Vom Gen zum Protein PDF

B.MM106 Vom Gen zum Protein © Dr. rer. nat. Arne Zibat, Institut für Humangenetik, Heinrich-Düker-Weg 12, 37073 Göttingen Version: 1.1/04-2023 Prinzip der Genexpression Grundsätzlich gleicher Verlauf des Weges vom...

B.MM106 Vom Gen zum Protein © Dr. rer. nat. Arne Zibat, Institut für Humangenetik, Heinrich-Düker-Weg 12, 37073 Göttingen Version: 1.1/04-2023 Prinzip der Genexpression Grundsätzlich gleicher Verlauf des Weges vom Gen zum Protein in Bacteria und Eukarya Zentrales Dogma der Molekularbiologie DNA RNA Protein (DNA: Deoxyribonukleinsäure, RNA: Rribonukleinsäure) In der prokaryotischen Zelle laufen alle Prozesse im Cytosol ab (keine räumliche Kompartimentierung der Zelle) In der eukaryotischen Zelle finden Transkription (DNA -> RNA) und RNA- Prozessierung im Nucleus statt, während die Translation (RNA -> Protein) im Cytosol stattfindet Quelle: www.amboss.com Aufbau der RNA Zucker: Ribose (DNA: Deoxynukleosid; Ribose trägt am C2-Atom eine Hydroxyl-Gruppe) Ribonuleosid Ribonuleotid Weist 5‘->3‘-Orientierung auf (5‘-Ende: Phosphatrest, 3‘-Ende: Hydroxyl-(OH)-Gruppe) Uracil statt Thymin Liegt in der Zelle i.d.R. als Einzelstrang vor Struktur eukaryotischer Gene Promotor: Bereich, in dem die Transkription initiiert wird (umfasst u.a. Transkriptionsstart und Sequenzmotive, die für die Bindung der RNA-Polymerase und des Transkriptionsinitiationskomplexes wichtig sind (z.B. TATA-Box)) Bereich zwischen Transkriptionsstart und –ende wird als RNA synthetisiert Startcodon: Basetriplett, das die erste Aminosäure des kodierten Proteins repräsentiert Stopcodon: Basetriplett, welches das Ende der Aminosäurebiosynthese kennzeichnet (wird nicht mehr in Aminosäure übersetzt) 5‘-UTR / 3‘-UTR: Bereich am 5‘- bzw. 3‘-Ende der RNA, der nicht für Aminosäuren des Proteins kodiert (wird nicht in Bei eukaroytischen Genen sind die proteinko- Aminosäuren übersetzt) dierenden Bereiche (Exons) i.d.R. nicht zusammen- Exon: für das Protein kodierender Bereich (wird in hängend angeordnet, sondern durch Bereiche von- Aminosäuren übersetzt) einander getrennt, die nicht proteinkodierend sind Intron: Bereiche zwischen Exons, die nicht in (Introns). Aminosäuren übersetzt werden Quelle: www.amboss.com Transkription (ca. 10-12 Basen) (5‘-Capping) (3‘-Polyadenylierung) Quelle: www.amboss.com Transkription Transkriptionsinitiation Bindung von TFIID (TF = Transkriptionsfaktor) an Promotor. TFIID besteht aus TBP (TATA-Box-Binde-Protein) und TAFs (erkennen Promotoren ohne TATA-Box) Bindung von TFIIA (stabilisiert TFIID) und danach von TFIIB (ermöglicht Bindung von RNA-Polymerase II) Bindung von TFIIF an RNA-Polymerase II und Bindung dieses Komplexes an Initiationskomplex Bindung von TFIIE (vermittelt Bindung von TFIIH) und TFIIH (Helikase- und Kinaseaktivität) Helikaseaktivität führt zu einer Entwindung der DNA- Matrize im Bereich des Initiationskomplexes und direkt davor Quelle: www.amboss.com, Kornberg RD et al. 2007. PNAS. doi:10.1073/pnas.0704138104 Transkription DNA-bindende Proteine Weisen i.d.R. typische Motive auf Leucine-Zipper Helix-turn-helix Transkription Durch Bindung von Initiationskomplex werden im Bereich der gebundenen RNA- Polymerase II die Stränge der Doppelhelix getrennt (Transkriptionsblase) und der Matrizenstrang gelangt in das aktive Zentrum der RNA-Pol II Es wird ein RNA-Molekül mit einer Länge von 10 Basen synthetisiert. Dann wird der Komplex vom Promotor gelöst und die Synthese schreitet weiter Bereits in dieser frühen Phase wird an das 5‘-Ende des 5‘-5‘-Triphosphatbindung wachsenden RNA-Stranges ein GMP-Rest in Form einer 5‘-5‘-Triphosphatbindung übertragen (RNA-Capping) Quelle: www.amboss.com, Kornberg RD et al. 2007. PNAS. doi:10.1073/pnas.0704138104 Transkription Elongation Posttranskriptionelle Prozessierung der mRNA Polyadenylierung Am Ende der Transkription wird an die synthetisierte RNA ein Poly-A-Schwanz angehängt (dient u.a. als Schutz vor Abbau der RNA) Durch spezifische