Práctica Microscopia. Ocular Micrométrico 2024-II

Curso: Introducción a la Biología celular Práctica: Microscopia. Mediciones de longitud. Uso del ocular micrométrico Autores de la guía: Dra. Margarita Arana, Dr. Oswaldo Ramírez OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:  Calibrar el ocular micrométrico con la lámina patrón a diferentes aumentos  Calcular la lon...

Curso: Introducción a la Biología celular Práctica: Microscopia. Mediciones de longitud. Uso del ocular micrométrico Autores de la guía: Dra. Margarita Arana, Dr. Oswaldo Ramírez OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:  Calibrar el ocular micrométrico con la lámina patrón a diferentes aumentos  Calcular la longitud de estructuras microscópicas utilizando el ocular micrométrico.  Utilizar la barra de escala (de referencia) para medir la longitud de estructuras en microfotografías. I. Mediciones usando ocular micrométrico. El diámetro de una célula o la longitud/diámetro de componentes subcelulares o la longitud de cualquier objeto pequeño pueden medirse usando un ocular micrométrico que tiene una graduación en unidades arbitrarias (Fig.1). Esta graduación arbitraria del ocular micrométrico se calibra usando una lámina patrón (Fig. 2) por superposición de ambas escalas. El ocular micrométrico ha sido colocado previamente dentro del tubo ocular, de modo que la escala graduada sea visible en el ocular al observar a través de él. Existen diversas formas de oculares micrométricos (Fig.3). En la práctica usaremos un ocular simple (Fig. 1) Cada unidad o división de la lámina patrón mide 10 m, y sabiendo cuántas divisiones del ocular micrométrico equivalen al sobreponerse con las divisiones de la lámina patrón (Fig. 4), se puede calcular el número de micrómetros (m) en cada unidad del ocular micrométrico. También se puede determinar la longitud de cada división del ocular micrométrico (factor de calibración), dividiendo el largo observado de la lámina patrón por el número total de divisiones en la escala del ocular micrométrico. El factor de calibración se calcula por regla de tres simple de la siguiente manera: Por ejemplo, si a 100X, 20 divisiones del ocular micrométrico coinciden con 20 divisiones (20 x 10 µm = 200 µm) de la lámina patrón, entonces: 1 división del ocular micrométrico = 200 µm = 10 µm 20 divisiones Esta operación se puede repetir con cada lente objetivo (excepto el lente de inmersión). La figura 5 muestra la calibración del ocular micrométrico sobreponiéndolo con la lámina patrón a diferentes aumentos. Una vez calibrado el ocular micrométrico, se retira la lámina patrón y se coloca la lámina portaobjetos con la muestra a ser medida. En el ejemplo de la figura 6, la longitud de lo observado a 100X corresponde con 4 divisiones del ocular micrométrico. Si se calculó que cada división a 100X equivale a 10 µm, la longitud del grosor del pelo de la musaraña será 40 µm. Longitud del grosor del pelo = 4 divisiones x 10 µm = 40 µm. MATERIALES: - Microscopio de luz - Cinta adhesiva transparente - Ocular micrométrico - Hoja de afeitar - Lámina patrón - Regla  Figura 1. Ocular micrométrico Figura 2. Lámina patrón Figura 3. Diferentes tipos de oculares Figura 4. Sobreponiendo el ocular micrométricos micrométrico con la lámina patrón Figura 5. Calibración del ocular micrométrico con la lámina patrón a diferentes aumentos. Figura 6. Ejemplo de medición lineal de muestras con ocular micrométrico: sección espatular de un pelo de guardia (de protección) de Cryptotis mayensis “Musaraña” 40µm (±2.31). Foto tomada 100X de: Pech-Canché J. et al. (2009) II. Mediciones usando barra de escala (barra de referencia) en microfotografías. Si tiene el valor de R de una barra de referencia en una microfotografía, puede medir con una regla la longitud (cm o mm) de la barra de referencia y la longitud de cualquier estructura y compararlas mediante regla de tres simple directa. Por ejemplo, en la figura 7, la barra de referencia de 15 