪-‬רצף רנ"א הנמצא בגנום של וירוסים של צמחים והוא בעל יכולת‬ ‫קטליטית גם של פירוק וגם של ליגציה (חיבור)‪.‬אסטרטגיית השכפול של וירואידים היא‬ ‫סינתוז החומר הגנטי שלהם "ראש‪-‬זנב"‪ ,‬כלומר איך שאחד נגמר השני מתחיל ואז השלישי‬ ‫ואז הרביעי‪.‬משהו צריך לחתוך את הרצפים של הרנ"א לרצפי וירואיד בעלי משמעות‪RNA ,‬‬ ‫ראש פטיש עושה זאת‪.‬‬ ‫סיכום מבנה ה‪:RNA‬‬ ‫ה‪ RNA-‬שונה מה‪:DNA-‬‬ ‫‪.1‬מכיל ריבוז ולא דאוקסיריבוז‬ ‫‪.2‬מכיל את הבסיס בפרימידין אורציל במקום טימין‬ ‫‪.3‬בד"כ מתקיים כגדיל בודד‬ ‫‪.4‬בעל היכולת להתקפל על עצמו וליצור סיבובים והליקסים כפולים‬ ‫‪.5‬יכול ליצור מבנים שלישוניים מורכבים‬ ‫‪.6‬חלק מה‪ RNA‬הם אנזימים‬ ‫‪ RNA.7‬ראש פטיש הוא ‪ RNA‬שחותך את עצמו ויוצר מבנה פוספט ציקלי‪.‬‬  ‫מבנה הגנום‪ ,‬כרומטין והנוקלאוזום‪:‬‬ ‫בתא‪ DNA ,‬קשור לחלבונים וארוז בצורה של כרומוזומים‪.‬‬ ‫האריזה של ה‪ DNA‬לכרומוזומים מאפשרת‪:‬‬ ‫‪.1‬כניסה של מולק' ה‪ DNA‬הארוכה לתוך‬ ‫התא‪.‬גנום הפלואידי של אדם מגיע לאורך‬ ‫של כמטר בעוד שקוטר הגרעין הוא ‪10-‬‬ ‫‪ 15‬מירקו מטר‪.‬‬ ‫‪.2‬הגנה על ה‪ DNA‬מפגיעות‬ ‫‪.3‬מעבר יעיל של ה‪ DNA‬לתאי הבת‬ ‫‪.4‬רגולציה ונגישות ל‪.DNA‬‬ ‫כרומוזומים יכולים להיות מעגליים או לינאריים‪.‬‬ ‫כל תא מכיל מספר מסוים של כרומוזומים כאשר‬ ‫גודל הגנום בדרך כלל קשור לרמת המורכבות‬ ‫של האורגניזם‪ ,‬אך ישנם יוצאים מן הכלל‪.‬‬ ‫צפיפות הגנים – מדד לכמות ה‪ DNA‬שמקודד‬ ‫לגנים לעומת ה‪ DNA‬כולו‪.‬ה‪ DNA‬של חיידקי‬ ‫‪ E.coli‬למשל מכיל כ‪ 30%-‬גנים לעומת ה‪DNA‬‬ ‫של האדם שמכיל כ‪ 1.5%-‬גנים‪.‬‬ ‫באופן כללי‪ ,‬לאורגניזמים מורכבים יותר יש‬ ‫צפיפות גנים נמוכה יותר‪.‬הגנים הם רק חלק‬ ‫קטן מה‪ DNA‬של יצורים איאוקריוטים‪.‬‬ ‫רוב ה‪ DNA‬האנושי מורכב מרצפים שחוזרים על‬ ‫עצמם‪.‬‬ ‫בניסוי בו החליפו את רצף תחילת השיעתוק בחיידקי ‪ E.coli‬ברצף‬ ‫של ‪ DNA‬לינארי ראו כי אין השפעה על קצת ההתרבות של‬ ‫החיידקים כתוצאה מהשינוי‪.‬‬ ‫יצורים דומים יכולים להיות בעלי מספר שונה מאוד של כרומוזומים‪,‬‬ ‫זה לאו דווקא מעיד על גודל הגנום‪.‬‬ ‫בתאים פרוקריוטים ה‪ DNA‬אינו ארוז באותה דחיסות כמו בתאים‬ ‫איאוקריוטים‪ ,‬בתאים פרוקריוטים החומר הגנטי ארוז בנוקלואיד‬ ‫שנמצא בציטוזול‪ ,‬מה שהמאפשר צימוד של תהליך השיעתוק‬ ‫והתרגום‪ ,‬בעוד שבתאים איאוקריוטים התהליכים מתרחשים‬ ‫במדורים נפרדים‪.‬‬  ‫תכולת הגנום האנושי‪:‬‬ ‫הפרדת והכפלת כרומוזומים‪:‬‬ ‫כרומוזומים איאוקריוטים צריכים צנטרומרים‪ ,‬טלומרים ומקור תחילת שעתוק‪.‬‬ ‫תהליכי שכפול והפרדת הכרומוזומים‬ ‫מתרחשים בשלבים שונים במחזור התא‪.‬‬ ‫מבנה הכרומוזומים משתנה כאשר התא‬ ‫מתחלק‪.‬‬ ‫הקישור בין כרומטידות אחיות ורמת‬ ‫הדחיסות של הכרומוזומים מתווכים ע"י‬ ‫חלבונים מבניים‪.