Mikrobiologie Vorlesung (PDF)

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 11 WACHSTUM VON MIKROORGANISMEN II Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day ▪ Medien ▪ Wachst...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 11 WACHSTUM VON MIKROORGANISMEN II Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day ▪ Medien ▪ Wachstum + Sauerstoff ▪ Wasser 2 Kultivierung von Mikroorganismen Anforderungen an das Kulturmedium ▪ Hefen benötigen eine C- und N-Quelle zum Wachsen: C-Quellen: Glukose/Fructose – Ethanol, Acetat N-Quellen: Ammonium, Aminosäuren ▪ Wichtige andere Elemente C, O, H, N, S, P ▪ Salze: Ca, Mg, K, Na ▪ Spurenelemente / trace elements: Fe, Mn, Zn, Mo, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Si, Se ▪ Vitamine: insbesondere Vitamine der B-Gruppe. ▪ Der pH-Wert muss angepasst sein. ▪ Wasser Das Kulturmedium muss den Bedürfnissen des Mikroorganismus angepasst sein. >>> es gibt eine Vielzahl nicht kultivierbarer Mikroorganismen… 3 Definierte und komplexe Medien: ▪ Definierte Medien Alle Inhaltsstoffe und ihre Konzentrationen sind bekannt ▪ Komplexe Medien Die qualtitative und quantitative Zusammensetzung ist nur zum Teil bekannt. Es gibt mitunter beträchtliche Unterschiede zwischen einzelnen Chargen. >>> Medien, die Hefeextrakt (yeast extract) oder protein Hydroylsate enhalten gehören hierzu. 4 Komplexe Medien: ▪ Microbiologischer Basisinhaltsstoff: Proteinquellen (Peptone). ▪ Peptone und Zellextrakte sind hervorragende natürliche Quellen von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen in Wachstumsmedien. ▪ Peptone werden meist über enzymatische Verdaue oder saure Hydrolyse von Naturprodukten, z.B. tierischen Geweben, Milch, Pflanzen oder Mikrobenkulturen gewonnen. ▪ Most und Stammwürze sind demnach komplexe Medien. 5 Definierte Medien / synthetische Medien: ▪ Synthetisches Minimalmedium Enthält YNB – Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren Manganese sulphate 6 Definierte Medien / synthetische Medien: ▪ Synthetisches Minimalmedium Enthält YNB – Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren ▪ Complete Synthetic Medium - CSM Enthält YNB mit Aminosäuren 7 Die Angaben bedeuten, z.B. für Adenin: 10µg/ml = 10 mg/L ! Vitamine nicht vergessen: Vitamin B3 S. cerevisiae Benötigt kein B12. 8 Definierte Medien / synthetische Medien: Drop out Medien Neben CSM, also einer Complete Synthetic Mixture, gibt es sog. ‚drop out‘-Medien, bei denen bestimmte Komponenten 9 Weggelassen wurden: z.B. CSM-Leucin enthält KEIN Leucin. Die Herstellung von Kulturmedien: WICHTIG: Der pH-Wert ist zu kontrollieren und ggf anzupassen. Daumenregel: Für die Anzucht von Bakterien: pH > 7,0 Für die Anzucht von Hefen + Pilzen : pH < 7,0 Wegen des sterilen Arbeitens empfiehlt es sich, den pH-Wert vor der Sterilisation anzupassen. Es kann u.U. erforderlich sein, einzelne Komponenten eines Mediums getrennt zu autoklavieren. 10  Die Herstellung von Kulturmedien: Maillard-Reaktion ▪ Eine Bräunungsreaktion durch Reaktion von Aminosäuren mit Zuckern, bei der neue aromatische Verbindungen entstehen. ▪ Nach dem französischen Physiker und Chemiker Louis Camille Maillard (1878-1936). ▪ Die Reaktion erfolgt in praktisch allen Nahrungsmitteln, die erhitzt werden, aber ebenso auch bei der Lagerung. 04.02.1878 12.05.1936 ▪ Dabei können positiv empfundene Aromen wie geröstet (Brotkruste, Kaffee), karamellig und malzig, aber auch negative Eindrücke wie bitter, verbrannt oder ranzig entstehen. ▪ Das Phänomen tritt unter anderem auf beim Frittieren von Pommes Frites, Rösten von Kaffee, Toasten von Brot und Braten eines Steaks. ▪ Auch bei Weinen gibt es diese Reaktion. Das ist die Bildung der Bernsteinfarbe bei alten Trockenbeerenauslesen, sowie die feine Aromenbildung bei Schaumweinen durch die Reaktion des in der Dosage enthaltenen Zuckers mit den bei der Autolyse der Hefen freigesetzten Aminosäuren. ▪ Pommes: Glucose + Asparagin >>> Acrylamid 11 Glucose, Fructose, Laktose, Sucrose 12  13 https://www.youtube.com/watch?v=t7T8rzBp89U https://www.youtube.com/watch?v=xAk70uukeT8 Alles über Asparagin: Was ist das? Wo kommt das vor? Ist das ein Problem im Getränkebereich? Wie könnte damit umgegangen werden? Kann man was machen gegen Acrylamid im Nahrungsmittelsektor? 