Biologia Molecolare - Past Paper PDF

9.2 biologia molecolare 19.11.2024 PROTEINA DICER E RNA DUPLEX Il pre-microRNA, ancora nella sua conformazione di forcina classica (doppio filamento che presenta sulla destra un’ansa), entra nel citoplasma dove viene riconosciuto da...

9.2 biologia molecolare 19.11.2024 PROTEINA DICER E RNA DUPLEX Il pre-microRNA, ancora nella sua conformazione di forcina classica (doppio filamento che presenta sulla destra un’ansa), entra nel citoplasma dove viene riconosciuto da un grosso complesso proteico chiamato Dicer. Questa molecola è una ribonucleasi in grado di riconoscere la molecola di RNA a doppio filamento e tagliarla. Una volta che il pre-microRNA è entrato nel citoplasma, viene riconosciuto dal Dicer, che processa il miRNA andando ad eliminare la bolla (ansa) dell’RNA ed ottenendo una nuova forma chiamata duplex, cioè un doppio filamento di RNA con le estremità sempre sfalsate. L’RNA duplex è formato da due filamenti antiparalleli, lunga 20-22 nucleotidi, dotata di un fosfato in 5’ e di un ossidrile libero in 3’. Questa molecola è la chiave nel processo di silenziamento. Gli acidi nucleici, infatti riescono ad innescare il meccanismo molecolare che porta al silenziamento di specifici messaggeri solo se hanno questa struttura: cioè, disposti a doppio filamento ma con le estremità sfalsate (i 3' -OH non sono appaiati ma leggermente sfalsati). Le molecole a doppio filamento sfalsato silenziano l'espressione dei trascritti per la loro natura chimica. Usando la tipica nomenclatura di biologia molecolare, il filamento senso dell'RNA duplex è convenzionalmente quello che ha il 5' a sinistra e il 3' -OH a destra (e quindi si "legge" come leggiamo noi). COMPLESSO RISC Il complesso che si occupa della selezione dei due filamenti (guide strand o passenger strand) dell’RNA duplex è il complesso RISC, una macchina molecolare ad altissima efficienza ed importanza nella cellula eucariote, estremamente conservata dalla Drosophila in poi. Cardine nel meccanismo di silenziamento, questo complesso proteico è estremamente presente nel citoplasma di tutte le nostre cellule ed ha un altissimo peso molecolare. Sbobinatore: Ilaria Baroncini Revisore: Elena Gaggiato 9.2 biologia molecolare 19.11.2024 La funzione più importante è quella che vede il RISC legare il miRNA scelto, e guidarlo fino a raggiungere l'mRNA target, oltre che nel processo di appaiamento e riconoscimento di tale bersaglio. Questo complesso multiproteico capta l'RNA duplex appena processato da Dicer, seleziona il filamento senso (da cui ricava il miRNA, degradando anche molto spesso il passenger strand), e, una volta scelto il miRNA maturo, una sua subunità vi si lega saldamente e lo accompagna fin sul messaggero target, restando associato ad esso in maniera stabile. Il grosso del compito è svolto da questa subunità del complesso RISC, dal nome Argonauta (Ago). La molecola Argonauta riconosce il duplex e poi lo lega a sé in maniera stabile e irreversibile, sia all’estremità 3’ che a quella 5’. STRUTTURA DI ARGONAUTA Dopo aver legato l’RNA duplex, Argonauta, attiva la propria attività endonucleasica e degrada il passenger strand. Quindi Argonauta è in grado di individuare l'RNA duplex nel caos primordiale derivato dal processamento di tutti i pre-miRNA, immobilizzarlo e legarlo in maniera funzionale all'appaiamento del miRNA all'mRNA bersaglio, attivando la propria attività endonucleasica in modo da eliminare il passenger strand. Il modo in cui Argonauta scelga quale dei due filamenti conservare non è ancora noto. L'RNA duplex, lungo 20-22 bp, è dunque captato dal complesso RISC. Perché la natura ha selezionato come metodo principale di silenziamento