Biologia Molecolare Past Paper (27/11/2023) PDF

12.1 biologia molecolare 27/11/2023 La prof. sottolinea che questo argomento è molto importante perché le prospettive applicative avranno uno sviluppo eccezionale nei prossimi anni. RIASSUNTO DELLE LEZIONI PRECEDENTI Nelle lezioni pr...

12.1 biologia molecolare 27/11/2023 La prof. sottolinea che questo argomento è molto importante perché le prospettive applicative avranno uno sviluppo eccezionale nei prossimi anni. RIASSUNTO DELLE LEZIONI PRECEDENTI Nelle lezioni precedenti si è iniziato a capire che cosa sono i miRNA e si è visto come queste sequenze, che derivano da precursori di lunghezza maggiore rispetto alla molecola matura, siano parte integrante del genoma umano, avendo un’organizzazione architettonica simile a quella dei geni che codificano le proteine. Sono presenti geni che codificano per il miRNA all’interno delle sequenze non codificanti, a livello degli introni e degli esoni; molto spesso le famiglie di miRNA sono riunite in un’unica regione del genoma e la trascrizione di queste sequenze è regolata da un promotore dedicato. Si è poi analizzato come i miRNA riescano ad eseguire tutte le proprie funzioni di regolazione dell’espressione dei target multipli, di sequenze bersaglio multiple, in quanto esiste una specificità di riconoscimento tra il miRNA e la sequenza 3’ UTR di diversi RNA messaggeri. Multipli miRNA possono targettare lo stesso tipo di RNA messagero e le combinazioni multiple in queste situazioni portano ad una situazione estremamente variabile dal punto di vista della regolazione. Perciò ad oggi non è prevedibile quando, come e a che livello un miRNA sia realmente espresso all’interno della cellula perché non basta considerare il proprio messaggero, ma si deve tener conto di tutti i miRNA che eventualmente vanno a modulare l’espressione, quindi la traduzione, di un dato RNA messaggero. FUNZIONAMENTO DEI MICRORNA/INTERAZIONE miRNA-mRNA Una volta che all’interno del citoplasma di una cellula si ha una sequenza matura (un miRNA maturo), si può andare incontro a due diverse situazioni: COMPLEMENTARIETÀ PERFETTA: Il miRNA trova una complementarietà perfetta con il proprio messaggero bersaglio; CONSEGUENZA: l’RNA messaggero va incontro a degradazione attraverso l’azione di endonucleasi citoplasmatiche che lo distruggono, facendo completamente scomparire quello che è il messaggero per una data proteina e, quindi, rendendo a zero l’espressione della stessa. COMPLEMENTARIETÀ IMPERFETTA: Il miRNA trova una complementarietà imperfetta, ovvero trova appaiamento per alcune basi della propria sequenza, ma altri nucleotidi non trovano un perfetto match sul RNA messaggero (target) creando una sorta di bolla. CONSEGUENZA: si va incontro a quella che viene definita repressione traduzionale, che comporta un rallentamento della produzione del prodotto proteico al livello citoplasmatico dalla macchina ribosomiale. Storicamente il meccanismo di regolazione degli RNA messaggeri attraverso complementarietà perfetta è tipica del mondo VEGETALE. Le cellule del mondo ANIMALE, dei vertebrati e dei mammiferi in particolare, preferiscono la complementarietà imperfetta come modulazione, i cui vantaggi sono innegabili. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 VANTAGGI DELLA COMPLEMENTARIETÀ IMPERFETTA COME SOPRESSIONE DELLA TRADUZIONE Perché la complementarietà imperfetta come regolazione della produzione proteica a partire da un RNA messaggero è più vantaggiosa in termini economici, fisiologici, rispetto alla soppressione per complementarietà perfetta? Se si distrugge completamente l’RNA messaggero (complementarietà perfetta), sicuramente la modulazione è efficacie, però risponde alla regola on-off e la cellula eventualmente dovrà ricominciare dalla trascrizione per arrivare al prodotto proteico. Nel caso della soppressione traduzionale ( complementarietà imperfetta), l’RNA messaggero viene posto come se fosse in stand by, quindi se le condizioni fisiologiche mutano tanto da rendere di nuovo necessaria l’espressione di un certo messaggero, la cellula ce l’ha già pronto, non deve ricominciare dalla trascrizione. MECCANISMI DI SOPRESSIONE COMPLEMENTARIETÀ PERFETTA Questo è il metodo preferito dalle cellule vegetali in natura (= fisiologicamente) ed è molto importante anche nelle cellule animali. Come si creano le condizioni per la degradazione del RNA messaggero? Non appena il miRNA identifica la zona di appaiamento e si lega alla regione 3’UTR, avvengono 3 passaggi che portano alla degradazione del messaggero stesso: 1) I’ mRNA