RNA Transcription - מבוא לנגיפים PDF

**RNA transcription** לא תמיד הגנום הווירוסי יכול לעבור מיד טרנסקריפציה אלא הוא צריך לעבור עיבוד מסויים קודם. למשל גנום לא שלם של וירוס ייכנס קודם לגרעין התא המאחסן ושם המנגנונים המאחסנים ״יתקנו״ את הגנום החסר. רק לאחר הציקון הוירוס יכול לעבור טרנסקריפציה. ברוב המקרים מי שמבצע את הציקון הוא רנא פו...

**RNA transcription** לא תמיד הגנום הווירוסי יכול לעבור מיד טרנסקריפציה אלא הוא צריך לעבור עיבוד מסויים קודם. למשל גנום לא שלם של וירוס ייכנס קודם לגרעין התא המאחסן ושם המנגנונים המאחסנים ״יתקנו״ את הגנום החסר. רק לאחר הציקון הוירוס יכול לעבור טרנסקריפציה. ברוב המקרים מי שמבצע את הציקון הוא רנא פולימראז 2 בבני האדם. ווירוסים שמתרבים בציטופלסמה לא נכנסים לתוך הגרעין להם צריכים להיות אחראיים על הרנא פולימראז שלהם, בין אם הוא מיוצר מהגנום שלהם ובין הוא מגיע שלם יחד עם הגנום לתא. כתוצאה מכך, לגנום הויראלי חייבים להיות פרומוטורים שלפחות חלקם מזוהים על ידי פקטורי השיעתוק של התא המאחסן. **Regulation of transcription** יש וירוסים בנגיפי דנא שיש להם רגולציה קסקדית, כלומר, קודם יש ביטוי של גנים מוקדמים, לאחר מכן רפליקציה של דנא ורק לאחר מכן יהיה ביטוי של גנים מאוחרים. יש וירוסים שיש להם רגולציה חיובית בה ייצור של חלבון מסויים מעודד את המשך הייצור שלו. **Cascade regulation of SV40** הוירוס הזה הוא דו-גדילי מעגלי ויש לו ORI שמתקדם בשני מזלגות הכפלה. לווירוס יש פרומוטור שיכול להתקדם לשני כיוונים -- בכיוון אחד הוא מייצר חלבונים שמופקים מגנים מוקדמים וכיוון אחר אחראי לביטוי של גנים מאוחרים. כאשר הוירוס נכנס לתוך התא, בשלב המוקדם (early fase) נקשרים אליו חלבונים מיוחדים שנקראים initiator-binding proteins. החלבונים האלו נקשרים אל הפרומוטורים של הגנים המאוחרים ומונעים ביטוי שלהם (מתפקדים כרפרסורים). יחד עם זאת, לא קיימת חסימה של יצירת הדנא על ידי הגנים המוקדים לכן הוא ממשיך להיווצר עד שכמותו עולה על כמות החלבונים האלו וכן מתאשרת יצירה של חלבוני מהגנים המאוחרים. כלומר, רק כאשר יש מספיק עותקים מדנא הויראלי, יהיה ביטוי של הגנים המאוחרים שיגרמו ליצירה של חלבונים האחראיים על בניית הקפסיד הויראלי. **Cascade regulation of adenovirus** בווירוס הזה יש שלושה שלבי ביטוי: Immediate early, early ו-late. שלב ה- Immediate early מתחיל כאשר יש זיהוי של פרומוטור ויראלי על ידי מנגנוני התא המאחסן. החלבון שנוצר בשלב הזה נקשר לפרומוטור של שלב ה-early והחלבון שנוצר בשלב השני נקשר לפרומוטור של שלב ה-late ומאפשר יצירה של דנא וביטוי של הגנים המאוחרים. **Cascade regulation of herpesvirus** דבר דומה מתרחש בווירוס הזה כמו באדנוווירוס, רק שבווירוס הזה השלב הראשון מתחיל באמצעות זיהוי של הפרומוטור הויראלי