Fecondation CM1 PDF

Service de Médecine de la Reproduction - CECOS FECONDATION ET COMMENCEMENT DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE (Deuxième partie) Pr. M...

Service de Médecine de la Reproduction - CECOS FECONDATION ET COMMENCEMENT DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE (Deuxième partie) Pr. Marius TELETIN Faculté de Médecine et Hôpitaux Universitaires de Strasbourg 1 DE LA FIXATION SUR LA ZONE PELLUCIDE À LA FUSION Cellule folliculeuse Centrosome Granule Zone cortical pellucide Noyau Membrane plasmique de l’ovocyte Acrosome Cytoplasme ovulaire 2  VI. ACTIVATION DE L’OVOCYTE A un double but : 1. provoquer le "réveil" du métabolisme ovocytaire. 2. s’opposer à la polyspermie; Comporte, dans l'ordre chronologique : 1. une mobilisation du calcium intracellulaire; 2. l‘exocytose des granules corticaux; 3. l'achèvement de la 2e division de la méiose. 3  VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE 500 µm 1 sec before 10 sec after 20 sec 30 sec fertilization fertilization Spreading wave Point of of calcium ions sperm entry Propagation d’une vague de libérations d’ions Ca++ à partir du point d’entrée du spermatozoïde démontrée 4 grâce à une molécule qui émet de la lumière après couplage au Ca++  VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE Le signal Ca2+ est indispensable pour l’activation de l’ovocyte: - son inhibition bloque l’activation de l’ovocyte Cytosol fécondé (cf. action de l’EGTA = ethylene glycol tetraacetic acid); - son induction artificielle provoque tous les Réticulum endoplasmique événements observés lors de lisse (REL) l’activation (cf. action des ions Ca2+ exogènes) 5  VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE Fusion du spz avec la membrane de l’ovocyte Introduction de de la phospholipase C (PLC) Ca2+ spécifique du spermatozoïde (PLC zeta) Ca2+ Hydrolyse du phosphatidylinositol diphosphate Ca2+ membranaire (PIP2) Libération d’inositol triphosphate (IP3). Ca2+ Liaison de l’IP3 à ses récepteurs. Ouverture des canaux calciques du REL Effets cellulaires: Augmentation du signal calcique cytosolique - Exocytose des granules corticaux - Reprise de la méiose - Déclanchement de l’ontogenèse Modification structurale de la calmoduline Ca2+ Cascade de phosphorylations protéiques Activation de protéines kinases 6 VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Ca2+ 7 VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Spermatozoïde fécondant Membrane plasmique de l’ovocyte Granule cortical ❖ Inaptitude de la ZP à fixer de nouveaux spz. Spermatozoïde fécondant Zone pellucide ❖ « Imperméabilisation », Espace périvitellin « durcissement » de la ZP. Spermatozoïde refoulé Blocage de la polyspermie (en Zone pellucide complément de la perte de Juno) partiellement dégradée 8 VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Ca2+ 9 VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX 10  VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Granule cortical Membrane plasmique 1er globule polaire de l’ovocyte Fuseau métaphasique de 2è division méiotique Espace périvitellin Zone pellucide Spermatozoïde refoulé 11  VI. 3. ACHEVEMENT DE LA 2e DIVISION MEIOTIQUE Conséquences: Chromosomes du - élimination de 23 2e globule polaire chromosomes; (23,X) - conservation de la masse cytoplasmique dans l’ovocyte (appelé aussi ovotide Chromosomes de à ce stade de sa l’ovotide (23,X) maturation ) Noyau du spermatozoïde en voie de décondensation 12 QUELS MECANISMES MOLECULAIRES SOUS-TENDENT LA REPRISE DE LA MEIOSE ? Elévation du calcium dans le cytosol Activation du complexe APC (Anaphase Promoting Complex) Complexe multiprotéique Ubiquitinylation ayant une activité ubiquitine-ligase Ubiquitinylation de la sécurine de la cycline B Dégradation de la sécurine Dégradation de la cycline B par les enzymes du protéasome par les enzymes du protéasome Ubiquitine Ubiquitine -ligase L’ ubiquitine = petite