non una molecola a singolo filamento già pronta per legare l'mRNA, ma una molecola a doppio filamento che deve essere processata? Il doppio filamento rende questo RNA meno riconoscibile alle esonucleasi e quindi meno suscettibile di degradazione. L'RNA duplex, captato dalla subunità Argonauta del complesso RISC, viene bloccato, ancorato ad Argonauta, che riconosce le estremità del duplex, sceglie il filamento guida, e degrada il filamento passenger. A questo punto, Argonauta non crea il miRNA maturo e se ne va, perché il miRNA sarebbe bersaglio delle esonucleasi: una volta che Argonauta ha degradato il passenger strand, si lega stabilmente al miRNA maturo e non lo lascia più, accompagnandolo passo passo durante il silenziamento. I miRNA non sono degradati perché sono sempre complessati ad Argonauta. La molecola Argonauta ha una struttura estremamente conservata e presenta due domini critici: - Il primo riconosce l’estremità 3’ - Il secondo, chiamato PIWI domain, si ancora all’estremità 5’ fosfato del miRNA. Questa regione PIWI, una volta che il microRNA è stato teso da Argonauta, è dotata di attività RNasica e svolge la sua attività nei confronti del filamento passenger, degradando questo filamento all’interno di RISC. MECCANISMI DI SILENZIAMENTO SILENZIAMENTO GENICO AD OPERA DEL miRNA MATURO LEGATO AD ARGONAUTE Il complesso miRNA-Argonauta si colloca nella regione 3' UTR del messaggero target, e il miRNA può avere con la sequenza del messaggero: - appaiamento perfetto (nelle piante) - appaiamento non perfetto che dà origine a delle bolle nelle regioni di miRNA non complementari (negli animali) Sbobinatore: Ilaria Baroncini Revisore: Elena Gaggiato 9.2 biologia molecolare 19.11.2024 Questa doppia modalità determina o la degradazione dell'mRNA target (A) o la cosiddetta soppressione (o meglio sospensione) traduzionale (B), termine con il quale si intende una sorta di messa in pausa del processo di traduzione dell'mRNA legato dal miRNA. COMPLEMENTARITÀ PERFETTA Questo è il metodo preferito dalle cellule vegetali ed è anche molto importante nelle cellule animali. Non appena il miRNA, accompagnato sempre da Ago, identifica la zona di appaiamento e si lega alla regione 3’UTR, avvengono 3 passaggi che portano alla degradazione del messaggero stesso: 1) L’mRNA maturo va incontro a de- adenilazione, quindi viene eliminata la coda di Poli-A 2) Viene eliminato il cap (de-capping) 3) La molecola diventa instabile e lo diventa ancor di più dall’azione di una esonucleasi specifica (presente nel citoplasma) che incomincia a distruggerla completamente. La degradazione a livello citoplasmatico avviene in modo particolare, ovvero procedendo in direzione 5’-3’ (a differenza della degradazione canonica degli acidi nucleici che avviene in direzione 3’-5’). Questo è il meccanismo più efficace per degradare la molecola di mRNA mediato dall’appaiamento perfetto del miRNA. COMPLEMENTARITÀ IMPERFETTA Quando si vanno ad analizzare i meccanismi che portano alla repressione traduzionale, si nota che, una volta che i miRNA hanno riconosciuto il proprio target, si può assistere a tre diverse situazioni: - Blocco dell’elongazione (meccanismo dell’ingombro sterico): il miRNA è associato ad Argonauta, quindi ha un ingombro sterico intrinseco. Il miRNA associato ad Argonauta, complesso miRISC (=miRNA con il complesso RISC, con la subunità Ago caricata sul miRNA), interagisce con la regione 3' UTR del messaggero. Quando il messaggero, con questa coda estremamente ingombrante, si trova a dover essere tradotto dai multipli ribosomi, questi si trovano a dover affrontare questo enorme ingombro sterico, causato dal miRNA legato ad Argonauta. A questo punto, la