על ידי חלבון שעתוק ויראלי שהוירוס מביא יחד איתו בקופסיד. לאחר מכן תהיה הפעלה קסקדית גם של שלב ה-early וה-late. **סינתזת רנא מתבנית דנא** בשנים הראשונות של חקר נגיפי הגידול, גילו בנג ואלרמן את נגיף הלוקמיה בעופות ופייטון ראוס את נגיף ראוס סרקומה, שהוכיחו כי נגיפי RNA יכולים לגרום לשינויים קבועים בתאים מודבקים. בשנות ה-50, טמין שיער שנגיפי RNA הופכים ל-DNA ומשתלבים בגנום המארח, והשערה זו הובילה לגילוי אנזים הרוורס טרנסקריפטאז (RT) בשנת 1970 על ידי טמין ובולטימור. גילוי זה אישר את תהליך ההמרה מ-RNA ל-DNA ואת תרומתו להתפתחות טרנספורמציה תאית. הרוורס טרנסקריפטאז (RT) קיים במגוון רחב של יצורים ולא רק בנגיפים. ניתוח פילוגנטי מצביע על כך שכולם חולקים אב קדמון משותף, מה שמרמז כי האנזים הוא עתיק מאוד וייתכן ששימש כגשר בין עולמות ה-RNA וה-DNA. אנזים זה קיים גם בנגיפים נוספים, כמו נגיף ה-HBV. נגיף הסרקומה של רוס (Rous sarcoma virus) הוא נגיף מעטפת בעל קפסיד איקוסהדרלי. הוא מכיל שני עותקים של RNA, המצופים בנוקלאוקפסיד. בתוך חלקיק הנגיף נמצאים רוורס טרנסקריפטאז (RT), אינטגרז וחלבונים נוספים. שני עותקי ה-RNA מחוברים באמצעות "לולאת נשיקה" (kissing loop), תכונה המאפשרת תיקון של מוטציות, כאשר האנזים יכול לעבור בקלות בין הגדילים. האנזים רוורס טרנסקריפטאז (RT) יכול להשתמש בפריימר שמורכב מ-RNA או DNA, כאשר גם התבנית יכולה להיות RNA או DNA, שכן האנזים מייצר DNA דו-גדילי (dsDNA). התהליך המתווך על ידי RT הוא איטי ונוטה לטעויות, עם שיעור של מוטציה אחת לכל 10⁴--10⁶ נוקלאוטידים. בנוסף, ל-RT יש פעילות נוספת של RNAse H, שהוא אנדונוקלאז המתמחה בפירוק RNA בדו-גדילים. פעילות זו יוצרת אוליגונוקלאוטידים קצרים ומאפשרת את הסרת ה-RNA לאחר ש-DNA נוצר. הווירוס חודר לתא בדרך כלל דרך איחוי עם הממברנה הפלסמתית, כאשר הגנום נשאר בתוך הקפסיד לאורך כל התהליך, בדומה לווירוס הריובירוס (Reovirus). בתוך הקפסיד, האנזים רוורס טרנסקריפטאז (RT) מייצר עותק של DNA דו-גדילי מהגנום הוויראלי. עותק זה מועבר לגרעין התא ומשתלב בגנום המאכסן, תהליך שבסיומו עותק ה-DNA הוויראלי מכונה **פרו-וירוס (Provirus)**. האינטגרציה אינה אקראית לחלוטין, ומתבצעת במגוון מיקומים עם נטייה להשתלב בקרבת גנים ואתרי תחילת שעתוק. **בנגיף ה-Hepadnaviruses** ה-RNA נכנס לתוך הקפסיד, והאנזים רוורס טרנסקריפטאז (RT) מתחיל את תהליך ההעתקה בתוך התא. מכיוון שהקפסיד סגור, המלאי של הדאוקסינוקלאוטידים (dNTPs) הדרושים לתהליך מסתיים, ולכן ההעתקה אינה שלמה. בתא הבא, עותק ה-DNA החלקי ישולב בגנום ויתוקן על ידי מנגנוני התיקון של התא. **Assembly & release** נגיפים מרכזים את מרכיביהם באזור ייעודי בתא, המכונה **מפעלים או אינקלוזיות**, לטובת תהליך ההרכבה שלהם. אזורים אלו ניתנים לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ אור ומתאפיינים בארגון מבני ייחודי. לדוגמה, **בנגיף הפוליו** נוצרים מבנים קרומיים כפולים או רב-קרומיים (DMV), הנוצרים בעקבות ארגון מחדש של קרומי הגולג'י וה-ER, ומשמשים כאתר לסינתזת RNA. המבנה הזה מסייע בהגנת הווירוס ברמה חלקית מהמערכת החיסונית של התא. **Targeting signals** אותות ייעודיים המיועדים למיקוד ממברנות כוללים רצפים ייחודיים שמובילים חלבונים לממברנות ספציפיות, למשל דרך רצפי איתות **Signal sequences** או **שינויים חומצתיים** כגון חיבור חומצות שומן לחלבון. בנוסף, קיימים אותות שמאפשרים שמירת חלבונים ב-ER ואותות ייחודיים אחרים, כמו **NLS** שמכוון חלבונים לגרעין, או **NES** שמכוון את יציאתם מהגרעין. **Genome packaging** אותות אריזה מסייעים להבחין בין חומצות גרעין של הווירוס לבין אלו של התא המאכסן. מדובר במערכת של רצפים חוזרים שנקשרים על ידי חלבונים מבניים של הווירוס, ובכך מאפשרים להם להתארגן ולהיכנס לקפסיד הוויראלי. **נגיף ההרפס** משכפל את הגנום שלו באמצעות מנגנון של **מעגל מתגלגל**, היוצר מולקולות DNA ארוכות ורב-יחידתיות הנקראות **concatemers**. רצפי האריזה שב-DNA יוצרים אינטראקציה עם חלבונים ויראליים בנקודת הכניסה המכונה **פורטל,** המשמש כמנוע המושך את ה-DNA לתוך הקפסיד. כאשר מזוהה רצף אריזה נוסף, אנדונוקלאז חותך את ה-DNA ומשחרר את המולקולה הבאה, ובכך מבטיח שכל קפסיד יכיל יחידת DNA אחת בלבד. ה-DNA נארז בקפסיד בלחץ גבוה במיוחד, מה שמאפשר שחרור מהיר ויעיל של החומר הגנטי בעת כניסתו לתא המארח. מבנה RNA ייחודי המכונה **psi** **(ב-HIV)** ממלא תפקיד מרכזי בתהליך אריזת הגנום הנגיפי. מבנה זה נקשר באופן ספציפי לחלבון הנוקליאוקפסיד של הנגיף, המתאפיין בכך שאינו נקשר ל-RNA תאיים. תכונה זו מבטיחה סלקטיביות גבוהה בזיהוי ואינטראקציה עם הגנום הנגיפי בלבד. תהליך זה מבטיח שהגנום הנגיפי יארז בתוך הקפסיד בצורה מדויקת, מה שמאפשר לנגיף להמשיך את מחזור חייו באופן יעיל. מבנה ה-**psi** משמש כאות מולקולרי שמנחה את החלבונים המבניים של הנגיף לזהות את ה-RNA הנכון ולהכניסו אל תוך הקפסיד. בתהליך האריזה של סגמנטים גנומיים בנגיפים כמו **נגיף השפעת (אינפלואנזה),** אם הסגמנטים היו נארזים באופן אקראי לחלוטין, הסבירות שחלקיק נגיפי יכיל את כל 8 הסגמנטים הדרושים להדבקה הייתה נמוכה מאוד. למעשה, רק חלקיק אחד מתוך כ-400 היה מדבק. עם זאת, בנגיף השפעת יש מנגנון שמעלה את הסבירות לאריזה נכונה של הסגמנטים. בקצות כל סגמנט גנומי קיימים רצפים ייחודיים, והם שונים מסגמנט לסגמנט. רצפים אלו מאפשרים זיהוי ספציפי של הסגמנטים על ידי החלבונים הנגיפיים שמתווכים את האריזה, וכך מבטיחים שכל אחד משמונת הסגמנטים ייארז בצורה מדויקת לתוך הקפסיד הנגיפי. מנגנון זה מבטיח יעילות גבוהה בהרכבת חלקיקים נגיפיים