14 Proteine ▪ Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut, es sind Aminosäurepolymere. ▪ Aminosäuren (aa) sind ein Klasse von Molekülen mit einer Carboxy- und einer Aminogruppe. ▪ Es gibt 20 Standardaminosäuren und 3 zusätzliche AA in Proteinen. ▪ Check this out: https://www.youtube.com/watch?v=m130s94pMjE https://www.youtube.com/watch?v=qBRFIMcxZNM ▪ Grundstruktur: 15 Peptidbindung in Proteinen Kondensationsreaktion 16 https://en.wikibooks.org/wiki/An_Introduction_to_Molecular_Biology/Function_and_structure_of_Proteins  Aminosäuregruppen 17 https://courses.lumenlearning.com/wm-biology1/chapter/reading-amino-acids/ Aminosäuregruppen 18  Unterschied Asparagin zu Arginin Ladungsverhalten: Asparagin: Die Amidgruppe in der Seitenkette ist neutral und wird nicht protoniert oder deprotoniert im physiologischen pH-Bereich. Arginin: Die Guanidingruppe in der Seitenkette hat einen sehr hohen pKa-Wert (12.48), was bedeutet, dass sie bei physiologischem pH (ca. 7.4) fast immer protoniert und damit positiv geladen ist. Chemisches Gleichgewicht: Der pKa-Wert beschreibt das Gleichgewicht einer Säure-Base-Reaktion. Bei der Dissoziation einer Säure HA: HA + H2O ↔ H3O+ + A- Beziehung zum pH-Wert: Wenn pH = pKa, dann [HA] = [A-] Dies wird durch die Henderson-Hasselbalch-Gleichung beschrieben. 19  Digression Essentielle Aminosäuren für den Menschen Für Hunde und Katzen ist 20 Arginin ebenfalls essentiell  Aminosäuren sind Moleküle, die eine Säuregruppe und eine Aminogruppe am C1-Atom tragen. Es gibt 20 Standard Aminosäuren (+3 weitere) ALLE diese Aminosäuren sind L-Aminosäuren. 21 Aminosäuremangel ▪ A number of psychobiological syndromes characterized by poor impulse control have been associated with low concentrations of the major serotonin (5-HT) metabolite 5- hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) in cerebrospinal fluid (CSF). ▪ Serotonin dysfunction has been correlated with impulsive and violent criminal behaviors ▪ Direct experimental manipulation of 5-HT levels and the measurement of resultant behavior have provided stronger evidence for the connection between central nervous system (CNS) 5- HT and impulsive/aggressive behaviors. ▪ Serotonin synthesis depends on the availability of the essential amino acid tryptophan (Trp). 22 Tryptophan diet reduces aggressive behavior in male mice http://dx.doi.org/10.3922/j.psns.2013.3.18 doi: 10.1098/rstb.2011.0375; PMID: 23440461 The effect of raising and lowering tryptophan levels on human mood and social behaviour Simon N. Young Studies using tryptophan supplementation demonstrate that increased serotonin can decrease quarrelsomeness and increase agreeableness in everyday life. 23 DOI: 10.14800/nt.314 Nahrungsmittel mit hohem Trp Gehalt sind: Nüsse, Tofu, Käse, rotes Fleisch, Huhn, Fish, Hafer, Bohnen, Eier. Der recommended daily intake (RDI) für Tryptophan ist 4 mg per Kilogramm Körpergewicht. Eine 70kg schwere Person sollte täglich etwa 280 mg Tryptophan aufnehmen. Tryptophan Gehalt von Nüssen 24  Life hack Nüsse machen locker !!! 25 https://www.swr.de/swr4/tipps/walnuesse-ernten-und-trocknen-ohne-schimmel-104.html https://www.isshappy.de/weshalb-nuesse-gesund-sind/  Wie wird man wie man ist? Mikrobiologie https://www.greekmythology.com/Myths/The_Myths/Birth_of_Athena/birth_of_athena.html 26 Von Aminosäuren zu Proteinen ▪ Die Translation an Ribosomen verbindet Aminosäuren zu Proteinen anhand der Information der mRNA ▪ Polypeptidketten und Proteine haben eine Richtung: N-terminus am Anfang des Proteins - C-terminus am Ende der Kette Mikrobiologie 27 Proteine haben verschiedene Strukturen ▪ Proteine können verschiedene Konformationen annehmen. ▪ Diese werden Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur genannt. ▪ Linderstrøm-Lang ist berühmt für die Einteilung von Proteinen in diese 4 Strukturen. ▪ Diese Einteilung stellte er bei seinen Lane Medical Lectures at Stanford University im October 1951 vor. 29.11.1896 25.05.1959 Mikrobiologie 28 Primärstruktur ▪ Die Primärstruktur eines Proteins ist die einfache Abfolge der Aminosäuren Mikrobiologie 29  Sekundärstruktur ▪ Die Sekundärstruktur eines Proteins zeigt die Faltung eines Proteins in bestimmten Regionen an. ▪ Die häufigsten Strukturen sind α-Helix und β-sheet (β-Faltblatt). ▪ Die α-Helix wird durch Wasserstoffbrücken in ihrer Form stabilisiert. Diese Brücken werden gebildet durch Wechselwirkungen zwischen dem Sauerstoff-Atom in der Carbonylgruppe einer Aminosäure und einer anderen Aminosäure die vier Reste weiter weg ist. ▪ Eine Windung in einer alpha helix besteht aus 3.6 Aminosäureresten. Die Seitengruppen (die unterschiedlichen Reste) der Polypeptide weisen aus der α-Helix nach aussen. Source: wikibooks Mikrobiologie 30 Sekundärstruktur ▪ In den β-Faltblättern werden die Falten ebenfalls durch Wasserstoffbrücken zwischen den Carboxy- und Aminogrupppen des Grundgerüstes der Aminosäuren gebildet. Die Aminosäurereste weisen über und unterhalb der Falten nach aussen. Mikrobiologie https://www.khanacademy.org/science/biology/macromolecules/proteins-and-amino-acids/a/orders-of-protein-structure 31 Sekundärstruktur ▪ In den β-sheets, kann die Ausrichtung der benachbarten Aminosäureketten entweder in der Gleichen Richtung (parallel) oder in der entgegengesetzen Richtung sein (antiparallel). Mikrobiologie https://www.pnas.org/content/98/21/11955 32  Tertiärstruktur ▪ The spezifische 3D-Struktur einer Polypeptidkette ist