traduzione risulta alterata aberrante. Queste condizioni scaturiscono una risposta cellulare che spinge la cellula a portare via gli mRNA Sbobinatore: Ilaria Baroncini Revisore: Elena Gaggiato 9.2 biologia molecolare 19.11.2024 che non riescono a essere tradotti a causa dell’ ingombro sterico che impedisce l'interazione col ribosoma, servendosi per far ciò di vescicole peculiari presenti nel citoplasma di tutte le cellule, definite corpuscoli P (P- bodies). Questo è il meccanismo più semplice per sospendere la traduzione: l'ingombro sterico è tale per cui i ribosomi, avvicinandosi alla fine della sequenza codificante per tradurla, si trovano davanti questo ingombro, che fa sì che cali l'affinità del ribosoma per l'mRNA, che viene confinato nei P-bodies. - Blocco dell’inizio della traduzione: un altro meccanismo è quello legato alla capacità dei miRNA legati all'estremità 3' UTR del messaggero di andare a reprimere le fasi iniziali della traduzione. Quando l’mRNA viene riconosciuto dal ribosoma e dai fattori di inizio della traduzione, assume una forma ad uncino nell'estremità 3', e, qualora un mRNA sia riconosciuto da un miRNA con Argonauta al 3', assume una conformazione tridimensionale tale da non permettere l'unione delle subunità ribosomali, impedendo l'accesso al CAP ad uno dei fattori di inizio della traduzione. Quindi i ribosomi non riescono fisicamente ad agganciarsi al CAP e la traduzione non inizia. Questa conformazione tridimensionale è riconosciuta come aberrante ed anche in questo caso il complesso è portato nei P-bodies. - Meccanismo di de-adenilazione e degradazione completa (degradazione del peptide nascente): un terzo meccanismo si verifica qualora un mRNA sia riconosciuto nel citoplasma di una cellula legato in posizione terminale da miRNA e RISC, ingombranti a livello sterico. In questo caso l'mRNA stesso è riconosciuto come aberrante, e quindi in maniera spontanea, a livello citosolico, si attiva un meccanismo di protezione (da parte della cellula, che non sa che cosa sia questo messaggero ingombrante) che porta alla de-adenilazione del messaggero, cioè alla degradazione esonucleotidica in direzione 3' -> 5' della coda di poli- Sbobinatore: Ilaria Baroncini Revisore: Elena Gaggiato 9.2 biologia molecolare 19.11.2024 A. Successivamente, l'mRNA de-adenilato attiva un sistema di controllo a livello citoplasmatico che scatena gli enzimi deputati ad eliminare il cap: l'mRNA spoglio viene stavolta completamente degradato, tramite degradazione esonucleotidica peculiare, cioè in direzione 5' -> 3' (come visto a livello dei miRNA). Quindi, nel terzo meccanismo degli animali c’è una somiglianza con il processo osservato nelle piante, soprattutto per quanto riguarda l’esito: la degradazione irreversibile dell’mRNA. In ogni caso il processo di traduzione viene estremamente rallentato fino ad essere completamente bloccato. P-BODIES Gli mRNA che non possono essere tradotti, a cui quindi viene impedito il suo compito di produrre il peptide, vengono concentrati in dei corpuscoli chiamati p-bodies (corpuscoli p). In queste vescicole, gli mRNA riconosciuti con dai miRNA, vengono conservati, accumulati e tenuti lì in attesa di una decisione da parte della cellula. Dai p-bodies, gli mRNA accoppiati al loro miRNA, possono uscire di nuovo, liberarsi del miRNA e riprendere ad essere tradotti oppure, all’interno di questi corpuscoli, i mRNA legati al miRNA con Argonauta possono essere degradati. Quindi di fatto queste vescicole sono una stazione intermedia che rende possibile alla cellula di mettere in pausa la traduzione immediata degli mRNA perché riconosciuti dai miRNA. Sbobinatore: Ilaria Baroncini Revisore: Elena Gaggiato