protéine (76 aa) dont la protéine liaison covalente à d’autres protéines induit (généralement) leur dégradation au niveau du protéasome (= un complexe multienzymatique) Protéasome 13  Elévation du calcium Activation du complexe enzymatique APC (Anaphase Promoting Complex) = activité ubiquitine - ligase Ubiquitinylation 1. La sécurine inhibait une protéase, la de la protéine sécurine séparase, au sein d’un complexe Dégradation de la sécurine sécurine-séparase. par les enzymes du protéasome 2. Destruction de la sécurine : la séparase dégrade les cohésines qui Activation de la séparase maintenaient la cohésion des chromatides sœurs. Dégradation des cohésines 3. Séparation des chromatides Cohésines Transition métaphase anaphase 14  Elévation du calcium Activation du complexe APC (Anaphase Promoting Complex) = activité ubiquitine - ligase Ubiquitinylation de la cycline B Le MPF (facteur de maturation = facteur de la Dégradation de la cycline B mitose) est un hétérodimère formé: par les enzymes du protéasome - d’une sous-unité catalytique, protéine kinase, la Cdk1 (= protéine kinase-cycline dépendante 1); - d’une sous-unité régulatrice, la cycline B. Inactivation du complexe MPF (= complexe Cdk1/cycline B) Sortie de la mitose 15  VII. FORMATION DES PRONOYAUX Chromosomes du 2e globule polaire (23,X) Chromosomes de l’ovotide (23,X) Noyau du spermatozoïde en voie de décondensation: protamines histones 16  VII. FORMATION DES PRONOYAUX T = + 6h La réplication de l'ADN nécessaire à la première Cortex ovulaire division de ADN X2 segmentation a lieu simultanément dans les deux pronoyaux, avant ADN X2 leur migration vers le centre de L’évolution des pronuclei l’ovotide. est synchrone et débute dans le cortex ovulaire Pronoyau mâle 17  VIII. CARYOGAMIE = CONTACT DES PRONOYAUX T = + 12h Prophases: - condensation de 23 chromosomes; - disparition des enveloppes nucléaires 18  VIII. CARYOGAMIE = CONTACT DES PRONOYAUX Cytoplasme de l’ovotide Pronucléus féminin Globules polaires Pronucléus mâle Zone pellucide Contact des pronoyaux vu au microscope à contraste de phase Image de FIV (fécondation in vitro) 19  IX. DEBUT DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE Fuseau mitotique T = + 30h édifié à partir du seul centrosome Regroupement des paternel 23 chromosomes (qui s’est dupliqué) paternels et des 23 chromosomes maternels dans un plan = métaphase de la 1ère division de segmentation Ovocyte fécondé (= zygote) en métaphase de première division de segmentation = 20 temps 0 du développement embryonnaire (ontogenèse).  ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 1.Triploïdie (3n) - Dispermie - (Digynie = anomalie de la méiose) Les embryons triploïdes ne sont pas viables chez les mammifères et avortent spontanément. Les triploïdies sont à l’origine d’une proportion non négligeable* d'avortements spontanés précoces (= survenant au cours du 1er trimestre) dans l'espèce humaine. Représentation schématique du caryotype d’un embryon humain triploïde : * Environ 15% des avortements spontanés de cause 69, XXX, 69, XYY ou 69, XXY 21 chromosomique  ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 2. Chimère chromosomique par double fécondation de l’ovotide et de son globule polaire (ex: hermaphrodite vrai) ovocytes Chimère chromosomique = coexistence chez un individu de 2 populations cellulaires de caryotypes différents, dérivant chacune d’un zygote différent. Tubes séminifères Histologie de la gonade d’un hermaphrodite vrai 22  ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 3. Androgenèse et môle hydatiforme complète - Phénomène de développement à partir du seul noyau mâle: en l'absence d’une régulation le zygote sera haploïde. - L'haploïdie ne permet pas le développement embryonnaire chez les mammifères. - L’androgenèse (dans l'espèce humaine) conduit à la formation d'une tumeur trophoblastique (= tumeur placentaire) ne comportant ni amnios, ni formations embryonnaires, la môle hydatiforme complète. Môle hydatiforme complète: - Caryotype: généralement 46,XX et ADN uniquement villosités placentaires paternel. présentant un aspect kystique caractéristique. 