ihre Tertiärstruktur. Diese Struktur wird durch eine Reihe von Interaktionen stabilisiert. Dazu gehören hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen und Kovalente Bindungen über Disulfidbrücken. https://www.khanacademy.org/science/biology/macromolecules/proteins-and-amino-acids/a/orders-of-protein-structure Mikrobiologie 33  Quartärstuktur ▪ Viele Proteine liegen in Komplexen vor, d.h. sie bestehen aus mehreren Einzelproteinen, die man oft als Proteinuntereinheiten bezeichnet. Diese Untereinheiten können gleich sein, z.B. in einem Homodimer, oder verschieden, z.B. in einem Heterodimer. Die Quartärerstruktur beschreibt die Interaktion der Proteinuntereinheiten und die Aggregation zu einer Einheit. Haemoglobin ist ein Tetramer. Es besteht aus 2 alpha und 2 beta Untereinheiten. Mikrobiologie 34  The Grand Challenge: Structure prediction Mikrobiologie https://de.wikipedia.org/wiki/AlphaFold 35  The Grand Challenge: The Grand Reward Nobel Prizes for 3D Molecular Structure 1914: Max von Laue (Physics) "for his discovery of the diffraction of X-rays by crystals". 1915: Sir William Henry Bragg and William Lawrence Bragg (Physics) "for their services in the analysis of crystal structure by means of X-rays". Lawrence's Bragg Equation quantitatively explained the spots diffracted from a crystal, based on his understanding of crystal "lattice structure as being constructed from a series of sheets of atoms, laid one on top of another, with each sheet behaving like a mirror". Subsequently they solved the structures of crystals of NaCl, and of diamond, among others. 1962: For being the first to successfully identify the structures of complex proteins, Max Perutz and John Kendrew were rewarded with the Nobel Prize for Chemistry: Myoglobin + Haemoglobin 1964: Dorothy Crowfoot Hodgkin (Chemistry) "for her determinations by X-ray techniques of the structures of important biochemical substances", including the structures of penicillin in 1949, and vitamin B-12 in 1957. https://proteopedia.org/wiki/index.php/Nobel_Prizes_for_3D_Molecular_Structure Mikrobiologie 36  The Grand Challenge: Alpha Fold ▪ Alpha Fold wurde von Deepmind entwickelt und erreichte beim Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction (CASP) Wettbewerb 2018 und 2020 Bestwerte. ▪ In der medizinischen Fachwelt wurde dies als Durchbruch der Proteinstrukturvorhersage aufgenommen. ▪ Seit dem 15. Juli 2021 unterliegt die Software einer Open-Source-Lizenz – auch für kommerzielle Unternehmen. ▪ Jeder kann jetzt Proteine falten oder in Datenbanken - der AlphaFold Protein Structure Database - mit automatisch generierten Modellen nachschauen. Mikrobiologie 37  The Grand Challenge: Alpha Fold Mikrobiologie 38 The Grand Challenge: Alpha Fold ▪ Proteins are essential to life, and understanding their structure can facilitate a mechanistic understanding of their function. ▪ Through an enormous experimental effort1–4, the structures of around 100,000 unique proteins have been determined5, but ▪ this represents a small fraction of the billions of known protein sequences6,7. ▪ Predicting the three-dimensional structure that a protein will adopt based solely on its amino acid sequence—the structure prediction component of the ‘protein folding problem’8—has been an important open research problem for more than 50 years9. ▪ Here we provide the first computational method that can regularly predict protein structures with atomic accuracy even in cases in which no similar structure is known. ▪ AlphaFold demonstrating accuracy competitive with experimental structures in a majority of cases and greatly outperforming other methods. Mikrobiologie 39  1962 1976 1985 Mikrobiologie 40 The Grand Challenge: N-Gehalt im Most Bei der Untersuchung von Proteinen während der Malzherstellung entwickelte er eine Methode zur Bestimmung des Stickstoffgehalts, die schneller und genauer war als alle damals verfügbaren Methoden: Total Kjehldahl Nitrogen: TKN - 1883 Carlsberg Laboratorium Mikrobiologie 41 The Grand Challenge: N-Gehalt im Most ▪ Der Gesamtstickstoff (Gesamt-N) gibt den Stickstoffgehalt aller im Traubenmost enthaltenen stickstoffhaltigen Verbindungen an wie Proteine, Peptide, Aminosäuren und Ammoniumsalze. ▪ Er beträgt in Traubenmosten zwischen 0,3 und 1,7 g/L. ▪ Neuere Untersuchungen fanden bei ihren Untersuchungen Werte zwischen 319-760 mg/L. ▪ Der Gesamt-Stickstoff wird nach Kjeldahl bestimmt. Mikrobiologie 42  YAN – Yeast Assimilable Nitrogen ▪ YAN wird durch die Messung von Ammonium (NH3) und des Alpha- Amino Nitrogen (αAN; auch free-amino nitrogen oder FAN) bestimmt. ▪ Ammonium-Analyse: enzymatisch (Megazymes Ammonia assay procedure ) ▪ FAN-Analyse: NOPA - Nitrogen by o-phthalaldehyde, misst den primären Amino-Stickstoff (Photometrisch bei 340 nm) – Prolin wird nicht gemessen ▪ Hefeverwertbarem Stickstoff = die Summe