מדבקים, ומאפשר לנגיף לשמר את כושר ההדבקה שלו. **נגיף הריאו** (Reovirus) גם מכיל גנום RNA דו-גדילי מפוצל לסגמנטים. בתהליך האריזה, הסגמנט הקטן ביותר הוא הראשון שנכנס לקפסיד, ורק לאחר מכן יכולים הסגמנטים האחרים להיכנס. תהליך זה מבוסס על רצפים ספציפיים בגנום ועל האינטראקציה שלהם עם החלבונים הנגיפיים. בנגיף הריאו, יחס החלקיקים הנגיפיים לחלקיקים מדבקים (Particle-to-PFU ratio) הוא אידיאלי, כלומר יחס של 1:1. המשמעות היא שכל חלקיק נגיפי שנארז מכיל גנום מלא ומדבק. עם זאת, מנגנון האריזה הסלקטיבי של גנומי RNA מפוצלים (בעלי סגמנטים) אינו אוניברסלי. לדוגמה, **בנגיף הבוניאווירוס Rift Valley fever**, כאשר תהליך האריזה נבחן באמצעות שיטת FISH ברמת המולקולה הבודדת, נמצא שרוב החלקיקים הנגיפיים חסרים אחד או שניים מתוך שלושת סגמנטי ה-RNA הגנומי. ממצא זה מצביע על כך שגנום ה-RNA השלילי של נגיף זה נארז **באופן אקראי**, מה שמפחית את היעילות של יצירת חלקיקים מידבקים. **רכישת מעטפת** רכישת מעטפת על ידי נגיפים היא שלב קריטי במחזור החיים שלהם, המתרחש לאחר הרכבת המבנים הפנימיים או בו-זמנית עמו. התהליך משתנה בהתאם לסוג הנגיף, כאשר לכל נגיף מנגנון ייחודי. יציאת הוירוס מהתא נקראת **הנצה או budding** בנגיפים בעלי מעטפת -- חלק מהווירוסים צריכים רק את חלבוני המעטפת ואחרים צריכים חומרים נוספים. **(1) אלפאווירוס (Alphavirus):** חלבוני הקפסיד והמעטפת של הנגיף מסוגלים לייצר חלקיקים שלמים גם ללא רכיבי גנום, מה שהופך את הנגיף לכלי יעיל לפיתוח וקטורים למחקר ולרפואה. \(2) **רטרווירוס (Retrovirus):** חלבון המטריקס, הממוקם מתחת לממברנת הנגיף, מעניק מבנה יציב לחלקיק הנגיפי ומשמש גם כגורם מניע לתהליך ההנצה, שבו הנגיף משתחרר מהתא המארח. חלקיקי DeltaP6 יוצרים מבנים שאינם משתחררים מהתא ומשתמשים במערכת ESCRT לצורך חיתוך ושחרור וסיקולות, תהליך חיוני ליצירת מבנים נגיפיים חדשים ולמיון תוך-תאי. \(3) **קורונהווירוס (Coronavirus):** במקרה זה, חלבון המעטפת לבדו מספיק כדי ליזום את תהליך ההנצה, מה שמדגיש את יעילותו בתהליך האריזה. **(4) רבדווירוס (Rhabdovirus) ושפעת (Influenza):** בנגיפים אלו, יש צורך בשיתוף פעולה של חלבוני המטריקס, הגליקופרוטאינים ולעיתים גם הגנום הנגיפי עצמו, כדי להבטיח שההנצה תהיה מדויקת ושהנגיף יוכל להדביק תאים חדשים. וירוסים חסרי מעטפת בדרך כלל גורמים לליזיס של התא. הם יוצרים נקבים בממברנה באמצעות חלבונים שמפרקים או מפוצצים את ממברנת התא. עם זאת, ישנם מקרים שבהם הם משתחררים גם באמצעות שלפוחיות, כמו שלפוחיות אוטופגיות (autophagic vesicles), שלפוחיות עם ממברנה כפולה (DMV) או אקסוזומים, שמאפשרים שחרור עדין יותר של הווירוסים מהתא. כלומר, וירוסים שיש להם מעטפת צריכים לעשות הנצה כדי לצאת מהתא ווירוסים חסרי מעטפת בדרך כלל יהרסו את התא המאכסן.