Mibi 13: Lagerbierhefe: Ursprung, Pasteur & Hybridisierung

Mikroorganismen Vorlesung Teil 13: Ursprung und Züchtung der Pilsner-Bierhefen

• Hansen isolierte 1883 Saccharomyces carlsbergensis.
• Es folgt die Genomsequenzierung von S. carlsbergensis.
• Betrachtet werden soll hybride Bildung bei Saccharomyces.
• Ebenfalls betrachtet werden soll Weinhefen.

Woher kommt die Lagerbier-Hefe?

• Brauer kannten Hefe lange nicht und Bier fermentierte quasi spontan.
• Seit rund 10.000 Jahren, bis zu Klosterbrauereien im 8. Jahrhundert, war dies der Fall.
• Spontangärungen gibt es noch heute, z. B. bei der Herstellung von Lambic Beers.
• Seit etwa 800 verstanden die Brauer, dass ihr Satz etwas Besonderes enthielt, obwohl die Hefe selbst bis zur Wissenschaft des 19. Jahrhunderts unerkannt blieb.
• In alten Zeiten gab es den Berufsstand des Hefners, der sich um die Lieferung eines guten Brauansatzes kümmerte.
• Der Hefner erntete und bereitete die Hefe für die nächste Fermentation auf.
• Der Beruf des Hefners wurde im 19. Jahrhundert überflüssig, da die Wissenschaft ihn wegrationalisierte.
• Die Spaten-Brauerei war für die Entwicklung der untergärigen Bierherstellung in Deutschland von Bedeutung.
• Spaten begann 1397 als Brauhaus in München und wurde 1622 von der Familie Sedlmayr übernommen.
• Gabriel Sedlmayr I. übernahm die Brauerei im Jahr 1807.
• Gabriel Sedlmayr der Jüngere beschrieb den Peeterman als das "non plus ultra des schlechten Bieres".
• Der Peeterman ist ein ungefiltertes Bier mit 6 % Alkohol.
• Es zeichnet sich durch seine Frische und seinen leicht sauren Charakter durch den Weizen aus.

Evolution von Saccharomyces carlsbergensis

• Saccharomyces eubayanus hat den Clade 1.
• Saccharomyces cerevisiae hat auch Clade 1.
• Naumovia castellii liegt im Clade 3.
• Vanderwaltozyma polyspora liegt im Clade 6.
• Lachancea thermotolerans liegt im Clade 6.
• Lachancea waltii liegt im Clade 10.
• Lachancea kluyveri liegt im Clade 10.
• Ashbya gossypii liegt im Clade 12.
• Eremothecium cymbalariae liegt im Clade 12.
• Die Hybridstruktur und Aneuploidie von Lagerhefen führen zu Irregularitäten in der Meiose, was schlechte Sporulationsfrequenzen und geringe Lebensfähigkeit der Sporen zur Folge hat.