‬‬ ‫אריזת ‪ DNA‬בתאים פרוקריוטים‪:‬‬ ‫ישנה שמירה על איזון אופטימלי בין פיתולי על חיוביים ושליליים בעזרת האנזימים טופו ‪ I‬וטופו ‪( II‬נקרא‬ ‫גם ‪.)DNA gyrase‬‬ ‫חלבונים מבניים מכופפים ומלפפים את ה‪.)FIS( DNA‬‬ ‫ישנם אנזימים האחראיים על שימור מבנה הכרומוזומים המגשרים בין מקטעי ה‪ DNA‬ויוצרים לולאות‬ ‫(‪.)SMC‬‬ ‫הגנום של החיידקים מרוכז סביב ליבה חלבונית באזור מוגדר שנקרא נוקלואיד אך‬ ‫הוא חסר ממברנה‪.‬‬ ‫רמות אריזה של ה‪:DNA‬‬ ‫‪ DNA.1‬מלופף להליקס כפול‬ ‫‪.2‬מבנה הכרומטין הנראה כמו חרוזים על חוט ‪"beads on a string"-‬‬ ‫‪.3‬סיב כרומטין בעובי ‪ nm 30‬ארוז לנוקלאוזומים‬ ‫‪.4‬מקטעי כרומוזום במבנה מורחב‬  ‫‪.5‬כרומוזום מכווץ‬ ‫‪.6‬כרומוזום מיטוטי שלם‬ ‫אריזת הכרומטין והנוקליאוזום‪:‬‬ ‫הנוקליאוזומים הם רמת האריזה הראשונה של ה‪.DNA‬‬ ‫הם מורכבים מליבה בה ארבעה סוגי היסטונים בעלי תכונות‬ ‫ביוכימיות ומבניות דומות‪:‬‬ ‫עשירים בח"א טעונות חיובית (ליזין וארגנין) – זאת על‬ ‫ ‬ ‫מנת לאפשר קישור טוב עם ה‪ DNA‬הטעון שלילית‪.‬‬ ‫בעלי מבנים חוזרים של אלפא הליקס‬ ‫ ‬ ‫בעלי "זנב" חסר מבנה (שיירים אלה מכילים מידע‪,‬‬ ‫ ‬ ‫בהמשך נראה את חשיבותו‪ ,‬טיפול בנוקליאוזום עם‬ ‫טריפסין יגרום לחיתוך ספציפי של ה"זנבות" של ההיסטונים)‪.‬‬ ‫הרכבת ליבת הנוקליאוזום‪:‬‬ ‫‪.1‬הרכבת טטרה‪-‬מר משתי יחידות ‪ H3‬ו‪ H4-‬ודימר‬ ‫מ‪ H2B-‬ו‪.H2A-‬‬ ‫‪.2‬ליפוף ‪ DNA‬סביב ‪ H3‬ו‪.H4-‬‬ ‫‪.3‬הצטרפות של שני דימרים של ‪ H2B‬ו‪.H2A-‬‬ ‫עיכול עדין של הכרומטין באמצעות נוקלאז והרצה בג'ל נותן מקטעים בכפולות של ‪ 200‬זוגות בסיסים‪,‬‬ ‫בעוד שעיכול ממושך נותן מקטעים של ‪ 147‬בסיסים‪.‬‬ ‫ההסבר לזה הוא שמקטעי ה‪ DNA‬המלופפים סביב ההיסטונים הם מקטעים של ‪ 147‬זוגות בסיסים‪,‬‬ ‫בעוד שמקטעי ה‪ DNA‬בין הנוקליאוזומים הם מקטעים של בין ‪ 20‬ל‪ 60‬זוגות‬ ‫בסיסים‪.‬עיכול מהיר יחסית יפרק את הנוקליאוזומים בין לבין מקטעי הביניים בעוד‬ ‫שזמן עיכול ממושך יגרום לפירוק של כלל ה‪ DNA‬שלא בא במגע עם ההיסטונים‪.‬‬ ‫נוקליאוזומים של ארכיאות מכילים רק את ההיסטונים ‪ H3‬ו‪ H4‬וסביבם מלופפים רק‬ ‫כ‪ 60‬זוגות בסיסים‪.‬‬ ‫טופולוגיה של ‪ DNA‬סביב היסטונים‪:‬‬ ‫ה‪ DNA-‬מלופף סביב ההיסטונים ב‪ Spiral writhe-‬שמאלי (כלומר שלילי)‪.‬‬  ‫כאשר ‪ cccDNA‬מתלפף סביב היסטונים בתמיסה (ללא‬ ‫טופו) נוצר ‪ spiral writhe‬שמאלי סביב ההיסטונים‪.‬‬ ‫ה‪ LK-‬הכללי נשמר‪ ,‬כלומר‪ ,‬נוצר ‪interwound writhe‬‬ ‫שמאלי (חיובי) ב‪( DNA‬ליפוף של המולקולה סביב‬ ‫עצמה)‪.‬‬ ‫בתאים‪ ,‬האנזים טופו פועל לשמירת המצב הרפוי של‬ ‫ה‪ DNA‬ולכן מסיר את ה‪interwound writhe‬‬ ‫אם ניתן לנוקליאוזומים להמשיך בהתארגנותם בנוכחות‬ ‫טופו‪ ,‬נקבל ‪ cccDNA‬מלופף כולו סביב היסטונים‪.‬‬ ‫הקישור בין ה‪ DNA‬וההיסטונים מתבצע באופן לא‬ ‫ספציפי דרך התעלה הצרה של ה‪.DNA‬‬ ‫זוג הבסיסים ‪ A-T‬הוא בעל נטייה להתכופף לכיוון‬ ‫התעלה הצרה‪ ,‬בעוד שלזוג הבסיסים ‪ G-C‬יש את‬ ‫הנטייה ההפוכה‪ ,‬רצפים שהם בעלי חזרתיות ברצף‬ ‫הבסיסים ‪ T-A‬ו‪ G-C‬כל ‪ 5‬זוגות בסיסים הם‬ ‫האופטימליים ליצירת הנוקליאוזומים‪.