maturo va incontro a deadenilazione, quindi viene eliminata la coda di Poli-A 2) Viene eliminato il cap (decapping) 3) La molecola diventa instabile e lo diventa ancora di più dall’azione di una esonucleasi specifica che incomincia a distruggerla completamente Questo è il meccanismo più efficacie per la degradazione diretta del RNA messaggero mediata dall’appaiamento perfetto del miRNA. COMPLEMENTARIETÀ IMPERFETTA Quando si vanno ad analizzare i meccanismi che portano alla repressione traduzionale, si nota che, una volta che i miRNA hanno riconosciuto il proprio target, si può assistere a 3 diverse situazioni: BLOCCO DELL’INIZIO DELLA TRADUZIONE: l’inizio della traduzione viene bloccato a causa di un’ interferenza con i fattori di inizio della traduzione, i quali non prendono contatto con L’ mRNA e non possono accedere a quella che è la piattaforma ribosomiale DEGRADAZIONE PEPTIDE NASCENTE: Il peptide che eventualmente è passato ai ribosomi incomincia ad essere degradato da proteasi citoplasmatiche che riconoscono l’mRNA appaiato al miRNA BLOCCO DELL’ ELONGAZIONE: Il fatto che il miRNA siano appaiati al proprio bersaglio crea una sorta di ingombro sterico che rende impossibile il processo di elongazione del peptide. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 In ogni caso, il processo di traduzione viene estremamente rallentato fino ad essere completamente bloccato. P-BODIES Che fine fanno i messaggeri, una volta che gli viene impedito il loro compito di produrre il peptide? Nelle cellule, gli mRNA con appaiati il proprio miRNA, che non hanno accesso ai ribosomi, vanno a concentrarsi in corpuscoli intracitoplasmatici chiamati P-BODIES (CORPUSCOLI P). I p-bodies sono definiti corpuscoli perché si può vedere all’interno di queste strutture una componente proteica importante. All’interno di queste vescicole sono presenti i messaggeri accoppiati al proprio miRNA o ai propri miRNA e queste strutture costituiscono una sorta di magazzino in cui i messaggeri, che vanno incontro a repressione traduzionale, vengono concentrati e conservati per tutto il tempo necessario fino a quando la cellula non sentirà la necessità di togliere il blocco traduzionale e riportare il messaggero alla piattaforma dei ribosomi. COME FUNZIONANO I MiRNA? ➔ La funzione primaria dei miRNA è quella di abbassare il livello proteico dei geni target In caso di appaiamento parziale, in cellule animali, si ha un abbassamento dei livelli proteici, ma comunque qualche molecola proteica può essere prodotta, in quanto il meccanismo non è di tipo on-off, ma è di repressione traduzione. Viceversa, se si ha il silencing mediato da un appaiamento perfetto tra il miRNA e il proprio bersaglio, allora l’RNA messaggero viene degradato a livello citoplasmatico in maniera efficacie e non viene prodotta la proteina. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 MICRORNA: NASCITA E SCELTA DEL BERSAGLIO La biogenesi del miRNA è composta da più passaggi, l’ultimo dei quali costituisce il meccanismo con cui un miRNA riconosce il proprio bersaglio. PRI-MIRNA La trascrizione del precursore del miRNA avviene ad opera delle RNA pol II, stesso complesso e procedimento visto precedentemente, come se i geni dei microRNA codificassero per un prodotto proteico. L‘azione della pol II genera un cosiddetto Pri-miRNA (= primary microRNA). Dunque il trascritto primario è costituito da una sequenza lunga 70-100 nucleotidi, caratterizzata da una successione di forcine che derivano dall’appaiamento spontaneo delle sequenze incluse nel pri- miRNA. Questo precursore a lunga catena è dotato di cap e coda poli-A, esattamente come un mRNA che codifica per un prodotto proteico. PRE-MIRNA All’interno del nucleo questo precursore subisce una prima modificazione enzimatica ad opera di una endonucleasi che identifica le singole forcine e crea delle molecole che corrispondono ad ogni singola forcina. Taglia quindi ogni singola forcina da questo precursore a multi-forcina, liberando singoli monomeri all’interno del nucleo, chiamati pre-microRNA, cioè precursis microRNA (= microRNA precursori). Queste molecole hanno la classica struttura a forcina, analizzata già nei procarioti, con una bolla ad un’estremità mentre l’altra estremità è lineare con protruding(= sporgenze) date dal non corretto appaiamento. La molecola con questa struttura viene riconosciuta da una molecola detta esportina, in particolare l’esportina numero 5, che accompagna le proteine che devono attraversare i pori nucleari, dal nucleo al citoplasma. L’esportina 5 riconosce il microRNA nelle estremità 5’-3’ e lo porta nel citoplasma. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 Il punto di riconoscimento all’estremità 5’->3’ è critico, in quanto i due filamenti risultano appaiati, ma non sono appaiati in maniera perfetta, quindi le estremità sono sfalsate. Questo è un elemento critico per l’export del pre-microRNA dal nucleo al citoplasma. PROTEINA DICER E LA STRUTTURA DUPLEX Questa molecola con ancora la conformazione a forcina classica, viene riconosciuta da un grosso complesso, che troviamo all’interno del citoplasma delle cellule, chiamato Dicer. Questa molecola è una RNasi, quindi un enzima in grado di riconoscere molecole di RNA a doppio filamento ed è in grado di tagliare questo tipo di molecole. Dicer riconosce il pre-microRNA ed elimina la bolla, ovvero processa il miRNA ad una forma chiamata duplex, cioè una forma a doppio filamento sempre con l’estremità sfalsate. Il prodotto di questo processamento citoplasmatico è una molecola di RNA a doppio filamento, lunga 20-25 nucleotidi, dotata di un fosfato in 5’ e di un ossidrile libero in 3’. Questa è la molecola critica, che è la chiave del processo di silencing. FILAMENTO GUIDA E PASSENGER STRAND Quando si passa dal pre-miRNA al miRNA maturo, i due filamenti appaiati avranno destini e funzioni diverse; La struttura duplex verrà riconosciuta da un grande complesso poliproteico, presente all’interno del citoplasma delle cellule che sarà la macchina che guiderà il microRNA sul proprio bersaglio e definirà il destino dei due filamenti. Soltanto il filamento guida (rosso) sarà il filamento che andrà ad appaiarsi con l’mRNA, mentre il filamento complementare, definito passenger strand (filamento passeggero), non ha alcuna funzione biologica. Quindi tendenzialmente il passenger strand va incontro a degradazione, mentre in rare eccezioni ha funzione biologica nel riconoscere degli altri mRNA. Fino al duplex quindi si ha un miRNA a doppio filamento e poi il complesso poliproteico porta a degradare il passsenger strand ed a selezionare dal pre-miRNA solo il filamento guida, che andrà a riconoscere il proprio mRNA target. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 COMPLESSO RISC La selezione tra i due filamenti viene attuata dal complesso RISC, una macchina molecolare ad altissima efficienza ed importanza nelle cellule eucariote, estremamente conservata dalla drosophila in poi. Questo complesso proteico riconosce il miRNA nella forma duplex e lo ingloba nella sua porzione più profonda, quindi viene caricato dal miRNA. In questa porzione profonda è presente una proteina chiamata argonauta, la quale è la chiave del meccanismo di azione del miRNA. La molecola argonauta è anche essa estremamente conservata ed è la molecola che riesce a riconoscere il miRNA nella forma duplex e fa la selezione del filamento guida. STRUTTURA DI ARGONAUTA L’argonauta ha una struttura estremamente conservata e presenta due domini critici: il primo riconosce l’estremità 3’, mentre l’altro il PIWI domain si ancora all’estremità 5’ fosfato del microRNA. Questa regione PIWI, una volta che il microRNA è stato teso da argonauta, è dotata di attività RNasica e svolge la sua attività nei confronti del filamento passenger, degradando questo filamento all’interno di RISC. Argonauta, perciò, è la molecola chiave che riconosce il precursore, riconosce il filamento guida e lo avvolge proteggendolo dalla propria attività RNAasica che viene espletata soltanto nei confronti del filamento passenger. All’interno di RISC, grazie all’azione di argonauta, si ha la selezione del filamento guida e la stessa proteina argonauta accompagna il miRNA maturo, il filamento guida, nel percorso di riconoscimento del proprio target RNA messaggero. Quando il miRNA si appaierà con il bersaglio, il tutto sarà protetto dal complesso argonauta altrimenti rischierebbero di andare incontro a degradazione per via delle endonucleasi molto abbondanti nel citoplasma delle cellule eucariote. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 PERCHÉ SI È MANTENUTO QUESTO MECCANISMO DI MODULAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Questo meccanismo di riconoscimento del duplex tra 2 molecole di RNA è un meccanismo alla base dell’evoluzione delle cellule eucariote, nel cammino verso gli organismo multicellulari. Il nostro genoma è pieno di sequenze virali che si sono integrate in regioni silenti che non vengono attivamente trascritte. Alcune particelle virali in grado di integrarsi sono virus, lentivirus e retrovirus e le loro sequenze non vengono trascritte, sono solo sparse nel nostro genoma. Accade però che questi virus si vadano ad integrare in Hot Spot trascrizionali, ovvero in punti dove l’attività trascrizionale della pol II è estremamente attiva. Questo sarebbe un danno perché la cellula sarebbe invasa dalle cellule virali. Il meccanismo di riconoscimento di RNA a doppio filamento è una sorta di sistema immunitario cellulare endogeno che porta le cellule eucariote a riconoscere in maniera specifica gli RNA a doppio strand come molecole estranee e a degradarle. Tale meccanismo mima quello che è lo step essenziale nella biogenesi dei virus che si sono andati a integrare all’interno del genoma, i quali in caso di slattentizzazione della propria espressione, andrebbero incontro a step precisi simili ai passaggi del meccanismo di silenziamento mediato dai miRNA. Queste ipotesi sono basate su delle evidenze in letteratura, in cui la replicazione di numerosi lentivirus e retrovirus sfrutta la capacità di appaiamento tra molecole di RNA complementari per andare a modulare l’espressione di proteine chiave. ESEMPIO: Nella propria biogenesi l’HIV sfrutta delle fasi in cui il proprio genoma è un duplex RNA ed esistono delle molecole endogene delle cellule infettate capaci di andare a bloccare fasi specifiche del ciclo vitale del HIV. Quindi di fatto questo meccanismo di riconoscimento di RNA, mediato da altre molecole di RNA, è efficacie nel caso dell’HIV, della slattentizzazione dei genomi virali incorporati all’interno del nostro genoma ed, in quanto efficacie, è stato mantenuto come meccanismo di regolazione dell’espressione genica all’interno del citoplasma delle cellule eucariote. Questo tipo di modulazione non può essere sfruttata nel caso in cui i retrovirus decidano di excidere il proprio genoma da quello della cellula ospite e attivare il proprio ciclo vitale. Per questo la macchina molecolare che porta alla produzione dei miRNA è fondamentale per lo sviluppo degli organismi eucariote superiori. L’importanza della macchina nell’espressione genica è sottolineata anche dal knock out delle proteine drosha, dicer e argonauta, blocca lo sviluppo embrionale nelle primissime fasi delle divisioni, nel stadio pre gastrulazione. NUOVA VISIONE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE Fino ad ora il modo di pensare dell’uomo è sempre stato positivo, ovvero si è sempre pensato che il meccanismo di funzionamento della cellula, basato sul dogma centrale, fosse regolato da prodotti Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace 12.1 biologia molecolare 27/11/2023 proteici che esercitano un certo tipo di azione (si pensi alle polimerasi, replicasi…). Questo modo di pensare è frutto della biologia molecolare degli ultimi 80-100 anni. Al giorno d’oggi si è scoperto, analizzando ogni singolo mRNA, che essi possono essere il bersaglio di numerosi miRNA che vanno a eliminare il messaggero o a modularne l’efficienza di traduzione, si sta così cambiando il modo di pensare, l’interpretazione del funzionamento di una cellula. Il passaggio da cellula staminale a cellula differenziata, può essere un passaggio mediato dall’espressione di una proteina X oppure è un passaggio che può essere mediato dall’inibizione di una proteina Y ad opera di un miRNA. Due modi diversi di vedere la stessa cosa, la visione dell’espressione genica viene quindi stravolta dalle molecole di miRNA. Anche in letteratura si inizia a parlare non più di proteine espresse ma di inibizione ed attivazione ad opera dei miRNA, diventati gli elementi regolatori anche nei processi di differenziazione delle cellule. Questa è la spiegazione del paradosso C, la versione 2.0 del dogma della biologia molecolare, che praticamente non ha più modo di esistere. Questo tipo di visione complica le cose perché, se ci fosse una corrispondenza 1:1 tra miRNA e il proprio target, sarebbe semplice, ma il quadro biologico è più complicato perché più miRNA vanno a targettare uno stesso tipo di molecola. Quindi per spiegare come avvenga il passaggio dallo stadio A e allo stadio B bisogna andare a identificare tutti i miRNA che vanno a targettare quella molecola precisa. ONCOGENI E ONCOSOPPRESSORI I miRNa sui testi sono definiti come oncogeni o come oncosoppressori. a) Se un miRNA va ad inibire l’espressione di un oncogene, allora la sua funzione è quella di oncosoppressore. b) Se il miRNA va ad inibire l’espressione di una proteina che blocca il ciclo cellulare, il miRNA è un oncogene perché la sua assenza determina proliferazione incontrollata. Sbobinatore: Francesca Ostan Revisore: Benedetta Bonapace