Motive im 3‘-UTR wird der Abschluss des RNA-Stranges gekennzeichnet (Polyadenylierungssignal: 5‘-AAUAAA-3‘) Am Ende der Transkription kommt es zur Ausbildung einer Loop-Struktur und das Enzym Poly(A)-Polymerase werden ca. 100-200 Adenosinmonophosphatreste angehängt Spleißen der mRNA Entfernen der Inton-Bereiche zwischen den Exon-Regionen Vermittelt durch konservierte Sequenzmotive im Intron Intron Exon Exon GT{A/G}AGT TNCTA A C C N C AG C TCG T T 11 T Splice donor site Branch site Splice acceptor site Spleißen der mRNA Mechanismus: zwei aufeinanderfolgende Umesterungsreaktionen 1. OH-Gruppe eines Adeninrestes im Intron greift das 5‘-Phosphat an der Splice Donor Site an (es wird eine Schleifenstruktur ausgebildet (Lariat)) 2. Das so frei gewordene 3‘-OH des am 5‘-Ende der DNA gelegenen Exons greift nun die Phosphodiesterbindung an der Splice Acceptor Site an Die beiden Exon-Bereiche sind nun direkt miteinander verbunden Spleißen der mRNA Verteilung der Nukleotidhäufigkeiten [%] 100 90 80 70 60 [T] 50 [G] [C] 40 [A] 30 20 10 0 +1 +2 +3 +4 +5 +6 +7 +8 +9 +10 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Spleißen der mRNA Position +5 Position +2 Position -2 G>T 23,2 T>G 31,8 A>T 19,0 G>C 25,2 T>C 45,9 A>G 59,8 G>A 51,7 T>A 22,3 A>C 21,2 0,0 20,0 40,0 60,0 0,0 20,0 40,0 60,0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 Position +4 Position +1 Position -1 A>T 34,9 G>T 29,7 G>T 23,3 A>G 62,8 G>C 20,7 G>C 27,5 A>C 2,3 G>A 49,6 G>A 49,2 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 0,0 20,0 40,0 60,0 0,0 20,0 40,0 60,0 Position +3 Ratio [%] Ratio [%] A>T 30,4 A>G 41,8 A>C 26,6 0,0 20,0 40,0 60,0 Ratio [%] Reife mRNA Quelle: www.amboss.com Der Genetische Code Übersetzung der Nukleotidsequenz eines RNA-Moleküls in die Aminosäuresequenz eines Proteins Prinzip: eine Abfolge aus drei Basen (Triplett, Codon) wird einer Aminosäure zugeordnet Kombinationsmöglichkeiten: 4 3 = 64 Der genetische Code ist universell (der Code ist für allgemein für alle Organismen gültig) Der genetische Code ist degeneriert (eine Aminosäure kann durch verschiedene Codons kodiert werden) Translation Struktur der Ribosomen Translation tRNAs haben eine Kleeblattstruktur tRNA: transfer-RNA Kurze einzelsträngige RNA-Moleküle (73-95 Nukleotide), die als Vermittler zwischen mRNA und Proteinsynthese wirken Kleeblattartige Sekundärstruktur durch Bereiche intramolekularer Basenpaarungen Enthält neben den bekannten Basen A, C, G und T auch zahlreiche modifizierte Basen (Dihydrouridin, Pseudouridin, Ribothymin, etc) Dihydrouridin-Scleife dient u.a der Erkennung der tRNA durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase 3‘-Ende der tRNA immer 5‘-CCA-3‘. An freiem 3‘-OH des terminalen Adenins wird Carboxy-Gruppe des der Aminosäure gebunden Anticodon: Basentriplett, das mit einem komplementären Triplett der mRNA interagiert Quelle: www.amboss.com Translation Initiation der Translation 43S-Präinitiatins- tRNA: transfer-RNA komplex mRNA Kurze einzelsträngige RNA-Moleküle (73-95 Nukleotide), die als Vermittler zwischen mRNA und Proteinsynthese wirken Kleeblattartige Sekundärstruktur durch Bereiche intramolekularer Basenpaarungen Enthält neben den bekannten Basen A, C, G und T auch zahlreiche modifizierte Basen (Dihydrouridin, Pseudouridin, Ribothymin, etc)von Initiationsfaktoren an kleine Bindung Erste (Start)-tRNA in Eukarya Initiationsfaktor eIF-4 beladene 40S-Untereinheit verhindert Anlagerung i.d.R. mit Methionin beladen mRNA bindet an 43S-Komplex von großer 60S-Untereinheit Dihydrouridin-Scleife dient u.a der Erkennung der tRNA durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase 80S-Initiatins- komplex 3‘-Ende der tRNA immer 5‘-CCA-3‘. An freiem 3‘-OH des terminalen Adenins wird Carboxy-Gruppe des der Aminosäure gebunden Anticodon: Basentriplett, das mit einem komplementären Triplett der mRNA interagiert Innerhalb des Komplexes kommen erstes Codon der mRNA und Anti- codon zusammen Quelle: www.amboss.com Translation