‬‬ ‫היסטון ‪:H1‬‬ ‫מבצע כיפוף נוסף של ה‪ DNA‬סביב ההיסטונים‪.‬הוא מגן על ‪ 20‬זוגות בסיסים‬ ‫ ‬ ‫נוספים מעיכול ע"י אנזימים‪.‬‬ ‫הקישור של היסטון ‪ H1‬מייצר זווית מוגדרת יותר עבור תחילת וסיום‬ ‫ ‬ ‫הנוקליאוזום‪.‬‬ ‫מייצב את מבנה הכרומטין ה"גבוהה" יותר (הבא בשלבי הארגון)‬ ‫ ‬ ‫גישה ל‪ DNA‬הארוז בצורת נוקליאוזום‪:‬‬ ‫אם נרצה לגשת לאזור ב‪ DNA‬שמלופף סביב נוקליאוזום יש צורך בהתרה של‬ ‫הליפוף הזה‪.‬‬ ‫ישנם אזורים שהגישה אליהם יכולה להיות יותר קלה‪ ,‬לאזורים‬ ‫אלה יקשרו חלבונים שיובילו להתרה של הליפוף בתדירות‬ ‫גבוהה יותר‪.‬‬ ‫בין הנוקליאוזומים ישנו אזור של ‪ DNA‬חשוף שהגישה אליו‬ ‫אינה בעייתית‪.‬‬ ‫לפעמים יש צורך בהזזה של הנוקליאוזומים‪ ,‬אפשר לבצע החלקה‬ ‫או פירוק של הנוקליאוזומים או להחליף את ההיסטונים בין‬ ‫נוקליאוזומים שונים‪ ,‬כל הפעולות הללו לא מתבצעות בצורה‬ ‫ספונטנית אלא דורשות אנרגיה‪ ,‬המתווכים של השינויים האלה‬ ‫הם קומפלקסים שנקראים ‪nucleosome-remodeling‬‬ ‫‪.complexes‬הקומפלקסים הללו מכילים בין ‪ 8‬ל‪ 16‬תתי יחידות‪.‬הם יודעים להיקשר לנוקליאוזום דרך‬ ‫אתרי קישור (ברומו‪-‬דומיין‪ ,‬כרומו‪-‬דומיין‪.histone-binding domain )...‬‬ ‫בעזרת חלבונים שונים יש אפשרות גם למקם את הנוקליאוזומים במקומות ספציפיים‪.‬‬ ‫מודיפיקציה של היסטונים‪:‬‬ ‫זנבות ההיסטונים יכולים לעבור מודיפיקציות שונות‪.‬‬ ‫המודיפיקציות מאפשרות ביטוי או דיכוי של גנים שונים‪.‬‬ ‫רוב המודיפיקציות ימוקמו על הקצה ה‪ N‬טרמינלי של החלבון‪ ,‬לעומת‬ ‫זאת סימון של יוביקויטון ימוקם בקצה ה‪ C‬טרמינלי והוא יסמן לתא‬ ‫לפרק את ה‪.DNA‬‬ ‫אתרי המודיפיקציה בזנבות ההיסטונים מזוהים ע"י חלבונים‬ ‫ספציפיים‪.‬‬ ‫אצטילציה מזוהה ע"י ברומודומיינים ומתילציה מזוהה ע"י‬ ‫כרומודומיין‪ ,‬הדומיינים הללו הם חלק מהחלבון שיודע לזהות את‬ ‫השיירים הספציפיים האלה והם חלק מקומפלקס החלבונים‬ ‫שיודעים לבצע את הפעולה הרצויה‪.‬‬ ‫בזמן רפליקציה של ה‪ DNA‬יש צורך לפרק את‬ ‫הנוקליאוזומים‪ ,‬נוצרים שני גדילים‬ ‫והאינפורמציה צריכה להתחלק בין שניהם‪,‬‬ ‫לאחר הרפליקציה יש צורך בשחזור‬ ‫הנוקליאוזומים‪.‬‬ ‫הנוקליאוזומים החדשים שנבנים מורכבים‬ ‫בחלקם מהיסטונים חדשים ובחלקם‬ ‫מהיסטונים "ישנים"‪.‬‬ ‫ההיסטונים המקוריים מתחלקים‬ ‫באופן סטטיסטי חצי חצי בין שני‬ ‫הגדילים‪ ,‬והאינפורמציה שקיימת‬ ‫עליהם משמשת לצורך השלמה של‬ ‫האינפורמציה הנדרשת על ההיסטונים‬ ‫החדשים‪(.‬בתמונה ניתן לראות‬ ‫שההיסטונים המקוריים הכילו סימונים‬ ‫של אצטילציות‪ ,‬לאחר הרפליקציה קומפלקס שמכיל ברומו‪-‬דומיין ואנזים‬ ‫שמבצע אצטילציה נקשרו לנוקליאוזום וביצעו את המודיפיקציה הנדרשת ל‪ DNA‬החדש)‬ ‫הבנייה של ההיסטונים החדשים דורשת גם היא קומלפקסים של חלבונים שנקראים ‪histone‬‬ ‫‪ chaperones‬והם עובדים קרוב למזלג הרפליקציה‪ ,‬נקשרים בעזרת הדומיינים ומסייעים בבנייה מהירה‬ ‫של ההיסטונים והנוקליאוזומים‪.