Biologie moléculaire : Microscopes et cellules - PDF

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Here's the conversion of the provided text into a structured markdown format: # Biologie Moléculaire ## 1. La Cellule ### a. Microscopie et Résolution Pour découvrir les cellules, le microscope a été essentiel car elles sont trop petites pour être vues à l'œil nu. ($10^{-6}$ m). La question de la qualité des images, récupérées avec le microscope, est devenue alors centrale. **3 éléments qui caractérisent une image:** * **Grossissement:** rapport entre taille réelle de l'objet et la taille image. * **Contraste:** rapport entre la densité la plus forte et la densité la faible d'une image. * **Résolution:** distance minimale qui doit séparer 2 objets pour qu'ils apparaissent distincts. C'est la résolution qui caractérise la qualité du microscope et celle d'une image. Une bonne résolution se traduit par une taille des pixels la plus petite possible (résolution fine ou faible) → bonne résolution est une faible taille de pixel (faible résolution). **Ex:** 1 nm est une meilleure résolution que 200 nm (petit chiffre = grain très fin sur l'image). **Les fonctions d'un bon microscope sont alors :** * Assurer Grossissement. * Fournir un contraste suffisant. * Garantir une bonne résolution. *NB: Tout est vrai pour le microscope mais aussi pour d'autres dispositifs comme le télescope, le téléphone, etc...* ### b. Microscopie simple (une seule lentille) et composée (deux lentilles) * **Fonctionnement d'une loupe:** lentille qui fait converger la lumière sur un point particulier. C'est une lentille dite convergente. * Un exemple de Microscope simple (à une seule lentille) est la loupe. * **Distance focale:** distance du point où la lentille fait converger la lumière (lumière objet arrive sur loupe puis converge pour qu'on puisse voir clairement) à la lentille. ## Quand l'observateur observe le point de convergence, il regarde **une image virtuelle** de l'objet, qui est **plus grosse que l'objet réel** (impression que les rayons viennent de plus loin). ->image apparaît plus grande * Un microscope composé (superposition de plusieurs lentilles convergentes) permet de **grossir davantage une image:** * 1ère lentille au niveau de l'objectif (proche de l'objet). * 2ème lentille au niveau de l'oculaire (proche de l'œil). $Grossissement = G1 * G2$ * Le microscope optique a permis la **découverte de la cellule.** à besoin d'un microtome (dispositif qui permet de faire des coupes très fines) qui permet le passage de la lumière à travers une cellule. →microscope optique + microtome = découverte cell + description *NB : Hooke est le premier à réaliser une observation formelle des cellules.* ### c. La lentille achromatique (solution contre aberrations) * Que ce soit pour les microscopes composés ou simples, le problème essentiel est la résolution. On a trop de limitations à la résolution, donc premièrement, les lentilles doivent être parfaites. * Mais même si la lentille est parfaite, on a des aberrations chromatiques (relatif aux couleurs) (séparation longueurs d'ondes: cf. cours physique optique géométrique) * **Les aberrations chromatiques** * Les longueurs d'onde (composition de la lumière blanche) de la lumière se font fragmenter par les lentilles → pas nette * La lumière est déviée de manière différente selon sa longueur d'onde. * *Exemple :* bleu et rouge convergent à différentes distances (diff distances focales) ce qui fait qu'à chaque point, on verra flou une des 2 couleurs. * → Bon grossissement mais mauvaise résolution * **Solution:** association de 2 verres différents avec des caractéristiques différentes * Le verre divergent (lentille complémentaire à la première) va compenser l'aberration en rassemblant les longueurs d'ondes. * *Ceci améliore la netteté et donc la résolution.