Biologia Molecolare - 'I Magici Quattro' PDF

11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 ‘I MAGICI QUATTRO’ L’importanza del gene MYC nell’epigenetica Come già accennato nella lezione precedente, nel 2006 il gruppo Yamanaka ha caratterizzato la procedura, successivamente premio N...

11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 ‘I MAGICI QUATTRO’ L’importanza del gene MYC nell’epigenetica Come già accennato nella lezione precedente, nel 2006 il gruppo Yamanaka ha caratterizzato la procedura, successivamente premio Nobel, e ha gettato le basi di ricerca e applicazione che dominano i nostri computer e i nostri laboratori di ricerca. Questo scoperta ha dato un’importante svolta all’approccio terapeutico di varie patologie perché ha dimostrato che con una serie di esperimenti di validazione, che consistevano nel trasferimento in cellule pienamente differenziate (fibroblasti dermici) di 4 geni, in seguito all’espressione di questi, le cellule erano capaci di re-invertire il proprio fenotipo differenziato e tornare allo stato di pluripotenza. Quest’ultimo è lo stadio che permette loro di perdere i caratteri specifici della linea cellulare propria e di tornare ad uno stato indifferenziato tale da godere di una plasticità che consenta loro la differenziazione in cellule dei tre foglietti embrionali. Si è notato che i fibroblasti che vengono trattati in modo da far esprimere al proprio interno i 4 geni (OCT 3/4, SOX 2, MYC e KLF4), entro qualche giorno tornano allo stato di IPS. Questa procedura venne svolta per la prima volta nel 2006 sulle cellule di roditore e già l’anno seguente sulle cellule umane. Questi 4 geni che codificano per fattori di trascrizione; va a validare che la trascrizione eucariote è governata da una gerarchia e cooperazione tra fattori di trascrizione, elementi prossimali e elementi distali che influenzano collettivamente l’attività dell’RNA polimerasi al fine di coordinare una risposta che può essere variata e potenziata in n+1 modi a seconda dello stato della cellula. Questi fattori trascrizionali sono normalmente espressi a livello embrionale: l’RNA MYC è espresso in tutte le cellule che vanno incontro a proliferazione. Perché solo questi 4 fattori siano capaci di re-invertire il fenotipo è ancora ignoto ma si è visto che bastano per stravolgere il piano trascrizionale della cellula differenziata e riattivare il piano della cellula totipotente. Queste 4 proteine sono dette “i magici 4” perché ancora oggi, in qualsiasi cellula differenziata, la loro espressione basta per re-invertire il fenotipo, violando il canone di un differenziamento terminale che è insito nel programma di differenziamento di un organismo pluricellulare. Queste proteine hanno un ruolo importante nel fornire l’indicazione che la cellula embrionale deve seguire per giungere al differenziamento; fatta eccezione MYC. Sbobinatore: Anna Di Iorio Revisore: Roberto Saccone 11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 IL FATTORE DI TRASCRIZIONE MYC MYC è un fattore di trascrizione ubiquitario che lavora sui promotori dell’RNA polimerasi II con un partner detto MAX. La coppia MYC-MAX costituisce un dimero che è attivo praticamente in tutti i tipi di cellule. L’azione di questo dimero si esplica nei setting proliferativi: i geni regolati da MYC e MAX sono spesso coinvolti nell’entrata della cellula in fase S, governando quindi i meccanismi di proliferazione. In particolare, questo fattore di trascrizione MYC è stato identificato in diverse isoforme: 1. C-MYC o cellular myc: il gene che codifica per proteine che fisiologicamente governano l’entrata in ciclo delle cellule. 