‬‬  ‫‪ CAF-1‬מוסיף טטרמר על גדיל החדש‪ ,‬בהתאם ל‪.PCNA‬‬ ‫‪ Asf1‬מעורב בתהליך‬ ‫‪ NAP-1‬עוזר בהרכבת הדימרים על הנוקליאוזום שנוצר‪.‬‬ ‫סיכום‪:‬‬ ‫ה‪ DNA‬מאורגן במבנים גדולים שנקראים כרומוזומים‬ ‫ ‬ ‫חצי מהכרומוזומים הם חלבונים‬ ‫ ‬ ‫אורגניזמים מפותחים משתמשים רק בחלק קטן מה‪ DNA‬שלהם לקידוד חלבונים‬ ‫ ‬ ‫תאים צריכים לשמר את מבנה הכרומוזומים בזמן ההתחלקות‬ ‫ ‬ ‫‪ DNA‬איאוקריוטי עם החלבונים שאורזים אותו נקרא כרומטין‬ ‫ ‬ ‫יחידת הבסיס של הכרומטין היא הנוקליאוזום‬ ‫ ‬ ‫הנוקליאוזום בנוי מ‪ 2‬העתקים של ההיסטונים שמרכיבים אותו (‪ )H2A, H2B, H3,H4‬ומבערך‬ ‫ ‬ ‫‪ 147‬זוגות בסיסים‬ ‫ישנו היסטון חמישי שנקרא ‪ H1‬מסייע בדחיסה נוספת של המבנה‬ ‫ ‬ ‫האינטראקציה של ה‪ DNA‬עם ההיסטונים היא דינאמית‪nucleosome remodeling ,‬‬ ‫ ‬ ‫‪ complexes‬מאפשרים גישה לכרומטין‬ ‫מודיפיקציות על הזנבות של ההיסטונים מאפשרת גישה ל‪ DNA‬וביטוי או השתקה של גנים‬ ‫ ‬ ‫הנוקליאוזומים נוצרים מיד לאחר הרפליקציה‬ ‫ ‬ ‫בממוצע‪ ,‬כל נוקליאוזום חדש בנוי מ‪ 50%‬נוקליאוזום ישן‪.‬‬ ‫ ‬ ‫הגדרות‪:‬‬ ‫גנום‪ :‬כלל המידע הגנטי של האורגניזם‬ ‫ ‬ ‫כרומטין‪ :‬ה‪ DNA-‬עם החלבונים הקושרים‪ ,‬במבנים של ‪.30nm‬זהו מבנה ה‪ DNA‬שמצוי בגרעין‬ ‫ ‬ ‫התא בין שלבי החלוקה‬ ‫כרומוזום‪ :‬ה‪ DNA-‬עם החלבונים הקשורים אליו ברמת הדחיסה הגבוהה ביותר‪ ,‬הנושא את‬ ‫ ‬ ‫המידע הגנטי של האורגניזם (חלקו או כולו)‪.‬זהו המבנה בו מצוי המידע הגנטי לפני המיטוזה‬ ‫כרומטידה‪ :‬אחת מבין שתי זרועות זהות לחלוטין בכרומוזום המשוכפל‬ ‫ ‬ ‫כרומוזומים הומולוגיים‪ :‬כרומוזומים המזדווגים בעת המיוזה‪.‬אחד מבין שני עותקים של‬ ‫ ‬ ‫כרומוזומים בתא דיפלואידי‪ ,‬מכילים את אותם האתרים הגנטיים‪.‬‬ ‫שכפול ה‪:DNA-‬‬  ‫כאשר התגלה מבנה ה‪ ,DNA‬הייתה גם הבנה לצורך החלוקה והשכפול של ה‪.DNA‬‬ ‫היו ‪ 3‬תיאוריות לצורת השכפול של ה‪.DNA‬‬ ‫שני חוקרים ביצעו ניסוי על מנת לגלות את צורת השכפול‬ ‫וגילו שה‪ DNA‬מתחלק בצורה הסמי‪-‬קונסרבטיבית‪.‬‬ ‫החוקרים לקחו חיידקי ‪ E.coli‬וגידלו אותם במצע שהכיל‬ ‫את האיזוטופ הכבד של החנקן‪. 𝑁15 ,‬‬ ‫חומצות גרעין מכילות חנקן‪ ,‬כך נוצר ‪ DNA‬בעל צפיפות‬ ‫גבוהה יותר‪.‬‬ ‫ניתן להפריד ‪ DNA‬על סמך הצפיפות שלו ע"י צנטריפוגה‪,‬‬ ‫מתקבל גרדיאנט של צפיפויות‪ ,‬הצפיפות הגבוהה ביותר‬ ‫תהיה בתחתית המבחנה והצפיפות הנמוכה ביותר בחלקה‬ ‫העליון של המבחנה‪.‬‬ ‫לאחר שגידלו את החיידקים על מצע שמכיל את החנקן‬ ‫הכב ד העבירו אותם למצע חדש שמכיל את החנקן הרגיל‪.‬לאחר חלוקה אחת בודדו את ה‪ ,DNA‬אחרי‬ ‫החלוקה הראשונה הצפיפות של כל ה‪ DNA‬הייתה בדיוק חצי‪ ,‬כלומר כל מולק' ‪ DNA‬הכילה גדיל ישן‬ ‫וגדיל חדש‪.‬לאחר שתי חלוקות‪ ,‬קיבלו חלק שהוא כולו קל‪ ,‬ומורכב מגדילים חדשים וחלק שעדיין‬ ‫מורכב מחצי גדילים כבדים וחצי קלים‪.