* ### d. La théorie cellulaire Tous les êtres vivants sont composés d'au moins une cellule. La microscopie optique avancée a permis la découverte de cette théorie. ## 2. Biologie Cellulaire ### a. Le microscope électronique La 2ème partie du progrès en biologie cellulaire consiste à regarder ce qui se passe dans les cellules. Jusqu'à Schleiden et Schwann, on sait juste qu'il y a une cellule avec quelque chose dedans. Seulement, on arrive plus à améliorer la résolution des microscopes et on est incapable d'observer de nouveaux détails dans la cellule. En cause, l'arrivée à la limite théorique de ce qu'on peut faire avec microscope optique. $Résolution=\frac{0.61 \cdot \lambda}{n \cdot sin(\theta)}$ La résolution optimale est la moitié de la longueur onde. ($\lambda/2$) * **Limite théorique:** On ne peut pas voir plus en détails que 200nm (par rapport à la longueur d'onde de la lumière) → meilleure résolution optique (400/2 →pour onde microscope optique) * **Solution :** réduire la longueur d'onde mais on ne pourra plus voir ces longueurs ondes à l'œil nu étant donné que ça ne sera plus des photons (atome qui constitue la lumière) * → Pas de longueur plus courte que 400nm Ainsi la seule chose que l'on peut changer, est la longueur d'onde, mais c'est trop compliqué. Pour améliorer la résolution, on va remplacer la lumière par des électrons qui ont une longueur d'onde plus courte. Microscope optique: Lumière passe à travers l'objet et la lentille fait converger la lumière en 1 point. -> Photons (pas de masse) Microscope électronique: Faisceau d'électrons éclaire l'objet puis passe à travers une lentille. La lentille n'est pas en verre mais est électromagnétique et focalise le faisceau d'électrons sur un écran. Un faisceau d'électrons s'absorbe très vite, l'air peut le stopper. Il faut donc faire passer ce faisceau dans le vide. Ça ne passe pas à travers. L'objet est également dans le vide, cela veut dire que l'on ne peut pas mettre de cellules vivantes (meurt dans le vide). On ne peut pas faire passer un faisceau dans un objet trop épais, il serait absorbé trop vite. On a donc besoin d'un ultramicrotome. * Difficile à faire. * Lentille électromagnétique doit travailler avec les champs magnétiques. **Limites du microscope électronique** * Faisceau d'électrons ne peut pas s'utiliser autrement que dans le vide (tout dans le microscope est sous vide). * Échantillon aussi sous vide donc cellule forcément morte. * Nos coupes en microscopie électronique doivent être ultra minces sinon les électrons sont stoppés. | | Microscope optique | Microscope électronique | | :------------------- | :----------------- | :----------------------- | | Source | Photons | Électrons | | Observation | Vivante | Morte | | Pénétration | 10 à 20 μm | 100 nm (coupes fines) | | Aspect | Simple, rapide | Difficile, couteux | | Résolution maximum | 200 nm | 1 nm | ### b. Ultramicrotome (machine qui coupe) C'est un couteau qui permet de faire des tranches très fines pour permettre le passage des électrons à travers la matière et ce, afin d'obtenir une meilleure résolution. Pour ce faire ⇒ la matière coupée doit être résistante/dur grâce à une méthode de congélation puis de fixation par de la résine. →Microtome très précis / couteau très coupant / échantillon très résistant Microtome = mécanique qui permet de faire des tranches minces Couteau (verre et diamant) = spéciaux Échantillon très résistant (résine et congélation) → Mou -> résine-> polymériser Jacques Dubochet prix Nobel 2017 -> cryo-microscopie électronique Prendre la cellule -> congeler sans que rien ne bouge ### c. Compartiments Intracellulaires L'observation de compartiments intracellulaires a permis la découverte et le développement de la biologie cellulaire. = étudier ce qu'il se passe dans les cellules ## 3. Biologie Cellulaire et Moléculaire ### a. Les anticorps Aussi appelés antitoxines (à l'époque), ils sont composés de deux régions distinctes: * Région variable: unique à chaque antigène. * Région constante: similaire à chaque anticorps d'un même organisme. →Hist: antitoxine car dans expérience