von Ammonium und Aminosäuren ohne Prolin. ▪ Nicht verwertet werden können Oligo-Peptide, biogene Amine und Proteine. PRINZIP: Die Aminostickstoff-Gruppen freier Aminosäuren in der Probe reagieren mit N-Acetyl-L-Cystein und O-Phthaldialdehyd, wobei Isoindol-Derivate entstehen Aminostickstoff + N-Acetyl-L-Cystein + O-Phthaldialdehyd > Isoindol-Derivat Bei dieser Reaktion entsteht ein Gehalt an Isoindol-Derivat, der mit dem Gehalt an freiem Aminostickstoff stöchiometrisch ist. Gemessen wird das Isoindol-Derivat mit Hilfe der Absorbtionszunahme bei 340 nm. WINE INDUSTRY JOURNAL > VOL 22 NO 6 > NOVEMBER/DECEMBER 2007 > www.winebiz.com.au Spezielle Önologie GM35 43 Wachstum von Mikroorganismen 44  Die pH-Skala Das Konzept des pH-Wertes wurde eingeführt vom dänischen Chemiker Søren Peder Lauritz Sørensen aus dem Carlsberg Laboratory im Jahr 1909. In den ersten Veröffentlichungen wurde das H noch dem p unterstellt: pH. Die exakte Bedeutung des Buchstaben p in pH war umstritten. Nach der Carlsberg Foundation steht pH für "power of hydrogen“ = pondus hydrogenii. Es wurde auch vermutet, dass Sørensen die Buchstaben p und q (Standardvariablen) einfach benutzte, um eine Testlösung (p) von einer Standardlösung (q) zu unterscheiden. p steht nun für den "dezimal Log von", wird ebenso in pKa, der Säuredissoziationskonstanten, verwendet. January 9, 1868 February 12, 1939. Mikrobiologie 45  pH-pH-pH-pH-pH-pH-pH-pH-pH-pH-pH Die pH-Skala ist eine logarithmische Skala mit der man die Acidität oder Alkalität einer wässrigen Lösung beschreibt. Sie wird dargestellt als der negative dezimale Logarithmus von der Aktivität der Hydrogen-Ionen. Bei 25 °C sind Lösungen mit einem pH-Wert 7 basisch. pH-Skala: A Lösung mit dem pH 4 ist 10x saurer als eine Lösung mit pH5 und 100x saurer als eine Lösung mit pH 6 https://en.wikipedia.org/wiki/PH Mikrobiologie 46 Mikrobiologie 47  Jacob Christian Jacobsen 02.09.1811 København 30.04.1887 Rom Carlsberg wurde von J. C. Jacobsen gegründet. Der erste Brauansatz wurde am 10. November 1847 durchgeführt. 1876 The Carlsberg Foundation is established. Mikrobiologie 48  Die pH-Skala Professor S.P.L. Sørensen 1900-1939 Developed the pH concept in 1909 Mikrobiologie 49  Die pH-Skala Sørensen’s work on the concentration of hydrogen ions led to: ▪ genau definierte Standardlösungen, die beim Mischen Pufferlösungen mit einem festen pH-Wert bilden ▪ colorimetrische Methoden, um den pH-Wert zu bestimmen ▪ pH-Kurven für die Messung der Aktivität von Enzymen. Dies machte die Biochemie zu einer exakten Wissenschaft. ▪ Er reinigte Ei-Albumin und kristallisierte es durch Ammoniumsulphate-Fällung. Mikrobiologie 50  pH Skala um Enzymaktivitäten zu beschreiben Die Aktivität einer Amylase ändert sich in Abhängigkeit vom pH-Wert. Eine höhere Enzymaktivität resultiert in einer schnelleren Reaktionsrate. Andere Verdauungsenzyme haben eine ähnliche Kurve, aber mit einer maximalen Aktivität verschoben entweder in den sauren oder basischen Bereich. https://brainly.com/question/3764312 Mikrobiologie 51  Nutzen der pH-Skala nicht nur für Enzyme Anhand ihrer optimalen Wachstumsraten kann man Mikroorganismen einteilen in: Acidophile, Neutrophile und Alkaliphile. Die meisten Neutrophilen findet man im Boden und im Wasser. Neutrophile sind gut ausgerüstet, um im menschlichen Körper zu überleben. Hier ist der pH 7.2 ±0.2. Daher sind die meisten humanpathogenen Bakterien auch Neutrophile. Die meisten Bakterien sterben ab, wenn ihr intrazellulärer pH unter 5.0 fällt E. coli: pH 5.5 - 8 https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/the-effects-of-ph-on-microbial-growth/ Mikrobiologie 52 Wachstum von Microorganismen bei unterschiedlichem pH Fungi, yeasts Bacteria 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Sacharomyces cerevisiae Lactobacillus spp Acetobacter acidophilus Alicyclobacillus acidoterrestris Staphylococcus aureus Salmonella spp E. coli Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Listeria monocytogenes Acidophil – neutrophil - alkaliphil Mikrobiologie 53  Zurück zum Asparagin ▪ Glutamine, Asparagine, und Ammonium sind gute N-Quellen für S. cerevisiae und führen zu optimalem Wachstum. ▪ Addition von NH4+ zu Hefezellen, die mit schlechteren N-Quellen wachsen, startet nitrogen catabolite inactivation und nitrogen catabolite repression von verschiedenen Enzymen und Permeasen, die für die Verwendung dieser N-Quellen benötigt werden. ▪ Synthese der generellen Aminosäure-Permease Gap1 ist stark reduziert nach Zugabe von NH4+, und vorhandenes Gap1 Protein wird inaktiviert und durch das Proteasome abgebaut. https://www.chegg.com/homework-help/questions-and-answers/makes-aspartic-glutamic-acid-acids-comparison-glutamine-asparagine-know-side-chains-differ-q32222213 Mikrobiologie 54  Saccharomyces cerevisiae: NH4+ uptake ▪ NH4+ uptake passiert über erleichterte Diffusion. ▪ Die Aufnahme von Aminosäuren geschieht über Proton-Symport, kostet also ATP für die Etablierung des PRotonengradienten. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.01547-16 Mikrobiologie 55  Saccharomyces cerevisiae: Nitrogen uptake Problem: Aminosäuren liefern ein H+ und über den Symport kommt ein weiteres H+ in die Zelle Mikrobiologie 56  N-Quellen im Most Eine Gassenbegrünung senkt den Gehalt an Aminosäuren im Traubenmost; ebenso wie frühe Lese oder anhaltende Trockenheit. Warme Reifemonate liefern bei ausreichender Bodenfeuchtigkeit die höchsten Aminosäuregehalte. Mikrobiologie 57  Haupt-Aminosäuren im Traubenmost: Arginine Glutamine Proline Mikrobiologie 58 Apfelmost Spezielle Önologie GM35 59 Apfelmost Haupt-Aminosäuren im Apfelmost: Asparagin Spezielle Önologie GM35 60  Cider Yeast Research J. Mol. Sci. 2023, 24, 11232. https://doi.org/10.3390/ijms241311232 Mikrobiologie 61 E1-introgresssions Mikrobiologie 62 E1-introgresssions Two introgressions originated from S. eubayanus. A smaller fragment of 8.7 kb located on E1 CHRII harbors seven genes: SeSWA2 (chimeric-fusion site), SeDAD4, SeASP1, SeMRPL35, SeTIM11, SePEP7 and SeUTP4 (chimeric-fusion site). Of these genes, ASP1 (YDR321W) is of special interest. It encodes an L-asparaginase that catalyzes the hydrolysis of asparagine to aspartic acid releasing ammonia. This could be of adaptive value in cider yeasts as asparagine is an abundant amino acid in apple must. Mikrobiologie 63 E1-introgresssions Asparaginase gegen Acrylamid? Mikrobiologie 64  Glucose, Fructose, Laktose, Sucrose Mit dem Verlust der Aminogruppe im Asparagin fehlt der Asparaginsäure der Akzeptor für den Zucker und so entfällt die Bildung von Acrylamid. Mikrobiologie 65 Applied Research Die Acrylamidbildung tritt beim Braten, Backen, Frittieren, Grillen usw. insbesondere bei Lebensmittel mit höheren Gehalten an der Aminosäure Asparagin und an reduzierenden Zuckern wie z.B. Glucose oder Fructose. Die Formation von Acrylamid erfolgt in der Maillard Reaktion bei Temperaturen über 120 °C. Die Menge an gebildeten Acrylamid im Lebensmittel ist anhängige von der Temperatur und der Einwirkdauer der Temperatur sowie der Rezeptur und den Inhaltsstoffen. Mikrobiologie 66 Applied Research Minimierung der Bildung von Acrylamid Auf Grund der Verarbeitung / Zubereitung sind insbesondere Richtwerte: Kartoffelerzeugnisse wie Pommes frites, Snacks, Cracker und Chips usw., Chips: 750 µg/kg Getreideprodukte wie Brot, Backwaren und Frühstückscerealien usw., Lebkuchen: 800 µg/kg Kaffee – Kaffeeprodukte, Instantkaffee: 850 µg/kg Kakao – Kakaoprodukte von der Problematik der Acrylamidbildung betroffen. Ein Weg zur Senkung des Acrylamidgehaltes ist die Vorbehandlung der Rohstoffe / Erzeugnisse mit dem Lebensmittelenzym Asparaginase. Die Asparaginase hydrolysiert das Asparagin in Asparaginsäure. Mit dem Verlust der Aminogruppe im Asparagin fehlt der Akzeptor für die Bildung von Acrylamid. Je nach Produkt und Verfahren werden Reduktionen bis zu 70% erreicht. Mikrobiologie 67 Mikrobiologie 68  Ziel des Forschungsvorhabens ist es deshalb, durch systematischen Einsatz von Asparaginasen (in Getreide- produkten) und/oder antioxidativ wirksamen Substanzen (in Getreide- und Kartoffelprodukten) unter Beibehaltung der positiven sensorischen und texturellen Eigenschaften eine Acrylamid- Reduktion zu erreichen. Mikrobiologie 69  Festmedien - Petrischalen Mikrobiologie 70  Festmedien - Petrischalen Julius Richard Petri (May 31, 1852 – December 20, 1921) war ein deutscher Mikrobiologe der die Petrischale erfunden hat in der Zeit, als er Assistent bei Robert Koch war. Petri Centralblatt für Bacteriologie und Parasitenkunde. Bd. 1, 1887, S. 279–280 Source: wikipedia Mikrobiologie 71  Festmedien - Petrischalen ▪ Ende des 19. Jahrhunderts wurde Agar zur Bereitung von Festmedien für die Kultivierung von Bakterien verwendet. ▪ Der Gebrauch Agar für mikrobiologische Zwecke wurde zum erstenmal 1882 beschrieben durch den deutschen Mikrobiologen Walther Hesse (27.12.1846-19.07.1911), ein Assistent im Labor von Robert Koch. ▪ Hesse hatte den Vorschlag von seiner Frau Fannie (Angelina) Hesse bekommen. ▪ Agar ersetzte schnell Gelatine als Festiger aufgrund seiner höheren Schmelztemperatur, so dass man Mikroben nun auch bei höherer Temperatur kultivieren konnte, ohne dass sich das Medium verflüssigte. Agar Vorteile: ▪ Hoher Schmelzpunkt ▪ wird von Mikroorganismen i.d.R. nicht verzehrt ▪ liefert einen Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche June 22, 1850 December 1, 1934 Mikrobiologie 72  Sterilisierung ▪ Das extremste Protokoll für die vollständige Kontrolle mikrobiellen Wachstums ist die Sterilisation. ▪ Das Ziel: die vollständige Abtötung aller Keime - vegetative Zellen, und Sporen. ▪ In manchen Fällen inkl antiviraler Maßnahmen. Sterilfiltration: with 0.2 