Die Suche nach dem 2. Elternteil

• Libkind et al. veröffentlichten 2011 eine Studie über die Domestizierung von Mikroben und die Identifizierung des wilden genetischen Stamms von Lagerbierhefe.
• Die Domestizierung von Pflanzen und Tieren förderte den Übergang der Menschheit von nomadischen zu sesshaften Lebensweisen sowie demografische Expansion und die Entstehung von Zivilisationen.
• Prozesse der Domestizierung von Mikroben bleiben unklar, trotzdem ihre Bedeutung für die Produktion von Lebensmitteln, Getränken und Biotreibstoffen haben.
• Lagerbier, gebraut im 15. Jahrhundert, verwendet eine allotetraploide Hybridhefe, Saccharomyces pastorianus, eine domestizierte Art, die durch die Fusion einer Saccharomyces cerevisiae Ale-Hefe mit einer unbekannten kältetoleranten Saccharomyces-Art entstanden ist.
• Wir berichten über die Isolierung dieser Art und bezeichnen sie als Saccharomyces eubayanus sp. nov., da sie Saccharomyces bayanus ähnelt (ein komplexer Hybrid aus S. eubayanus, Saccharomyces uvarum und S. cerevisiae, der nur in der Brauumgebung vorkommt).
• Populationen von S. eubayanus und ihre Schwesterart S. uvarum existieren in den Nothofagus-Wäldern Patagoniens in scheinbarer Sympatrie, sind aber genetisch durch intrinsische postzygotische Barrieren und ökologisch durch Wirtspräferenz isoliert.
• Der Entwurf der Genomsequenz von S. eubayanus ist zu 99,5 % identisch mit dem Nicht-S. cerevisiae-Anteil der S. pastorianus-Genomsequenz und deutet auf spezifische Veränderungen im Zucker- und Sulfitstoffwechsel hin, die für die Domestizierung in der Lagerbier-Brauumgebung entscheidend waren.
• Die Kombination von mikrobieller Ökologie mit vergleichender Genomik erleichtert die Entdeckung und Konservierung von Wildtypen domestizierter Mikroben zur Rückverfolgung ihrer Geschichte, Identifizierung genetischer Veränderungen und Ermittlung von Wegen zur weiteren industriellen Verbesserung.
• Eine neue Hefeart wurde gefunden, aber sie kann nicht ein Elternteil der Lagerbier-Hefen gewesen sein.
• Lagerbier wurde im 15. Jahrhundert gebraut.
• Es kann nicht sein, dass diese Hefe aus Patagonien den Weg nach Europa gefunden hat.

Die Marco Polo Hefe

• Jüngst wurde die These eines patagonischen Ursprungs der Lagerhefe aufgestellt, basierend auf der Entdeckung einer neuen kältetoleranten Spezies der Gattung Saccharomyces aus patagonischen Urwäldern Argentiniens.
• Diese Hefe, S. eubayanus, wies mit 99,56 % die größte Übereinstimmung mit dem Nicht-Ale-Anteil der Lagerhefe auf und galt somit als ihr Vorfahre.
• Es wird jedoch gezeigt, dass diese Hefe wahrscheinlich im tibetischen Hochland heimisch ist.
• Eine der tibetischen Populationen der Art weist eine größere Affinität zur Lagerhefe auf als die patagonische Population, was auf populationsgenetischen und genomsequenziellen Analysen basiert.
• Es gibt starke Beweise für die These eines fernöstlich-asiatischen Ursprungs der Lagerhefe, der offenbar besser zu Geografie und Welthandelsgeschichte passt.

Marco Polo

• Marco Polo lebte von 1254 bis 1324.
• Polo vermachte fast alles seiner Frau und seinen drei Töchtern und brach mit der Tradition, dass Männer ohne Söhne ihren Besitz an männliche Mitglieder der Großfamilie übergaben, und ließ Pietro Tartaro frei.

Ursprung der Lagerbierhefe

• Saccharomyces cerevisiae hat eine maximale Wachstumstemperatur von 41-42°C.
• Saccharomyces paradoxus hat eine maximale Wachstumstemperatur von 37-38°C.
• Saccharomyces mikatae ,eine maximale Wachstumstemperatur von 37-38°C, ist eine Lager Yeast Hybrid.
• Saccharomyces jurei hat eine maximale Wachstumstemperatur von 36-37°C.
• Saccharomyces arboricola hat eine maximale Wachstumstemperatur von 34-35°C.
• Saccharomyces kudriavzevii hat eine maximale Wachstumstemperatur von 33-34°C.
• Saccharomyces eubayanus hat eine maximale Wachstumstemperatur von 34-35°C.
• Saccharomyces uvarum hat eine maximale Wachstumstemperatur von 34-35°C.

Die Lagerbier-Hefe oder viele ??

• Louis Pasteur lebte von 1822 - 1895.
• Im Jahre 1976 verfasste er die Studie "Etudes sur la biere".
• Er fand heraus, dass Bier durch Mikroorganismen, hauptsächlich Bakterien, ungenießbar gemacht wird.
• Emil Chr. Hansen fand heraus, dass Mikroorganismen durch Hefen verursacht werden.