souris, les souris créaient une résistance aux toxines diphtérique (TD)→les anticorps ->Capable de reconnaitre un antigène ->Reconnait une molécule spécifique à sa forme ### b. Immunodétection et Microscopie On aimerait savoir comment toutes ces protéines individuelles fonctionnent dans la cellule: -> où est chaque protéine individuelle dans la cellule? * On aimerait le voir dans des cellules vivantes * Savoir à quoi elles servent. Il existe des techniques pour répondre à ce besoin. * **Immunofluorescence directe** * La fluorescence est une lumière de longueur d'onde différente à la normale $\rightarrow$ 521nm (mais reçoit longueur d'onde 494nm donc augmentation) * Causé par l'excitation $\rightarrow$ absorption puis la relaxation $\rightarrow$ émission d'un électron (moins d'énergie qu'au départ). * Changement d'orbite. * Retour: longueur d'onde plus longue $\rightarrow$ moins d'énergie. * **Rendre un anticorps fluorescent** * Une molécule fluorescente (fluorescéine). * Structure fait que l'électron absorbe. **Étapes suivantes:** 1. Fixation de la cellule au formaldéhyde solidification de la cellule (pour que l'anticorps rentrent dans la cellule sans qu'elle se vide de son liquide). La cellule est donc morte. 2. Perméabiliser la cellule grâce à la saponine $\rightarrow$ des trous pour que l'anticorps rentre -> dissout la membrane. 3. Injecter l'anticorps fluorescent qui va diffuser jusqu'à ce qu'il trouve la protéine qu'il peut lier. 4. Observation grâce à un microscope à fluorescence. * Microscope à fluorescence (optique) * Bloquer la lumière (verte) venant de la cell et seulement laisser passer celle fluorescente * Grâce à un filtre qui ne laisse seulement passer la lumière fluorescente * (Immunofluorescence double) * Permet de voir deux types d'anticorps avec diff fluorescence (diff longueur d'onde) * S'attachent à des différentes protéines (520 ou 545) * On peut superposer les images afin d'analyser. * L'immuno-microscopie électronique *Principe: utiliser des anticorps en microélectronique* * Étapes: 1. Fixation pour durcir la cellule (morte) et en faire une coupe fine de 50nm. 2. Mettre les Anticorps, couplés à un grain or, qui reconnait notre protéine. 3. Les particules de métal vont bloquer le passage des électrons en les absorbant. On observe un point noir (ou les anticorps se trouvent). 4. Double microscopie avec 2 tailles de grains d'or? * But: Combiner la détection de protéine et la résolution du microscope électronique qui est plus précise. NB: on ne peut pas voir la fluorescence en microscopie électronique. * c. 3D au confocal: Pour créer une image 3D d'un élément, on focaliser notre faisceau de photons sur un point précis à la fois (voxel: pixel 3D). Puis on analyse la laumière réémise au travers d'un filtre afin de détecter les photons qui sont rentrés en contact avec la protéine qui nous intéresse. On peut ainsi recréer une image selon le degré de fluorescence des faisceaux réémis. 1. Illuminer avec un laser une petite partie de l'échantillon -> un voxel (pixel pour un volume). 2. Ça avec chaque voxel de la cellule. 3. `→` Permet recontruction de la cellule en 3D. 4. Détecteur de photons permet de nous dire les anticorps sont là ou pas. * d. 4D grâce à la GFP * GFP: Green Fluorescent Protein. Protéine (et pas anticorps) fluorescente issue d'une méduse qui, quand elle reçoit de la lumière bleue, réémet de la lumière verte. `→`Permet de regarder les cellules vivantes. * On peut cloner le gène responsable de cette fluorescence chez la GFP et le fusionner avec le gène de la protéine qui nous intéresse. Par conséquent, la protéine produite sera également fluorescente. Outil GFP: on peut enfin regarder où sont les protéines dans les cellules vivantes(avant on devait fixer donc tuer la cellule) But: On peut voir les déplacements de la protéine dans la cellule en fonction du temps. c'est donc de la 4D car on a ajouté la dimension du temps. Regarder la cellule ainsi que ses protéines dedans.