µm filters Autoklavierung: heat & pressure Verwendung von Chemikalien: z.B. Sterillium https://www.labgearaustralia.com.au/shop/product/tuttnauer-2540mk-manual-table-top-autoclave-23-l-3774 https://www.neolab.de/en/laborbedarf/mischen-trennen-zerkleinern/filtration/spritzenvorsatzfilter/neolab-spritzenfilter-m-ptfe-mebran-0-2-m-25-mm-o-50-stck-pack-3-1901 Mikrobiologie 73 https://www.amazon.com/Medline-MSC097072-Sterillium-Liquid-Sanitizer/dp/B00OMFOXUC  Life hack ▪ Chlorhexidine, bzw, Chlorhexidine gluconate (CHG), ist ein Desinfizierungsmittel und Antiseptikum, das z.B. vor Operationen zur Hautdesinfektion eingesetzt wird und um chirurgische Geräte https://en.wikipedia.org/wiki/Chlorhexidine zu sterilisieren. ▪ Es kann zur Desinfektion sowohl des Patienten als auch des Arztes verwendet werden. ▪ Es wird auch verwendet, um Wunden zu säubern, um Zahnplaquebildung zu verhindern und um Infektionen im Mundraum zu behandeln. ▪ Chlorhexidine wurde im Medizinbereich in den 1950er Jahren eingesetzt. ▪ Es steht of der World Health Organization Liste der Essential Medicines, der sichersten und effektivsten Arzneien im Gesundheitssystem. Mikrobiologie 74  Kultivierung von Mikroorganismen Wichtige Parameter: ▪ Hinreichende Menge von Nährstoffen (Minimalmedium, Vollmedium, Synthetisches Medium, Komplexmedium) ▪ Optimaler pH-Bereich ▪ Optimale Wachstumstemperatur ▪ Aerobe oder anaerobe Kultivierung Mikrobiologie 75  Kultivierung von Mikroorganismen: Temperatur Note: Lager yeast vs Saccharomyces cerevisiae https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/temperature-and-microbial-growth/ Mikrobiologie 76  Kultivierung von Mikroorganismen: Temperatur https://slideplayer.com/slide/8037663/ Mikrobiologie 77  Kultivierung von Mikroorganismen: Sauerstoff ▪ Obligate Anaerobier: Clostridia, Bacteroides ▪ Facultative Anaerobier: Lactobacillus- Species ▪ Facultative Anaerobier: Yeasts ▪ Aerobier: Bacillus-Species Mikrobiologie 78  Kultivierung von Mikroorganismen: Sauerstoff Chloracidobacterium thermophilum https://slideplayer.com/slide/4627987/ Mikrobiologie 79  Microbe of the day Clostridien Klasse von überwiegend grampositiven Bakterien anaerob bis aerotolerant endosporenbildend Clostridium botulinum Die Isolierung aus Wurst (lat. botulus) und der erstmals nachgewiesene Zusammenhang mit dem bereits bekannten Krankheitsbild Botulismus war namensgebend https://de.wikipedia.org/wiki/Clostridia Mikrobiologie 80  Botulismus Clostridium botulinum: produziert Botulinumtoxin. ▪ Nach Endozytose des Toxins in die Nervenendigung kommt es zur Spaltung von ▪ SNAP-25 (synaptosome-associated protein of 25kDa) durch Botulinumtoxin A und E ▪ Synaptobrevin durch die Botulinumtoxine B, D, F und G oder ▪ Syntaxinen durch Botulinumtoxin C. ▪ Jeder dieser Prozesse hat zur Folge, dass synaptische Vesikel, die Acetylcholin enthalten, nicht mehr mit der Membran verschmelzen können und der Neurotransmitter den synaptischen Spalt nicht erreicht. ▪ Die neuro-muskuläre Übertragung wird somit unterbrochen. ▪ Letaldosis: oral 1 µg/kg ▪ Im Juni 2024 kam es zu einem Ausbruch von Botulismus in Russland mit 139 Fällen. ▪ Niedrig dosiert kann Botulinumtoxin in der Ästhetischen Medizin angewendet werden, um die mimische Muskulatur zu hemmen. ▪ Typische Dosierungen für kosmetische Anwendungen: ▪ Augenbrauen: 15 Units ≈ 0,0006 µg; Krähenfüße: 20 Units ≈ 0,0008 µg; Stirn: 20 Units ≈ 0,0008 µg ▪ Zornesfalten: 25 Units ≈ 0,001 µg; Gesamtmenge pro Behandlung: 5-100 Units ≈ 0,0002 - 0,004 µg reines Botulinumtoxin A Mikrobiologie 81  Kultivierung von Mikroorganismen: Sauerstoff Sauerstoffeintrag in Flüssigmedien ▪ durch Schütteln ▪ durch Rühren ▪ Zufuhr von steriler Luft (durch Baumwollfasern oder Filter) ▪ Standkulturen, so dass die Mikroben auf der Oberfäche wachsen können Allgemeine Mikrobiologie, Hrsg Georg Fuchs; 8. Auflage, S. 164 Mikrobiologie 82  Kultivierung von Mikroorganismen: Sauerstoff Mikrobiologie 83  Kultivierung von Mikroorganismen: Sauerstoff Mikrobiologie 84  Hefen und Sauerstoff ▪ Hefen benötigen Sauerstoff für die aerobe Zellatmung (Respiration) oder können unter anaeroben Bedingungen Fermentationen durchführen (alkoholische Gärung). ▪ Anders als Bakterien gibt es keine Hefeart, die obligat anaerob ist, d.h. nur unter Abschluss von Sauerstoff wächst. ▪ Die meisten Hefen wachsen am besten in leicht sauerem Milieu. Mikrobiologie 85  Hefen und Sauerstoff ▪ Wofür benötigen Hefen Sauerstoff ? ▪ z.B. für die Verwertung der Aminosäure Prolin Mikrobiologie 86  Hefen und Sauerstoff ▪ Wofür benötigen Hefen Sauerstoff ? ▪ Für die Synthese von Zellmembranen. Sterole und einige ungesättigte Fettsäuren können nur mit Sauerstoff hergestellt werden. ▪ Zur Synthese EINES Moleküls Cholesterol oder Ergosterol werden 11 bzw. 12 Moleküle Sauerstoff benötigt. ▪ Dies könnte eine Adaptation der Eukaryoten an sich