mm de longitud (L) representa 0.2 µm (R) y en la microfotografía usted mide con la regla la imagen de una partícula viral (X) de 4 mm de longitud ¿Cuál será la medida real de la partícula viral? Si L = 15 mm es equivalente a 0.2 µm (R) Entonces, X = 4 mm es equivalente a ? µm ? = 4 mm x 0.2 µm = 0.05 µm = 50 nm 15 mm La partícula viral (X) de la figura 7 tiene una longitud real de 50 nm de diámetro. Barra de referencia X= 4mm dibujada L= 15mm 0.2 µm R = 0.2 µm Figura 7. Vesícula de una célula epitelial infectada con coronavirus, llena de partículas virales. L = 15 mm = 1.5x104 µm. Foto M. Arana En caso esté interesado en cómo hallar el valor de R de la barra de referencia (no es un objetivo de esta práctica), en el anexo de esta guía se explica el procedimiento. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. -Bregman, A. (1983). Laboratory Investigations in Cell Biology. John Wiley & Sons. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. -Pech-Canché J., Sosa-Escalante JE., Koyoc Cruz ME. (2009) Revista Mexicana de Mastozoología13:7-33. Enlaces internet: -Parry-Hill M., Fellers T.J, y Davidson M.W. - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310. Nikon microscopy U. Tutorial interactivo para la medición con ocular micrométrico (2000-2015). http://www.microscopyu.com/tutorials/java/reticlecalibration/index.html Ficha de trabajo Práctica # 2 Microscopia. Mediciones de longitud. Uso del ocular micrométrico Objetivo 1. Calibrar el ocular micrométrico con la lámina patrón a diferentes aumentos. (Tiempo para cumplir el objetivo: 30 minutos) 1) Coloque la lámina patrón (Fig.2) en la platina del microscopio y enfoque las graduaciones usando el lente objetivo de 10X. Las graduaciones en la escala de la lámina patrón están separadas a una distancia de 0.01 mm (10 µm). 2) Sobreponga la escala del ocular micrométrico con la escala de la lámina patrón. Puede rotar el ocular micrométrico girando el ocular apropiado para hacer coincidir las escalas (Fig. 4). Registre el número de divisiones del ocular micrométrico que coinciden exactamente con el número de divisiones de la lámina patrón y calcule el factor de calibración al aumento total de 100X. Anote el resultado en la tabla 1. 3) Del mismo modo repita la calibración del ocular micrométrico con el lente objetivo seco de mayor aumento (40X). Calcule el largo de cada división del ocular micrométrico al aumento total de 400X y escríbalo en la tabla 1. Ahora puede retirar la lámina patrón. No intente utilizar la lámina patrón con el lente objetivo de inmersión (100X) porque podría romperla. 4) A partir de la calibración del ocular micrométrico al aumento total de 100X, calcule cuánto mediría cada división del ocular micrométrico a los diferentes aumentos totales, 40X, 400X y 1000X, considerando que el largo de cada división es inversamente proporcional al aumento total (aplique regla de tres simple inversa) y anótelos en los espacios en blanco correspondientes en la columna derecha de la tabla1. Objetivo 2. Calcular la longitud de estructuras microscópicas utilizando el ocular micrométrico (Tiempo para cumplir el objetivo: 20 minutos) 1) Corte un pelo de la cabeza y colóquelo sobre un portaobjetos limpio. Use un poco de cinta adhesiva transparente para pegarlo a la lámina y recorte el exceso del pelo con una hoja de afeitar. Colocar la lámina portaobjetos con la muestra en la platina. Todas la mediciones que se hagan en un equipo se harán utilizando un pelo de la misma persona para poder hacer las comparaciones. 2) Después de enfocar a 100X, ponga el pelo en una posición en la que pueda medir con el ocular micrométrico el grosor de la estructura como en el ejemplo de la figura 6 de la guía. 3) Haga las mediciones del grosor del pelo a 100X y 400X utilizando la calibración de ocular micrométrico que le corresponde a cada uno de estos aumentos. Recuerde que los pelos que se midan deben pertenecer a una misma persona. Calcule su grosor y anótelo en la tabla 2.  