Wobble-Hypothese Die dritte Base innerhalb eines Tripletts lässt einen gewissen Grad der Ungenauigkeit zu Degenerierter Charakter des genetischen Codes Quelle: www.amboss.com Translation Elongation und Termination tRNA mit Anticodon komplementär zu Die dritte Base innerhalb eines Tripletts lässt einen gewissen Codon in A-Position lagert an Komplex an Grad der Ungenauigkeit zu Degenerierter Charakter des genetischen Codes Die A-Position des Komplexes ist wieder frei und kann eine neue Aminoacyl-tRNA binden Verknüpfung der Aminosäure in A- Position mit wachsender Peptidkette, wachsende Peptidkette wird dabei auf tRNA in A-Position übertragen Translokation des Ribosoms entlang der mRNA in 5‘->3‘-Richtung um die Länge eines Tripletts Quelle: www.amboss.com Translation Elongation und Termination tRNA mit Anticodon komplementär zu Die dritte Base innerhalb eines Tripletts lässt einen gewissen Codon in A-Position lagert an Komplex an Grad der Ungenauigkeit zu Degenerierter Charakter des genetischen Codes Die A-Position des Komplexes ist wieder frei und kann eine neue Aminoacyl-tRNA binden Termination der Translation, wenn eines der drei Stopp-Codons (UAG, UAA, UGA) erreicht wird, da hierfür keine Aminoacyl-tRNA existiert. Verknüpfung der Aminosäure in A- Position mit wachsender Peptidkette, wachsende Peptidkette wird dabei auf tRNA in A-Position übertragen Translokation des Ribosoms entlang der mRNA in 5‘->3‘-Richtung um die Länge eines Tripletts Quelle: www.amboss.com Alternatives Splicing Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese (von Beadle & Tatum 1941 aufgsstellte Hypotehse aufgrund der Analyse von Neurospora-Mangelmutanten): ein Gen kodiert für genau ein Enzym (Protein) Widerlegt durch den Nachweis alternativen Splicings Quelle: www.amboss.com  Fehlerhaftes Splicing Änderung der Basenzusammensetzung an hochkonservierten Positionen (besonders Donor- bzw. Acceptor-site) führt zu fehlerhaftem Splicing a) Exon a GT AG Exon b GT AG Exon c Exon a Exon b Exon c constitutively splicing b) Exon a GT CG Exon b GT AG Exon c Exon a Exon c mutually skipped exon c) Exon a GT AG AG Exon b GT AG Exon c Exon a Exon b Exon c mutually retained intron d) Exon a GT AG GT GT AG Exon c Exon a Ex b Exon c mutually truncated exon b) führt zu funktionslosen bzw. funktionell eingeschränktem Protein oder mitunter zu decay c) und d) führen zu frame-shift und stop gain Regulation der Transkription Aktivator- bzw. Repressorproteine regulieren oft als zusätzliche spezifische Transkriptionsfaktoren über distal lokalisierte Elemente (Enhancer bzw. Silencer) die Transkrption (Verstärkung bzw. Verminderung der Expression, Bindung an Ribosom wird durch Multiproteinkomplex (Mediatorkomplex) vermittelt) Quelle: www.amboss.com Regulation der Genexpression Organisation bakterieller Gene Transkriptionsstart Promotor Gen 3‘ UTR keine Unterbrechung der kodierenden Bereiche durch nicht- kodierende Bereiche (keine Introns). keine post-transkriptionelle Reifung der mRNA. mRNA häufig polycistronisch (mehrere benachbarte Gene werden häufig in eine mRNA transkribiert). Anordnung der Gene in einem Operon. Transkriptionsstart Operon (DNA) Promotor Gen 1 Gen 2 Gen 3 Gen 4 mRNA polycistronisch Regulation der Genexpression Das lac-Operon Quelle: www.amboss.com Regulation der Genexpression Quelle: www.amboss.com Lac-Repressor wird exprimiert Lac-Repressor besetzt Operatorbereich und blockiert damit Zugang von RNA-Pol II zum Promotor Regulation der Genexpression Quelle: www.amboss.com Basalniveau der b-Galactosidase wandelt Lactose in Allolactose um Allolactose bindet an Lac-Repressor und führt zu einer Konforma- tionsänderung des Proteins. Repressor kann nicht mehr Operatorbereich besetzen RNA-Pol II kann an Promotorbereich binden und die Gene des Operons transkribieren Induktion der Genexpression durch Lactose Regulation der Genexpression Positive Regulation (Katabolitrepression) Quelle: Griffiths et al. 7th ed., Freeman and Company 2000