verändernde Bedingungen auf der Erde gewesen sein. ▪ Zu einer Zeit als die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre zunahmen, könnten die Zellen die Sterolbiosynthese erfunden haben. Dadurch konnten sie Sauerstoff aus dem Cytoplasma entfernen. Mikrobiologie 87  Hefen und Sauerstoff Mikrobiologie 88  Wie schaffen es einige Bakterien, anaerob zu leben? ▪ Sterole sind eine Erfindung der Eukaryoten. ▪ Bakterien haben ähnliche Moleküle, die ähnliche Funktionen erfüllen. ▪ Diese Moleküle sind Hopanoide. ▪ Hopanoid-Synthese benötigt KEINEN molekularen Sauerstoff ▪ Hopanoide wurden in Sedimenten gefunden, die aus einer Zeit vor der Anreicherung der Atmosphäre mit Sauerstoff datieren Mikrobiologie 89  Die Arbeit mit Mikroorganismen Isolat Anreicherungskulturen Reinkultur Stammoptimierung Pied de cuve Einige Tage vor der eigentlichen Lese ernten wir bereits einige Trauben und verarbeiten sie direkt im Weinberg zu einer Art Industrieanwendung Stammhaltung Hefeansatz „der Fuss des Fasses“. Dieser bleibt dann einem kleinen Fass direkt im Weinberg und beginnt spontan, nur mit den vor Ort vorhandenen Hefen, zu gären. Dieser Hefeansatz wird dann zur eigentlichen Lese der Maische zugesetzt und impft sozusagen den neuen Wein mit den ganz ursprünglichen Hefen des jeweiligen Weinbergs. Reines Terroir – Pur! Mikrobiologie 90 Mikrobiologie 91  ▪ While most producers in recent decades have relied on commercial yeasts (ADY) as their primary choice given their reliability and reproducibility, ▪ the fear of standardising the taste and properties of wine has led to the employment of alternative strategies that involve autochthonous yeasts such as pied de cuve (PdC) and spontaneous fermentation (SF). ▪ However, the impact of different fermentation strategies on wine has been a subject of debate and speculation. ▪ Consequently, this study describes, for the first time, the differences between the three kinds of fermentation at the metabolomic, chemical, and sensory levels in two wines: Chardonnay and Pinot Noir. ▪ The results showed how the yeast chosen significantly impacted the molecular composition of the wines ▪ The sensorial analysis of Chardonnay wine showed a more qualitative sensory outcome (Higher fruit intensity) for ADY and SF compared to PdC. ▪ Our finding challenges the common speculation among wine producers that autochthonous yeast fermentations may offer greater complexity and uniqueness in comparison to commercial yeast fermentations. Mikrobiologie 92  Glue, solvent, nail polish = Ethyl Acetat D) Barplot comparison of sensory evaluation attributes for the different wines. Bar chart labelled with different superscript are significantly different (P < 0.5). Mikrobiologie 93  Isolierung von Reinkulturen durch Selektionsmedien Eigenschaften von Selektionsmedien: ▪ Durch die Wahl geeigneter Komponenten bietet das Selektionsmedium nur Mikroorgansimen mit spezifischen Metabolismuseigenschaften gute Wachstumsbedingungen. ▪ Je härter der Selektionsdruck, desto weniger Mikroorganismen sind in der Lage, zu wachsen. Mikrobiologie 94  Selektions-Komponenten können sein: ▪ O2 ▪ Temperatur ▪ pH-Wert ▪ C-Quelle/C-Konzentration ▪ N-Quelle ▪ S-Quelle ▪ Salz- Konzentration ▪ Licht ▪ Bedarf an Supplementen ▪ Antibiotika ▪ Toxine ▪ … Mikrobiologie 95  Das menschliche Darm-Mikrobiom: ▪ Die mikrobielle Zusammensetzung der Darmflora variiert entlang des Verdauungstraktes. ▪ Im Magen und im Dünndarm sind relativ wenig Bakterien zu finden. ▪ Der Dickdarm dagegen enthält ein dicht-besiedeltes Ökosystem mit bis zu 1012 Zellen/g Inhalt. ▪ Die dort vorkommenden Bakterien gehören zu 300-1000 verschiedenen Arten. ABER: 99% der Bakterienmasse kommt von nur 30 - 40 Arten. ▪ Als Folge dieser Abundanz machen Bakterien auch etwa 60% der Trockenmasse der Exkremente aus. ▪ Mehr als 99% der Darmbakterien sind Anaerobier ▪ Die Zahl der Anaerobier der Gattung Bacteroides ist 1000x größer als die von E. coli. Mikrobiologie 96  Flüssigmedien - Festmedien Mikrobiologie 97  Stammhaltung und Stammaufbewahrung 1. Subkultivierung Subkultivierung wird von allen professionellen Stammkultur-Zentren angewandt. Die Mutterkulturen werden vermehrt und parallele Linien einer Starterkultur erzeugt. Es ist von Bedeutung möglichst wenige Passage zuzulassen, um: ▪ Die Möglichkeit einer Kontamination zu verringern ▪ Genetische Drift/Mutationen zu verhindern ▪ Phenotypische Varianz zu minimieren, insbesondere der Verlust von Produktionseigenschaften Mikrobiologie 98  Stammhaltung und Stammaufbewahrung 2. Tieffrieren Aufbewahrung in Tiefkühltruhen hat sich für Myzelium von Schimmelpilzen bewährt. Kühltemperaturen von -75 ºC to -80 ºC werden benötigt. Als Cryoprotektionsmittel wird den Kulturen oft Glycerol zugesetzt (15-20%) Mikrobiologie 99  Stammhaltung und Stammaufbewahrung 3. Gefriertrocknung ▪ Die meisten Kulturen in der ATCC sind lyophilisiert. ▪ Lyophilisierung ist ein Prozess mit drei Schritten: 1. Das Material wird gefroren 2. Erste Trocknung: hiermit wird das meiste Wasser entfernt. Es wird gerade so viel Wärme und Unterdruck angewandt, die gefrorene Flüssigkeit zu verdampfen, aber nicht zu schmelzen. 