‬‬ ‫סינתזת ה‪:DNA‬‬ ‫סינתזה של ‪ DNA‬דורשת שלושה מרכיבים‬ ‫‪.1‬נוקליאוטידים בצורתם כ‪dNTP's-‬‬ ‫‪G,C,T,A‬‬ ‫‪.2‬פריימר‪PTJ – Template Junction :‬‬ ‫הפריימר מורכב מנוקליאוטידים של ‪RNA‬‬ ‫זאת מכיוון ש‪ RNA‬לא זקוק לפריימר‪.‬‬ ‫ה‪ DNA‬משוכפל מקצה ‪ '5‬לקצה ‪.'3‬‬ ‫‪.3‬האנזים ‪ DNA‬פולימראז‬ ‫‪ DNA‬פולימראז מכיל שלושה דומיינים‪:‬‬ ‫"כף היד"‪ -‬בה יש שני אתרים פעילים‪ ,‬באחד מתבצע‬ ‫א‪.‬‬ ‫פלמור ‪ DNA‬והשני הוא אתר לתיקון טעויות‪.‬‬ ‫"אצבעות" – תפקידן ליצור זווית של ‪ 90⁰‬בגדיל‬ ‫ב‪.‬‬ ‫התבנית‬ ‫"אגודל" – שומר על ה‪ PTJ-‬באתר הפעיל‪.‬‬ ‫ג‪.‬‬  ‫האתר הפעיל של ‪ DNA‬פולימראז יכול להבחין בין בסיסים מסוג ‪ dNTP‬ו‪-‬‬ ‫‪ rNTP‬באמצעות ‪ discriminator amino acids‬שמונעת את ההיקשרות‬ ‫של הריבוז לאתר הפעיל‪.‬דבר נוסף שייחודי ל‪ DNA‬פולימראז היא העובדה‬ ‫שהוא יודע לזהות את כל ‪ 4‬הבסיסים של ה‪ DNA‬ולקשור אותם באתר‬ ‫הפעיל שלו‪.‬‬ ‫ייצוב הבסיסים מתבצע באמצעות ‪ 3‬גורמים‪:‬‬ ‫‪ Base stacking.1‬עם טירוזין – לאחר שהבסיס‬ ‫המתאים נכנס ההליקס נסגר‪.‬הטירוזין יוצר‬ ‫אינטראקציות מערום עם הבסיס שנכנס‪,‬‬ ‫אינטאקציה זו מייצבת את הבסיס‬ ‫‪.2‬שני יונים מתכתיים‪ -‬בד"כ מגנזיום‪.‬הם מסייעים‬ ‫בביצוע הריאקציה‪.‬‬ ‫יון ‪ A‬יושב בצורה כזו שיכול ליצור אינטאקציה עם‬ ‫הידרוקסיל ‪ ,'3‬ובכך מייצב את המטען השלילי ומעודד אותו למסור‬ ‫את הפרוטון‪ ,‬בעצם הופכת אותו ליותר נוקלאופילי‪.‬‬ ‫יון ‪ B‬יכול לעשות קואורדינציה עם המטענים השליליים של‬ ‫הפוספטים ובכך ממסך את המטען השלילי של הפוספטים על‬ ‫מנת למנוע דחייה בין הפוספטים‪.‬‬ ‫אנזימים שעובדים על חומצות גרעין משתמשים במתכות כדי‬ ‫לסייע בקטליזה‪ ,‬אם נסלק את המתכות האנזים לא יהיה פעיל‪,‬‬ ‫סילוק שכזה יכול להתבצע ע"י קילטורים‪ ,‬חומרים שקושרים את‬ ‫המתכות באפיניות גבוהה יותר (למשל ‪ – EDTA‬קושר מגנזיום‪,‬‬ ‫כך נוכל לשמור ‪ DNA‬לתקופות ארוכות)‬ ‫‪.3‬אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם ליזין וארגנין – לאחר סגירת‬ ‫ההליקס‪ ,‬הליזין והארגנין (טעונות חיובית) יוצרות קשרים עם‬ ‫הפירו‪-‬פוספט שעומד להשתחרר‪.‬‬ ‫כאשר הגדיל של ה‪ DNA‬נכנס לאתר הפעיל הוא עובר קיפול מסוים על מנת להרחיק בין שני בסיסים‬ ‫סמוכים‪ ,‬זאת על מנת שלא יקרה מצב שבו שני בסיסים נמצאים בו זמנית באתר הקטליטי של האנזים‪,‬‬ ‫דבר שיכול להוביל להיקשרות שגויה או דילוג על בסיסים‪.‬‬ ‫התארכות הגדילים באמצעות התקפה נוקליאופילית‪:‬‬ ‫‪.1‬התאמת הבסיס‬ ‫‪.2‬שינוי קונפורמציה של דומיין ה"אצבעות" (מערום עם טירוזין)‬ ‫‪.3‬דה פרוטונציה להידרוקסיל ‪ '3‬בגדיל הפריימר (ע"י יון ‪ ,)A‬נוצר חמצן שלילי שתוקף את הפוספט‬ ‫אלפא בבסיס החדש‬ ‫‪.4‬ייצוב של הפירו פוספט (ע"י יון ‪ ,B‬ליזין וארגנין)‬  ‫יצירת קשר פוספו‪-‬דיאסתרי‪:‬‬ ‫קירוב הבסיס החדש ויצירת קשרי מימן בין הבסיסים‬ ‫אוקסי‪-‬אניון ‪ '3‬בגדיל הפריימר תוקף את פוספט אלפא ב‪ dNTP-‬החדש‬ ‫האנרגיה ליצירת הקשר מתקבלת מפירוק הפירו‪-‬פוספט (פוספטים ביתא וגמא)‬ ‫האנזים פירופוספטאז מפרק את הקשר בין שני הפוספטים של הפירופוספט ובכך מספק עוד אנרגיה‬ ‫לתהליך הפלמור של ה‪.DNA‬מטרה נוספת של פירוק הפירופוספט היא בעצם לפרק את אחד התוצרים‬ ‫של התהליך ובכך התגובה הופכת לבלתי הפיכה‪.