Das Carlsberg Laboratorium

• Emil Chr. Hansen etablierte als Erster die Hefereinkultur Carlsberg Unterhefe No1 - Saccharomyces carlsbergensis im Jahre 1883.

Wie haben die Hefe-Reinkulturen die Fermentation verbessert?

• Hefe-Reinkulturen ermöglichen eine präzise Kontrolle über den Gärungsprozess
• Man kann den gesamten Prozess besser steuern, indem man mit einer kleinen Menge einer bestimmten Hefereinkultur, dem Inokulum, beginnt.
• Die Verwendung der gleichen Hefereinkultur gewährleistet die gleichen Eigenschaften des Endprodukts.
• Der Fermentationsablauf ist besser planbar und reproduzierbar.
• Reinkulturen steigern die Effizienz der Fermentation deutlich.
• Reinkulturen können gezielt auf die effiziente Nutzung bestimmter Nährstoffe zugeschnitten werden.
• Durch aerobe Fermentation und optimierte Bedingungen wird eine maximale Vermehrung der Hefezellen erreicht.
• Der Einsatz von Reinkulturen reduziert das Risiko unerwünschter Mikroorganismen.
• Die ersten Vermehrungsstufen erfolgen unter sterilen Bedingungen, wodurch Fremdorganismen ausgeschlossen werden.
• Hohe Konzentrationen der Reinkultur hemmen das Wachstum von Kontaminationen.
• Reinkulturen können für bestimmte Anwendungen optimiert werden.
• Hefestämme können für bestimmte Produkte oder Prozesse selektiert und gezüchtet werden.
• Die Auswahl geeigneter Stämme ermöglicht eine höhere Reinheit und Qualität des Endprodukts.
• Durch diese Verbesserungen haben Hefereinkulturen die industrielle Fermentation revolutioniert und in verschiedenen Bereichen wie Backhefe, Brauerei und Biotechnologie zu deutlichen Verbesserungen in Bezug auf Qualität, Effizienz und Kontrolle geführt.
• Als Nachfolger von Professor Hermann Müller (Thurgau) war er von 1891 bis 1903 Leiter der Pflanzenphysiologischen Versuchsstation in Geisenheim.
• Im Jahr 1903 wurde er zum Professor und Direktor der Pflanzenphysiologischen Versuchsstation ernannt.
• Wortmanns Forschungsschwerpunkt in Geisenheim war die Gärungsphysiologie.
• Er erkannte frühzeitig den praktischen Wert des wissenschaftlichen Verständnisses der Fermentation.
• 1894 gründete er in Geisenheim die erste Hefereinzuchtstation.
• Diese Station leitete er bis 1924.

Evolution von Saccharomyces carlsbergensis

• Die Genomsequenz von Saccharomyces carlsbergensis, der weltweit ersten Reinkultur-Lagerhefe, wurde entschlüsselt
• Andrea Walther, Ana Hesselbart und Jürgen Wendland publizierten die Studie.

Genomik von Lagerhefen

• Chromosomenumlagerungen
• Chromsomenverlust
• Saccharomyces carlsbergensis

Ploidie von Lagerhefen

• Lagerhefen der Gruppe I, S. carlsbergensis (CBS 1513). haben ~3n
• Lagerhefen der Gruppe II: Weihenstephan haben ~4n
• Hybrid Vigor ist die Steigerung bestimmter Merkmale wie Wachstumsrate, Größe, Fruchtbarkeit, Ertrag usw. eines Hybriden im Vergleich zu seinen Eltern.
• Hybrid Vigor wird oft als Heterosis bezeichnet.
• Die genauen Ursachen dafür sind nicht bekannt, aber die Neukombination von Genen ermöglicht es.
• Hybride haben postzygotische Fruchtbarkeitsprobleme, also Sterilität.
• Veränderungen der Chromosomenzahl beflügeln die Artbildung.