Objetivo 3. Utilizar la barra de escala (de referencia) para medir la longitud de estructuras en microfotografías. (Tiempo para cumplir el objetivo: 15 minutos) 1) La siguiente figura (Foto #1) corresponde a una microfotografía de un ovocito fecundado de erizo de mar. Aplicando regla de tres simple directa, calcule el diámetro (d) aproximado del ovocito, sin incluir la cubierta gelatinosa (membrana de fecundación) utilizando la barra de referencia. Escriba el planteamiento y respuesta en el cuestionario. d Foto #1. Ovocito fecundado de erizo de mar 2) Calcule cuánto mide el diámetro del grano de polen señalado en la foto #2 Escriba el planteamiento y respuesta en el cuestionario. 5 µm Foto: M. Arana Foto #2. Xilema (Haz conductor) (1) y grano de polen (2). ´ Integrantes de equipo: Firma del profesor que evalúa Cuestionario: (Tiempo para para responder y entregar el cuestionario: 40 minutos) Tabla 1. Longitud de cada división del ocular micrométrico a diferentes aumentos. Longitud de cada unidad Longitud de cada unidad del del ocular ocular micrométrico Aumento total micrométrico calculado a partir del calibrado factor de calibración a directamente con la 100X lámina patrón (µm) (factor de calibración) (µm) 40X 100X 400X 1000X ¿Qué relación encuentra entre el valor de la unidad del ocular micrométrico y el aumento total? Tabla 2. Grosor del pelo de la cabeza Grosor Grosor Grosor Grosor Promedio (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) 100 X 400X (En cada columna se colocan los valores medidos por cada estudiante de su equipo) ¿El grosor medido en ambos aumentos es igual? ¿Qué esperaría usted? ¿Por qué? Diámetro del ovocito de la foto #1: Diámetro del grano de polen de la foto #2 ¿Cuál de las microfotografías (#1 o #2) habrá sido tomada a mayor aumento? ¿Porqué?  ANEXO ¿Cómo se calcula el valor R de la barra de referencia de una microfotografía? Si conocemos la ampliación total de la imagen en una microfotografía (ampliación en el microscopio multiplicado por la ampliación de la fotografía) podemos construir una barra que indica la escala de la misma (barra de referencia) con la cual se puede calcular el tamaño real de las estructuras de la imagen, de manera similar a las barras de escala que observamos en los mapas. Para construir la barra de referencia se dibuja una línea en la microfotografía y se mide su longitud (L) con una regla. La medida en cm o mm debe convertirse a micras (µm) o nanómetros (nm). La equivalencia de la barra de referencia (R) se calcula aplicando la fórmula: 1) R = __L___ MxF L = Medida de la longitud de la barra dibujada en la microfotografía, convertida en µm o nm. M = Ampliación de la imagen en el microscopio F = Ampliación de la imagen en la fotografía. Esto significa que la longitud R (en µm o nm) está representada en su microfotografía por la longitud L (en cm o mm). Cuando se trata de una microfotografía electrónica de barrido, es necesario usar un factor de corrección (B) en la fórmula: 2) R = L____ MxFxB Veamos como ejemplo la microfotografía de la figura 7 que fue tomada al microscopio electrónico a 50000X (M) y la ampliación de la fotografía (F) fue de 1.5X. Con ayuda de una regla se dibuja una barra de referencia de 1.5 cm (15 mm = 1.5x104 µm) de longitud (L). Barra de referencia X= 4mm dibujada L= 15mm 0.2 µm R = 0.2 µm Figura 7. Vesícula de una célula epitelial infectada con coronavirus, llena de partículas virales. M =50000X F = 1.5X L = 15 mm = 1.5x104 µm. Foto M. Arana Para calcular la equivalencia de la barra (R), reemplazamos en la fórmula 1) los valores de L y amplificación de la fotografía (M y F): R= 1.5x104 µm = 0.2 µm 50000 x 1.5 Una vez que tenga el valor de R de su barra de referencia puede medir con una regla la longitud en cm o mm de cualquier estructura y compararla, mediante regla de tres simple directa, con la barra de referencia. En el ejemplo de la figura 7, la medida real de la partícula viral marcada con la X es 50 nm.