‬‬ ‫ניתן לעקוב אחר ריאקציית הפלמור ע"י סימון רדיואקטיבי של הנוקליאוטידים בפוספט או חנקן‬ ‫רדיואקטיבי‪.‬זה הופך את ה‪ DNA‬לרדיואקטיבי או פלורסצנטי‪.‬‬ ‫כאשר הריאקציה מבוצעת במעבדה אנו יכולים להפריד יחסית בקלות בין הנוקליאוטידים המסומנים‬ ‫לגדיל ה‪ DNA‬הגדול באמצעות נייר פילטר טעון חיובית‪ ,‬מאחר וה‪ DNA‬הוא טעון שלילית הוא נדבק‬ ‫לנייר הפילטר והנוקליאוטידים הקטנים עוברים דרכו‪.‬‬ ‫כך ניתן לבדוק כמה ה‪ DNA‬רדיואקטיבי או פלורסצנטי‪ ,‬ובעצם לעקוב אחרי פעילות האנזים‪.‬‬  ‫‪ DNA‬פולימראז הוא אנזים פרוססיבי‪.‬‬ ‫בד"כ בפעילות אנזים‪ ,‬נכנס סובסטרט ויוצא תוצר‪.‬במקרה הזה הפעולה‬ ‫של האנזים מתבצעת שוב ושוב על אותו סובסטרט‪ ,‬התבנית של ה‪.DNA‬‬ ‫אם אחרי כל הוספה של בסיס הגדיל היה משתחרר התהליך היה איטי‬ ‫בהרבה‪.‬‬ ‫אנזים פרוססיבי ממשיך את פעולתו מבלי לשחרר את הסובסטרט‪ ,‬בדיוק‬ ‫כפי ש‪ DNA‬פולימרז פועל‪.‬‬ ‫מנגנון תיקון טעויות‪:‬‬ ‫הטאוטומריזציה של הבסיסים גורמת לשינוי בקשרי המימן אותם הם‬ ‫יכולים ליצור‪.‬‬ ‫במידה ואחד הבסיסים נכנס בתצורת הטאוטומר הפחות יציב בדיוק ברגע‬ ‫הפלמור עלולים להיווצר זיווגי בסיסים שגויים‪.‬‬ ‫כאשר הבסיס יחזור לתצורה היציבה שלו תיווצר בעיה עם קשרי המימן‪,‬‬ ‫את הבעיה הזו האנזים יכול לזהות‪ ,‬כאשר הוא מזהה טעות שכזו הוא‬ ‫עוצר את הסינתזה ושולח את הגדיל לאתר פעיל נוסף שהוא‬ ‫‪ ,exonuclease‬כלומר‪ ,‬יודע לחתוך בסיס מהקצה של הגדיל‪.‬לאחר‬ ‫שהבסיס השגוי ירד הגדיל חוזר לאתר הפעיל והסינתזה ממשיכה‪.‬‬ ‫לתהליך הזה קוראים ‪.proofreading‬אם השגיאה לא זוהתה והאנזים‬ ‫המשיך הלאה בסינתזה הוא לא יוכל לחזור לאחר מכן ולתקן אותה‪ ,‬לשם‬ ‫כך ישנם מנגנונים אחרים‪.‬כל שגיאה שמתרחשת מאטה את פעולת האנזים‪.‬‬ ‫חומרים שמעכבים את הפעילות של ‪ DNA‬פולימראז יכולים לשמש כתרופות לטיפול בסרטן מאחר‬ ‫ותהליך החלוקה של התאים יפגע‪.‬‬ ‫החלבונים המעורבים בתהליך הרפליקציה‪:‬‬ ‫‪ DNA‬הליקאז‪:‬‬ ‫ ‬ ‫חלבון המפריד בין שני גדילי ‪ DNA‬באמצעות ‪.ATP‬‬ ‫מורכבים מ‪ 6-‬תתי יחידות שונות‪.‬קוטר האנזים הוא‬ ‫בדיוק קוטר של גדיל אחד של ה‪.DNA‬‬ ‫הם חלבונים פרוססיביים וקיים להם מנגנון מיוחד המאפשר את פתיחתם ומיקומם על גדיל‬ ‫ה‪.DNA‬להליקאז יש כיווניות עבור הפרימה של ה‪.DNA‬‬  ‫)‪:Single strand binding proteins (SSB's‬‬ ‫ ‬ ‫‪ DNA‬חד גדילי הוא מאוד רגיש‪ ,‬בנוסף התא יכול לזהות‬ ‫אותו ב‪ DNA‬זר‪ ,‬לכן יש צורך להגן עליו עד שהקומפלקס‬ ‫של מזלג הרפליקציה מגיע‪ SSB's ,‬הם חלבונים קואופרטיביים הנקשרים ל‪( ssDNA-‬אחרי‬ ‫הליקאז‪ ,‬לפני פולימראז) באמצעות קשרי מימן‪ ,‬ומגנים עליו‪.