Genomik von Lagerhefen

• Sc-Typ Subgenom
• Se-Typ Subgenom
• Se II-IV Translokation
• Se VIII-XV Translokation
• Sc V-XI Translokation

Yeast Breeding

• Die Verbesserung von Ale oder Lagerhefen durch konventionelle Züchtung ist eine nicht-triviale Aufgabe.
• Die Domestizierung von Lagerhefen, die Hybride zwischen Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces eubayanus sind, hat zu entwickelten Stämmen geführt, die aufgrund von z.B. postzygotischen Barrieren, stark reduzierte oder aufgehobene sexuelle Fortpflanzungsfähigkeiten aufweisen.
• Andererseits zeigten S. cerevisiae Ale-Hefen, insbesondere Kveik Ale-Hefestämme, dass sie reichlich lebensfähige Sporen produzieren (~ 60%; Dippel et al. Microorganisms 10(10):1922, 2022).
• Die Untersuchung der Nützlichkeit von Kveik-Hefen für die konventionelle Hefe-Züchtung wird ermöglicht.
• Überraschenderweise konnten heterothallische Kolonien aus gekeimten Sporen verschiedener Kveik-Stämme isoliert werden.
• Diese Stämme zeigten stabile Paarungstypen im Konfrontationstest mit Pheromon-sensitiven Teststrängen.
• Heterothallismus war auf inaktivierende Mutationen in ihren HO-Genen zurückzuführen.
• Diese führten zu Aminosäureaustauschen im Ho-Protein, wodurch eine bekannte G223D-Mutation und auch eine neue G217R-Mutation aufgedeckt wurden, die beide den Paarungstyp-Switching unterbanden.
• Stabile MATa- oder MATa-Linien von vier verschiedenen Kveik-Hefen wurden erzeugt, genannt Odin, Thor, Freya und Vör.
• Analysen der Knospennarbenpositionen in diesen Stämmen zeigten sowohl axiale als auch bipolare Knospenmuster.
• Die Fähigkeit von Freya und Vör, lebensfähige meiotische Nachkommen mit haploiden Teststammlösugen zu bilden, zeigte, dass diese Stämme haploid sind.
• Fermentationsanalysen zeigten, dass alle vier Hefestämme in der Lage waren, Maltose und Maltotriose zu fermentieren.
• Es wurde festgestellt, dass Odin nicht nur Mutationen im HO Gen aufwies, sondern auch inaktivierende Mutationen in den PAD1- und FDC1-Genen mit Lagerhefen teilte, was diesen Stamm zu POF- macht, d. h. nicht in der Lage ist, phenolische Fehlaromen zu erzeugen, ein Schlüsselmerkmal für die Lagerhefestämme.
• Diese aus haploiden Ale-Hefen gewonnen Stämme ebnen möglicherweise neue Wege zur Erzeugung von neuartigen Lagerhefestämmen durch Züchtung oder Mutation und Selektion unter Nutzung der Stärken der Hefegenetik, wodurch eine Blockade aufgehoben wird, die die Domestizierung von Lagerhefen verursacht hat.
• Andererseits zeigten S. cerevisiae-Ale-Hefen, insbesondere Kveik-Ale-Hefestämme, dass sie reichlich lebensfähige Sporen produzieren (ca. 60 %; Dippel et al. Microorganisms 10(10):1922, 2022).

Wie war das mit POF-?

• Pad1 bindet FMN (Flavin-Mono-Nukelotid) ist
• Ein Cofaktor, der für die Aktivität von Fdc1p benötigt wird

Dieser Text behandelt die Entstehung der Lagerbierhefe, den Beitrag von Louis Pasteur zur Bierqualität und die Bedeutung der Hybridisierung. Zudem werden die Unterschiede im Ansatz von Pasteur und Hansen sowie die Charakteristika des Peeterman-Biers beleuchtet. Abschließend wird auf den Einfluss der Domestizierung eingegangen.