2. N-MYC o neuronal-myc 3. L-MYC o linfatic-myc 4. V-MYC o viral myc: induce trasformazione nelle cellule infettate da un determinato virus. N-MYC e L-MYC sono proteine le cui versioni sono particolarmente espresse in neoplasie a carico del SNC. MYC PROTOONCOGENE VS MYC ONCOGENE MYC è un protooncogene. Un oncogene è un gene il cui mal funzionalmente può portare a trasformazione neoplastica. Se correttamente funzionante, però, la molecola non è nociva. Nel genoma sono stati codificati molti geni che se non funzionano inducono trasformazione neoplastica: praticamente tutti i geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare. Si parla di protooncogene quando ci si riferisce ad un gene normale che in seguito a mutazioni può diventare un oncogene: C-MYC è un protooncogene insito nel nostro genoma, la cui espressione regolata porta le cellule a proliferazione. Le versioni oncogeniche sono le versioni mutate di MYC. N-MYC è la versione mutata che causa un’astrocitoma e quindi questa è una sequenza oncogenica. C-MYC invece è presente solitamente a livello intestinale ed è un protooncogene: quindi C-MYC in qualità di protooncogene governa la trascrizione di geni chiave coinvolti nella maggior parte dei meccanismi che regolano la normo- fisiologia cellulare con rilievo sui meccanismi proliferativi. Sbobinatore: Anna Di Iorio Revisore: Roberto Saccone 11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 Una de-regolazione di MYC porta a proliferazione incontrollata e immortalizzazione delle cellule. Per quanto riguarda l’isoforma N-MYC, vi è una relazione diretta tra mutazione e neoplasia: nel caso di una mutazione a carico di questa isoforma, si incorre in un’alterazione della proliferazione nelle cellule staminali di un tumore preciso, il neuroblastoma, tanto da correlare N-MYC con la sua insorgenza. DIBATTITO SU CELLULE STAMINALI Usare questo tipo di molecola difficile e pericolosa nel processo di riprogrammazione è stato fin da subito criticato poiché la sua manipolazione in vivo e vitro ha suscitato numerosi dubbi e perplessità che hanno bloccato, per lo meno in principio, l’utilizzazione di questo gene. Successivamente, per fortuna, le cellule IPS hanno ri-aperto infinite possibilità terapeutiche, baipassando le applicazioni delle cellule embrionali staminali. Il dibattito sulle cellule embrionali staminali è morto naturalmente perché toccare gli organismi nelle primissime fasi di sviluppo a fine applicativi non ha più senso se si può arrivare alla pluripotenza manipolando semplicemente i magici 4 geni in vitro. Ogni qualvolta ci si imbatte in un processo naturale come il differenziamento verso una determinata linea cellulare, bisogna tener conto dei numerosi rischi: è una ricerca molto complessa, poiché il minimo errore fa implodere il sistema applicativo. RIPROGRAMMAZIONE IPS VS TRANSDIFFERENZAZIONE Per semplificare la strada alla translazionalità, in clinica si è cercato di evitare la ri-programamzione della cellula differenziata a pluripotente indotta, preferendo cercare di cambiare le caratteristiche differenziate di una cellula con quelle di un’altra. Gli studi si sono focalizzati nel trasformare direttamente un fibroblasto in un progenitore del sangue, invece di passare per la riprogrammazione delle IPS RIPROGRAMMAZIONE ATTRAVERSO IPS: Prima da una biopsia o prelievo ematico, si otteneva una coltura in vitro che veniva rimaneggiata dai magici 4, riportando la coltura a cellule IPS che venivano successivamente differenziate in una determinata linea. TRANSDIFFERENZAZIONE: Ad oggi da una biopsia dermica o da un prelievo ematico si può passare direttamente ad un altro tipo di cellula differenziata, usando questo salto di identità per ogni specifica linea cellulare dei fattori di trascrizione tessuto-specifici caratterizzati nel corso degli anni, evitando così il passaggio nelle cellule IPS. Sbobinatore: Anna Di Iorio Revisore: Roberto Saccone 11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 Dall’immagine si può notare che con la transdifferenziazione si salta un passaggio. Lo scopo di questa ricerca è, quindi, quella di avere un modello in vitro studiabile per capire i meccanismi molecolari che regolano le cellule normali che per un paziente x sono diventate patologiche e utilizzare queste cellule per screenare o correggere in vitro oppure direttamente in vivo la mutazione. Già in vitro si crea il modello della patologia specifica di un determinato paziente che presenta una determinata mutazione in uno specifico punto. L’idea è di spingere il sistema di assistenza clinica verso il considerare i pazienti con patologia riconducibile alla