‬בנוסף הם שומרים שהגדילים לא‬ ‫יתחברו חזרה למבנים שניוניים ושלישוניים‪.‬‬ ‫טופואיזומראז ‪:2‬‬ ‫ ‬ ‫במהלך עבודתו של ההליקאז‪ ,‬ישנה השריה של פיתולי על‬ ‫חיוביים‪ ,‬בשלב מסוים נוצר לחץ על ה‪.DNA‬טופו‪ 2-‬מוריד‬ ‫את פיתולי העל כדי למנוע שבירה של ה‪.DNA-‬‬ ‫פרימאז‪:‬‬ ‫ ‬ ‫‪ RNA‬פולימראז המסנתז מקטעי ‪ RNA‬קצרים (פריימרים) לפי‬ ‫תבנית קיימת המשמשים כתחילית ל‪ DNA-‬פולימראז‪.‬‬ ‫‪ DNA‬פולימראז‪:‬‬ ‫ ‬ ‫חלבון היוצר פולימרים של ‪ DNA‬לפי תבנית ‪ DNA‬קיימת‬ ‫)‪:Sliding clamp protein (PCNA‬‬ ‫ ‬ ‫בעל תפקיד חשוב מאוד בפרוססיביות של תהליך השכפול‪.‬‬ ‫חלבונים העוטפים את קומפלקס הפולימראז‬ ‫עם ה‪ PTJ-‬ו"מדביקים" את החלבון ל‪ DNA-‬וכך‬ ‫מייצבים את החלבון ומגדילים את רציפות‬ ‫השכפול (פרוססיביות)‪.‬‬ ‫גם ה‪ PCNA‬הם קומפלקסים טבעתיים‪ ,‬הם‬ ‫מקיפים את ה‪ DNA‬ויוצרים אינטראקציה עם‬ ‫הפולימראז‪.‬‬ ‫‪:Sliding clamp loader‬‬ ‫ ‬ ‫חלבון המעמיס את ‪ PCNA‬על גדיל ה‪ DNA‬תוך שימוש באנרגיה מ‪.ATP‬חלבונים אלא מהווים‬ ‫את הבסיס לכל הקומפלקס במזלג ההכפלה‪.‬‬ ‫‪:RNase H‬‬ ‫ ‬ ‫אנזים המפרק את הפריימר מה‪.DNA-‬את הנוקליאוטיד האחרון מפרק אנזים בעל פעילות ‪5'-‬‬ ‫‪( exonuclease‬ה‪ H-‬משמעותו היברידי‪ ,‬כלומר‪,‬‬ ‫קשר ‪.)DNA:RNA‬‬ ‫‪ DNA‬ליגאז‪:‬‬ ‫ ‬ ‫מחבר את מקטעי ה‪ DNA-‬ע"י יצירת קשר פוספו‬ ‫די אסטרי באמצעות ‪.ATP‬‬ ‫מזלג הרפליקציה‪:‬‬ ‫ ‬ ‫אזור הצומת בו גדילי ה‪ DNA-‬נפרדים בעזרת‬ ‫‪.Helicase DNA‬מכיל את קומפלקס החלבונים המשתתפים בתהליך השכפול‪.‬‬  ‫‪:Origin of replication‬‬ ‫ ‬ ‫אתרים ספציפיים על גבי ה‪( DNA-‬עשירים בד"כ בבסיסים ‪ )AT‬אשר אליהם נקשרים חלבונים‬ ‫המסמנים את תחילת השכפול‪ ,‬ובהם נבנה מזלג הרפליקציה‪.‬‬ ‫כיווניות שכפול ה‪:DNA‬‬ ‫כאשר מפרידים בין הגדילים‪ ,‬גדיל אחד בעל כיווניות‬ ‫מתאימה לצורך הסינתוז‪ ,‬מכיוון ‪ '5‬ל‪ ,'3‬הכיווניות של‬ ‫הגדיל השני היא ‪ '3‬ל‪ '5‬ופה נוצרת בעיה משום ש‪DNA‬‬ ‫פולימראז לא יודע לסנתז בכיוון הזה‪.‬‬ ‫חוקר יפני בשם אוקזאקי גילה שה‪ DNA‬על הגדיל המשלים‬ ‫מסונתז במקטעים קטנים שנקראו על שמו‪ ,‬מקטעי‬ ‫אוקזאקי‪.‬‬ ‫על מנת להבין באיזה גדיל אנו עוסקים נקרא לגדיל ‪ '5‬ל‪leading strand '3-‬‬ ‫ולגדיל ‪ '3‬ל‪.lagging strand '5-‬‬ ‫החלבון ‪ DNA‬פרימאז‪ ,‬מייצר מקטעי פריימרים (‪ 5‬עד ‪ 10‬נוקליאוטידים)‬ ‫העשויים מ‪ RNA‬שמשמשים כפריימרים לסינתזה של ‪ RNA.DNA‬פולימראז יכול‬ ‫לעשות זאת מאחר והוא לא זקוק לפריימר על מנת להתחיל את הסינתזה‪.‬‬ ‫על הגדיל המוביל אנו זקוקים לפריימר אחד בלבד‪ ,‬על ה‪ lagging strand-‬אנו‬ ‫זקוקים למקטעים חוזרים שכאלה על מנת לבצע את הסינתזה‪.