23  ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 4. Parthénogenèse et kyste dermoïde de l’ovaire (ou tératome ovarien) - Processus de développement « embryonnaire » sans fécondation préalable, donc à partir du seul noyau féminin. - Auto-activation de l’ovocyte dans un follicule mûr. - Aboutit à une tumeur ovarienne. - Un kyste dermoïde peut contenir des tissus différenciés provenant de chacun des 3 feuillets primitifs de Kystes dermoïdes de l’ ovaire contenant peau, poils, l’embryon. ongles, dents, tissu thyroïdien, os, cartilages, épithéliums - 46,XX; ADN uniquement maternel de type respiratoire (https://secure.health.utas.edu)24 CONSEQUENCES PHYSIOLOGIQUES DE LA FECONDATION 1. Rétablissement du nombre diploïde de chromosomes 2. Brassage des caractères héréditaires de l’espèce. 3. Détermination du sexe génétique. 4. Déclenchement de l’ontogenèse. 5. Transmission de l’empreinte génomique parentale. 25  CONSEQUENCES DE LA FECONDATION RÉTABLISSEMENT DU NOMBRE DIPLOÏDE DE CHROMOSOMES - Spermatozoïde: haploïde (n = 23) Zygote: diploïde (2n = 46) - Ovocyte mature (ovotide) : haploïde (n = 23) Diploïde (2n = 46) Fécondation Haploïde (n=23) 26  CONSEQUENCES DE LA FECONDATION BRASSAGE DES CARACTÈRES HÉRÉDITAIRES DE L’ESPÈCE (En complément de la méiose): le zygote possède une combinaison de gènes inédite. Diploïde (2n = 46) Méiose Fécondation Haploïde (n=23) 27 CONSEQUENCES DE LA FECONDATION DÉTERMINATION DU SEXE GÉNÉTIQUE Mâle hétérogamétique: - androspermatozoïdes (23,Y) - gynospermatozoïdes (23,X) Femelle homogamétique : 23,X. 28  CONSEQUENCES DE LA FECONDATION DÉCLENCHEMENT DE L’ONTOGENÈSE Activation de l’ovocyte 1ere division de segmentation 29  CONSEQUENCES DE LA FECONDATION TRANSMISSION DE L’EMPREINTE PARENTALE 30  INTRODUCTION ✓ 1 gène 2 allèles nous avons dans chaque cellule 2 copies de chaque gène autosomique: l'une héritée de notre mère et l'autre de notre père. ✓ Pour la plupart (~99%) des gènes, les deux copies s'expriment de la même manière. ✓ Pour un petit nombre de gènes, une seule des 2 copies est exprimée, l'autre est réprimée (= inactive), selon son origine parentale. Représentation schématique des 2 allèles Paire de chromosomes d’un gène. Ceux-ci occupent les même sites homologues (= loci) sur les 2 chromosomes 31  INTRODUCTION Les gènes qui, au fil des générations, conservent la mémoire de leur origine parentale possèdent une «empreinte génomique parentale» ou « empreinte parentale » = une « étiquette» (appelée « marque épigénétique ») attestant de leur origine paternelle ou maternelle. MISE EN EVIDENCE DE L’EMPREINTE PARENTALE: DEMONSTRATION DE LA NON EQUIVALENCE DES GENOMES PARENTAUX 1. Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris 2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme 3. Phénotype des conception triploïdes chez l’Homme 32  Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Œuf fécondé normal Globule polaire Pronuclei Zone pellucide Ovocyte donneur 2. Transplantation nucléaire 1. Enucléation Ovocyte receveur Il est possible de fabriquer par transplantation de noyaux chez la souris (McGrath & Solter, 1984) des embryons comportant un génome diploïde totalement uniparental et comprenant: - soit 2 pronoyaux mâles; (= embryons androgénétiques) 33 - soit 2 pronoyaux femelles (= embryons parthénogénétiques).  Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Technique Prélèvement. FP; pronoyau féminin; MP, pronoyau masculin. On distingue les pronoyaux par le degré de condensation de la chromatine - On prélève des œufs fécondés dans l'oviducte; - On enlève, à l'aide d'une micropipette, soit le pronoyau mâle, soit le pronoyau femelle ; - On le remplace par un pronoyau du sexe opposé; - On implante les embryons androgénétiques ou parthénogénétiques, au stade de quelques blastomères, dans l'utérus d'une femelle hormonalement préparée (femelle « pseudo-gestante 34 »)  Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Normal Parthénogen. Androgen. - Zygote androgénétique: produit du trophoblaste, peu de tissu embryonnaire. - Zygote parthénogénétique: produit un embryon, très peu de trophoblaste. Embryons Trophoblaste L’empreinte génomique parentale a été découverte par McGrath et Solder au début des années 1980 35  Androgénèse et parthénogénèse expérimentales chez la souris Les produits des conceptions Ovocyte parthénogénétiques et androgénétiques sont létaux in utero. La présence simultanée des génomes maternel et paternel est indispensable au développement de l'embryon, car ces génomes ne sont pas équivalents, mais embryon embryon complémentaires parthénogénétique androgénétique Denise P. Barlow, and Marisa S. Bartolomei Cold Spring Harb Perspect Biol 2014;6:a018382 36  MISE EN EVIDENCE DE L’EMPREINTE PARENTALE: DEMONSTRATION DE LA NON EQUIVALENCE DES GENOMES PARENTAUX 1. Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris 2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme 3. Phénotype des conception triploïdes chez l’Homme 37  2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme Androgenèse et môle hydatiforme complète Les conceptions androgénétiques se développent comme des môles hydatiformes complètes, composées de villosités placentaires, mais sans tissus embryonnaires. Môle hydatiforme complète: aspect kystique des villosités placentaires 38  2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme Parthénogenèse et tératome ovarien - Les conceptions parthénogénétiques donnent des kystes dermoïdes de l’ovaire (= tératomes ovariens), composés de tissus bien différenciés, mais désorganisées, sans structures placentaires. Kyste dermoïde de l ’ovaire ou tératome ovarien: épithéliums glandulaires (thyroïde par exemple), cheveux, os, dents peuvent se retrouver à l'intérieur d’un kyste 39  CONCLUSION Schématiquement: - 2 jeux de chromosomes paternels favorisent le développement du placenta. - 2 jeux de chromosomes maternels favorisent le développement des tissus embryonnaires /différenciés. La présence simultanée des génomes maternel et paternel est indispensable au développement harmonieux de l'embryon, car ces génomes ne sont pas équivalents, mais complémentaires: un génome de chaque sexe est indispensable à une descendance viable. 41  GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE La non-équivalence des génomes parentaux repose sur l’existence de gènes (autosomiques) soumis à une empreinte parentale. Lorsqu’un gène est soumis à empreinte, un seul de ses allèles est exprimé (= l’un de ses allèles est réprimé) expression monoallélique normale du gène à partir, soit de l’allèle paternel, soit de l’allèle maternel. Les gènes porteurs d’une empreinte paternelle(/maternelle) sont physiologiquement inactifs sur le chromosome (sur l’allèle) d’origine paternel(/maternel) Les gènes soumis à empreinte sont en petit nombre (~ 200 des 20.000-25.000 gènes du génome humain). Ex: le gène codant pour le facteur de croissance IGF2 (Insulin Growth Factor 2). Seul l’allèle paternel (= hérité par le père) est actif. 42  EXEMPLE DE GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE Le gène codant pour IGF2 (insulin-like growth factor2) : un ex. de gène soumis à empreinte ✓ Igf2KO – inactivation du gène Igf2 ✓ Les souris homozygotes pour Igf2 KO sont 40% plus petites que les souris normales Allèle Igf2 normal Allèle Igf2 mutant ✓ Si l’allèle Igf2 KO est transmise par la femelle: les exprimé non-exprimé descendants hétérozygotes sont de taille normale; ✓ Si l’allèle Igf2 KO est transmis par le mâle, les Allèle Igf2 mutant Allèle Igf2 normal non-exprimé non-exprimé descendants hétérozygotes sont 40% plus petits. Invalidation de Igf2 chez la souris (vers 1990) POURQUOI ? - Igf2 ne s’exprime qu’à partir de l’allèle paternelle (= Igf2 porte une empreinte maternelle) - Chez les hétérozygotes pour Igf2 KO sur le chromosome d’origine paternelle, l’allèle porté par le chromosome d’origine maternelle ne compense la délétion. 