3. Zweite Trocknung: Entfernen der restlichen Feuchtigkeit durch Applizieren von Hitze bei geringem Druck. 4. Die Proben werden bei 2-8 ºC aufbewahrt. Tiefere Temperaturen (-20 ºC oder darunter) liefern eine längere Haltbarkeit (quasi unbegrenzt). Mikrobiologie 100  Stammhaltung und Stammaufbewahrung Mikrobiologie Check the Matti et al., 2020 paper again: Vaspar method of strain conservation. 101  Stammhaltung und Stammaufbewahrung Probleme bei der Stammhaltung: ▪ Kosten für die Produktion der Aufbewahrungsproben: Sehr hoch für die Gefriertrocknung Hoch für die Tiefgefrierung: enorme Stromkosten ▪ Die Stabilität der Stämme: Genetische Veränderungen können vorkommen, schlimmstenfalls der Verlust der Produktionsfähigkeit bestimmter Metabolite, Verlust der Sporulierungsfähigkeit oder Genominstabilitäten Mikrobiologie 102  Stammhaltung und Stammaufbewahrung 4. Wasserkulturen ▪ Das ist die einfachste und wirtschaftlichste Art der Stammhaltung. ▪ Stämme bleiben lebensfähig auch nach > 20 Jahren, getestet! ▪ Die Aufbewahrung erfolgt bei Raumtemperatur ▪ Die Mikroben bleiben in einem Ruhezustand und die Zellen können direkt verwendet werden, um eine neue Flüssigkultur anzuimpfen. Mikrobiologie 103  Stammhaltung und Stammaufbewahrung 5. Schrägagarröhrchen mit Vaspar überschichtet Mikrobiologie 104  Published: 11 January 2020 Stammhaltung und Stammaufbewahrung Mikrobiologie 105  ▪ Abstract: ▪ All laboratories dealing with microbes have to develop a strain maintenance regime. While lyophilization based on freeze- drying may be feasible for large stock centers, laboratories around the world rely on cryopreservation and freezing of stocks at −80 ◦C. ▪ Keeping stocks at these low temperatures requires investments of several thousand kW/h per year. ▪ We have kept yeast stocks for several decades at room temperature on agar slants in glass reagent tubes covered with vaspar and sealed with cotton plugs. ▪ They were part of the Geisenheim Yeast Breeding Center stock collection that was started in the 19th century, well before −80 ◦C refrigeration technology was invented. ▪ Of these stocks, 60 tubes were analyzed and around one-third of them could be regrown. ▪ The strains were typed by sequencing of rDNA PCR fragments. Based on BlastN analyses, twelve of the strains could be assigned to Saccharomyces cerevisiae, two to S. kudriavzevii, and the others to Meyerozyma and Candida. ▪ The strains were used in white wine fermentations and compared to standard wine yeasts Uvaferm/GHM (Geisenheim) and Lalvin EC1118. ▪ Even with added nitrogen, the strains exhibited diverse fermentation curves. ▪ Post-fermentation aroma analyses and the determination of residual sugar and organic acid concentrations indicated that some strains harbor interesting flavor characteristics, surpassing current standard yeast strains. ▪ Thus, old strain collections bear treasures for direct use either in wine fermentations or for incorporation in yeast breeding programs aimed at improving modern wine yeasts. ▪ Furthermore, this provides evidence that low-cost/long-term culture maintenance at zero-emission levels is feasible. Mikrobiologie 106  Stammhaltung und Stammaufbewahrung Mikrobiologie 107  Stammhaltung und Stammaufbewahrung Hefe-Lagerung im Brauprozess ▪ Während der Lagerung zwischen zwei Brauvorgängen wird auf Vitality vs Viability geachtet. ▪ 10*106 Zellen/mL Bier ▪ Bei längerer Lagerung + kühlerer Lagertemperatur (1-4 deg) ▪ Bringt oft eine Verlängerung der Lag-Phase und eine Abnahme der Fermentationsrate mit sich. Mikrobiologie 108  Repitching in Bierfermentationen Hefe-Lagerung im Brauprozess ▪ Überprüfung der Viability: ▪ Methylenblaufärbung ▪ Tote Zellen sind blaugefärbt. Mikrobiologie 109  Verschiedene Wachstumsphasen Gesetz des Minimums: Carl Sprengel (1828), Justus von Liebig Thomas Robert Malthus (1766–1834) Mikrobiologie www.bg-kiel.de/ms2015/wachstumsphasen 110 Klausurfragen: ▪ Organismen haben verschiedene Wachstumsoptima bezüglich Temperatur, pH und Sauerstoffgehalt. Beschreiben sie unterschiedliche Einteilungen und ordnen Sie S. cerevisiae hier ein. ▪ Was ist der Unterschied zwischen Komplexmedien und definierten Medien? Wozu gehört YPD? Begründen Sie Ihre Antwort. ▪ Beschreiben Sie vier Möglichkeiten der Stammhaltung und Stammaufbewahrung für Mikroorganismen. ▪ Welche Stickstoffkomponenten im Most sind hefeverfügbar? Welche Stickstoffvarianten werden von S. cerevisiae bevorzugt? Wie konnte man das testen? Beschreiben Sie die Unterschiede in der Stickstoff-Zusammensetzung von Traubenmost und Apfelmost. 111