‬‬ ‫לאחר שהסינתזה הסתיימה‪ RNase H ,‬מגיע ומפרק את הפריימרים‪ ,‬עד‬ ‫לבסיס האחרון‪ ,‬את הנוקליאוטיד האחרון‪ ,‬מסיר אנזים אחר הנקרא '‪5‬‬ ‫‪ , exonuclease‬לאחר מכן ‪ DNA‬פולימראז חוזר ומשלים את הבסיסים‬ ‫הנדרשים‪ ,‬ו‪ DNA‬ליגאז מגיע ומבצע את החיבור האחרון על מנת ליצור את‬ ‫המולקולה הרציפה‪.‬‬  ‫מנגנון הפעולה של ‪ DNA‬ליגאז‪:‬‬ ‫ליגאז בונה קשר אסטרי בגדיל‪ ,‬על מנת לבנות את‬ ‫הקשר הזה דרושה אנרגיה‪ ,‬לכן יש צורך באיקטוב‬ ‫של הפוספט על מנת לאפשר את יצירת הקשר‪.‬‬ ‫את האנרגיה ליצירת הקשר הוא לוקח מ‪ ,ATP‬הוא‬ ‫מתחבר קוולנטית ל‪ ATP‬דרך קבוצה אמינית בשייר‬ ‫הצד של ח"א ליזין‪ ,‬ופירו‪-‬פוספט משתחרר‪.‬‬ ‫‪ AMP‬מחובר לקבוצה האמינית דרך הידרוקסיל ‪.'5‬‬ ‫נוצר קשר ‪.'5-'5‬‬ ‫בשלב השני האנזים מעביר את קבוצת הפוספט ‪'5‬‬ ‫שנמצא בשרשרת ה‪.DNA‬‬ ‫ישנו פירוק ויצירת של קשר ולכן אין צורך באנרגיה‬ ‫נוספת‪.‬‬ ‫בשלב השלישי‪ ,‬הפוספט בקצה ‪ '5‬משופעל (מאחר‬ ‫ויש לו קשר עתיר באנרגיה)‪ ,‬הידרוקסיל מקצה ‪'3‬‬ ‫תוקף את הפוספט‪ AMP ,‬משתחרר‪ ,‬ובעצם קיבלנו‬ ‫את הקשר שרצינו‪.‬‬ ‫מבנה ‪ DNA‬הולואנזים פולימראז ‪III‬‬ ‫ומודל הטרומבון‪:‬‬ ‫על ה‪ sliding clamp loader‬ישנן שלוש זרועות‬ ‫שנקראות חלבוני טאו‪ ,‬כאשר כל אחת מהן‬ ‫"מחזיקה" פולימראז‪.‬‬ ‫למודל השכפול קוראים מודל הטרומבון משום‬ ‫שהתנועה של ה ‪ lagging strand‬מזכירה‬ ‫תנועה של טרומבון‪.‬‬ ‫א‪ RNA.‬פרימאז מסנתז פריימר על‬ ‫ה‪.lagging strand‬אחד מחלבוני ה‪-‬‬  ‫‪ DNA‬פולימראז על ה‪ lagging strand‬מסנתז מקטע אוקזאקי‪.‬‬ ‫ב‪ RNA.‬פרימאז משוחרר ו‪ Sliding clamp‬נוסף "מוטען" על הגדיל עם הפריימר החדש‪.‬‬ ‫ג‪.‬הפולימראז השני של ה‪ lagging strand‬נקשר ל‪ sliding clamp‬על הפריימר ומתחיל בסינתזה‬ ‫של מקטע אוקזאקי נוסף‪.‬‬ ‫ד‪.‬הפולימראז הראשון של ה‪ lagging strand-‬משוחרר מה‪ DNA‬ומה‪ sliding clamp-‬לאחר‬ ‫שהשלים מקטע אוקזאקי‬ ‫ה‪.‬וכך הלאה עד לסיום הרפליקציה‪.‬‬ ‫הערות‪:‬‬ ‫‪.1‬על ה‪ – lagging strand-‬פרימאז ופולימראז כל הזמן מבצעים החלפה ביניהם‪ ,‬תהליך זה נקרא‬ ‫‪.switching‬‬ ‫‪.2‬על ה‪ lagging strand-‬פועלים שני פולימראזות על מנת להשוות את קצב השכפול שלו לקצב‬ ‫השכפול של ה‪.leading strand‬‬ ‫‪.3‬כאשר ‪ DNA‬הליקאז מתרחק מהקומפלקס של מזלג ההכפלה מהירות הפעילות שלו יורדת על‬ ‫מנת לא ליצור מצב שיש פרימה "מיותרת" של ה‪.DNA‬‬ ‫כיצד מתחילה הרפליקציה?‬ ‫הכי חשוב באתר שבו מתחילה הרפליקציה היא שתהיה‬ ‫אפשרות להפריד בין הגדילים על מנת שכל קומפלקס‬ ‫החלבונים יוכלו להיכנס ולהתחיל את השכפול‪.‬‬ ‫מודל הרפליקון אומר שישנו אתר שזמין יותר לפתיחה של‬ ‫הגדילים וישנו חלבון שיודע לזהות את האתר הזה ולסייע בתהליך‪.‬‬ ‫לאתר הזה קוראים ‪.origin of replication‬‬ ‫ה‪ ORI-‬בעל אתרים שמורים של ‪ 13‬ו‪ 9‬בסיסים (בחיידקי אי‪-‬‬ ‫קולי)‪ ,‬האתרים הירוקים (בציור) אלה הם אתרי הקשירה של‬ ‫החלבון שמתחיל את השכפול האתרים הכחולים עשירים ב‪A‬‬ ‫ו‪ T‬ולכן ניתן להפריד באזורים אל?