43  EXEMPLE DE GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE Le gène codant pour IGF2 (insulin-like growth factor2) : un exemple de gène soumis à empreinte Syndrome de Beckwith-Wiedemann Résulte d’une expression bi-allélique du gène Igf2 Pour que le développement embryonnaire se déroule normalement un seul allèle de Igf2 doit être actif A retenir : l’expression bi-allélique d’un gène soumis à empreinte peut avoir des conséquences dramatiques sur le développement embryonnaire Syndrome polymalformatif: croissance fœtale excessive du fœtus (hypertrophie des organes (viscéromégalie), omphalocèle, prédisposition à développer certaines tumeurs) 44  NATURE ET BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE - Repose sur une modification épigénétique de la chromatine [= soit une modification de l’ADN (ex: méthylation sur des cytosines), soit une modification post-traductionnelle d’histones (ex: acétylation, méthylation, phosphorylation)] qui modifie l’expression des gènes, sans changer dans la séquence des nucléotides de l’ADN. Elle se transmet éventuellement d’une génération de cellule à la suivante. Chromatine = association ADN + histones 45  NATURE ET BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE : LA MÉTHYLATION DE L'ADN un nucléosome La modification épigénétique en rapport avec l'empreinte parentale méthyltransférase ADN méthylé de l’ADN est la méthylation de l'ADN: - concerne les cytosines dans des doublets (= dinucléotides) CpG ; Chromatine dans un état condensé - catalysée par des ADN non méthylé méthyltransférases de l’ADN ; - une compaction des = Cytosines méthylées nucléosomes, empêchant l'accès transcription = Facteur de transcription des facteurs de transcription aux Chromatine dans un état « ouvert » promoteurs des gènes et La méthylation de l’ADN s’effectue sur des résidus aboutissant à une répression Cytosine (C) précédant un résidu Guanine (G) localisés transcriptionnelle. dans des régions denses en CpG (= îlots CpG). 46  BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE : LA MÉTHYLATION DE L'ADN Nucléosome (histones) ADN méthylé ADN méthyl = transférase ADN Cytosines méthylées La méthylation de de la région promotrice est (généralement) associée à une répression transcriptionnelle. en règle générale, les promoteurs des gènes soumis à empreinte contiennent des îlots CpG qui sont: - fortement méthylés sur l’allèle qui est inactif; - faiblement méthylés sur l’allèle qui est actif. 47 BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE : LA MÉTHYLATION DE L'ADN 1. Les méthyltransférases de l’ADN (DNMT), catalysent le transfert d’un groupement méthyl sur des résidus cytosines produisant de la 5-méthylcytosine. 2. Lors de la réplication de l'ADN, la méthyltransférase 1 de l’ADN, (DNMT1) recopie sur le brin néo-synthétisé le profil de méthylation lu sur le brin matrice transmission stable de la méthylation de l’ADN au cours des divisions des cellules somatiques. DNMT= DNaMéthylTransferase 48  L'EMPREINTE PARENTALE EST HERITEE A LA FECONDATION L’empreinte parentale est : - (1) mise en place au cours de la formation des gamètes (gamétogenèse); - (2) héritée par le zygote à la fécondation; - (3) transmise de façon stable lors des mitoses somatiques, tout au long de la vie de l’individu. 3 (2) Le zygote, résultant de la fusion des gamètes, possède: 3 - un allèle transmis par le père avec un profil de méthylation paternel (en bleu) 1 - un allèle transmis par la mère avec un profil de méthylation maternel (en rouge). 2 49  http://www.orpha.net/orphaschool/elearn1.htm Françoise Ibarrondo, Gilles Camus http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/kx/kx.htm 50