mutazione affinché venga creato per ogni singolo letto ospedaliero un modello proprio: terapia personalizzata. Ad oggi questa tecnologia è a disposizione di tutti e i costi sono del tutto esigui. APPLICAZIONE SUI PAZIENTI Così come la traslazione è possibile per le cellule neuronali, è possibile anche per le cellule cardiache. Grazie alla soppressione di alcuni fattori di trascrizione specifici in determinate linee cellulari è possibile re-invertire completamente il fenotipo. Ad esempio, cellule pluripotenti indotte che erano i monociti di un paziente con mutazione strutturale in cellule del sarcomero, sono state riprogrammate a cardiomiociti a partire da un prelievo di sangue e successiva coltivazione in vitro. L’idea è, avendo un paziente, passare per la riprogrammazione qualora la mutazione sia espressa in diversi tipi cellulari (se interessasse un solo distretto basterebbe la traslazione), poi alle IPS e infine ottenere una banca che il ricercatore va a differenziare dal punto di vista neuronale, cardiomiocitario, ecc. Tutto ciò col fine di ottenere una manipolazione in vitro che porti al fenotipo patologico tipico del soggetto in esame e poter quindi optare per un trattamento terapeutico, farmacologico o di correzione genica specifica per il paziente in questione. Sbobinatore: Anna Di Iorio Revisore: Roberto Saccone 11.1 Biologia molecolare 21/11/2023 LA RIPROGRAMMAZIONE CELLULARE Osservando le cellule che passano attraverso gli stadi che nell’embrione caratterizzano lo sviluppo verso una linea cellulare, si nota che la riprogrammazione di cellule come le progenitrici cardiache a cardiomiociti avviene entro 10 giorni dal prelievo. Dopo si ha una fase di caratterizzazione che può durare moltissimo. Questo tipo di cellule riprogrammate presentano un’onda di contrazione, un movimento spontaneo cellulare, che segue la riprogrammazione: questa ondata di contrazione è tipica delle cellule riprogrammate a cardiomiociti. Il vantaggio di questo tipo di riprogrammazione è che rende possibile compiere un processo di ingegnerizzazione così da rendere la coltura in due dimensioni più simile alla tridimensionalità dell’organo: in 20 giorni si è capaci di ottenere strutture tridimensionali che si contraggono e che sono un modello accettato anche in preclinica come modello tridimensionale. Ricollegandosi ai cardiomiociti citati in precedenza, è possibile ottenere un tessuto cardiaco tridimensionale con due strutture di silicone flessibile che mimano le resistenze cardiache: su un modello di questo tipo le cellule cardiache del paziente possono essere studiate dal punto di vista elettrofisiologico (es. difetti di contrazione cardiaca e fibrillazioni). MODIFICHE EPIGENETICHE PRENATALI Il contenuto a livello genico delle cellule e le modificazioni epigenetiche del genoma sono molto importanti sia per la specificazione dei tratti delle singole cellule sia per le ondate di riprogrammazione che l’embrione umano subisce. Al giorno d’oggi, molti tratti patologici infantili sono da ricondurre a difetti delle modificazioni epigenetiche a livello del genoma di origine materna o paterna. Per quanto concerne le neuropatologie o i difetti comportamentali, è stata notata una correlazione tra l’insorgenza di malattie psichiatriche e l’influenza su di esse del contenuto epigenetico soprattutto paterno. Ci sono studi epigenetici con una valenza statistica importante, pubblicati su giornali terzi nel ranking mondiali, che tramite esperimenti su roditori, testimoniano statisticamente la capacità dei gameti maschili di trasmettere stati di ansia o di instabilità emotiva al figlio. Molto probabilmente l’attenzione della clinica psichiatrica determinerà un’importante svolta in questo campo nei prossimi anni. TRATTAMENTO E MANIPOLAZIONE EPIGENETICA E RINGIOVAMENTO Nel 2020 è stato pubblicato un articolo su Nature che afferma come, manipolando dal punto di vista genetico i progenitori della visione, si riesca a ripristinare un fenotipo giovanile in caso di patologie ben precise: si tratta di manipolazioni a livello di enzimi che danno tratti epigenetici. Sbobinatore: Anna Di Iorio Revisore: Roberto Saccone