Techniques d'étude de la cellule en microscopie PDF

BIOLOGIE CELLULAIRE CM1 Dr Nicolas CAPELLI Techniques d’étude de la cellule en microscopie Introduction : Biologie cellulaire : Étude des cellules et mécanismes impliqués dans : - cycle de vie de la cellule ( communication, métabolisme, reproduction, homéostasie, … ) , - mort de la cellu...

BIOLOGIE CELLULAIRE CM1 Dr Nicolas CAPELLI Techniques d’étude de la cellule en microscopie Introduction : Biologie cellulaire : Étude des cellules et mécanismes impliqués dans : - cycle de vie de la cellule ( communication, métabolisme, reproduction, homéostasie, … ) , - mort de la cellule, génétiquement programmée ( apoptose ) ou prématuré ( nécrose ). La cellule : Unité structurale et fonctionnelle du vivant. 2 types cellulaires : Procaryotes ( pro = avant ; karyon = noyau ) - Cellules sans noyau - Absence de compartiment membrané - Exceptions : thylacoïdes chez les cyanobactéries, magnétosome - Eubactéries et Archées Eucaryotes ( cellules à vrai noyau )  - Compartimentés par un réseau de membranes internes (organites) - Différents règnes : protistes (protozoaires, chromistes), mycètes (champignons), végétaux, animaux. Toutes les cellules sont : - Limitées par une membrane plasmique - Constituées d’éléments chimiques communs ( protéines, acides nucléiques, lipides, glucides … ) - Le résultat de l’expression d’un programme génétique complexe. HISTORIQUE : 1665-1675 : 1ère observation au microscope optique (MO) - Cellules de liège ( Robert Hooke ) - Protozoaires ( Anthony Van Leeuwenhoek ) 1838 : Théorie cellulaire ( Schleiden , Schwann ) Def : Tous les organismes vivants sont composés d’une ou plusieurs cellules. Les cellules sont les unités de base de la structure et de la fonction d’un organisme. Les cellules proviennent uniquement de la reproduction de cellules existantes 1830-1900 : Étude de la structure des cellules ( cytologie ) et des tissus ( histologie ) 1931 : 1er microscope électronique en transmission ( MET, Knoll et Ruska ) 1938 : Commercialisation du MET par Siemens - Grossissement : 30 000 x - Résolution : 10 nm 1964 : Commercialisation du microscope électronique à balayage (MEB) par Cambridge Instrument Co. - Grossissement : 20 000 x - Résolution : 50nm 1988 : Microscope confocal à balayage laser - Images 3D haute résolution d’un échantillon 2014 : Microscope à fluorescence super résolue - Observation du vivant à l’échelle nanoscopique 2017 : Cryo-microscopie électronique - Observation avec une résolution au niveau de l’atome - Jacques Dubochet, Joachim Frank, Richard Henderson obtiennent un Prix Nobel de Chimie. I – La microscopie optique ou photonique Le MO est un instrument d’optique qui utilise la lumière pour observer des objets vivants ou fixés ( coupes de tissus ). La lumière traverse l’échantillon, avant d’être réfractée par des lentilles de verre, de façon à grossir image projetée dans l’œil. 2 lentilles optiques : - L’objectif agrandit l’objet que l’on souhaite observer ( il existe plusieurs grossissements ), - L’oculaire pour que les rayons arrivent à l’œil de manière parallèles Un diaphragme permet de régler la quantité la lumière traversant l’échantillon placé sur la platine. Mise au point réalisée grâce à une visse macro- et micro- métrique (molettes liées à un système de crémaillère) qui permet un balayage en profondeur de l’échantillon. Remarque : la MO s’applique aussi à la physique des matériaux ou à la géologie. A – Les paramètres importants 1. Grossisement : rapport entre dimensions apparentes de l’image et dimensions rélles de l’objet. 2. Résolution ( pouvoir séparateur ) : + petite distance séparant 2 points voisins que l’on peut distinguer. Pouvoir de résolution de l’œil humain = 200 micromètre à 25 cm (0,2 mm)  3. Contraste : différence d’intensité entre points clairs et sombres d’une image Remarque : la résolution du MO est limité par la longueur d’onde de la lumière visible ( 0,2 micromètre avec un objectif à immersion ). B – Les principaux types de préparation Les préparations temporaires Objectif : donner du contraste, repérer une structure spécifique (organites) ou donner une indication sur la nature chimique ( polysaccharide, cellulose, lignine ) de l’échantillon par coloration Exemples : - Coloration de Gram, différencie les bactéries à Gram+ (violettes) et à Gram- (roses) en fonction de la nature de leurs parois cellulaires. Colorants vitaux ( non toxiques ) : - Bleu de méthylène ( colore en bleu les acides nucléiques), rouge neutre ( rouge en milieu acide, jaune en milieu basique, orange à neutralité ). Autres colorants :  - L’hématoxyline (colore les noyaux en bleu-violet) et l’éosine (colore les cytoplasmes en rose). - Le lugol ( ou solution iodée ) : détecte la présence d’amidon ( vire du brun orangé au bleu-noir ). Avantages : - Méthodes simples et rapides pour une observation à court terme d’échantillons vivants, - Observation en temps réel des processus dynamiques (cellules en division, mouvements d’organismes unicellulaires, … ) Inconvénient : - L’échantillon doit présenter une faible épaisseur afin de permettre le passage du faisceau incident des photons. Les préparations permanentes Objectifs : - Conserver la structure originale de l’échantillon pour des études à long terme (documentation, comparaison, … ) Inconvenients : - Complexité des étapes de préparation : - 1. La fixation Objectif : stabiliser et préserver la structure initiale de l’échantillon Fixateurs chimiques : formaldéhyde ( formol ), glutaraldéhyde, Bouin Hollande, … Remarque 1 : la fixation est réalisée immédiatement après le prélèvement de l’échantillon à observer. Remarque 2 : elle peut être réalisée par congélation. - 2. La déshydratation Objectif : remplacer progressivement l’eau par un solvant hydrophobe pour l’inclusion ultérieure dans une résine durcissante ( paraffine ). En retirant l’eau des tissus, on réduit le risque de rétrécissement, de déformation et de dégradation des structures cellulaires. Principe : l’échantillon est incubé dans des bains d’alcool de concentration croissante (70, 90, 100%) - 3. La substitution La paraffine est insoluble dans l’eau et l’alcool, mais soluble dans certains hydrocarbures. Objectif : remplacer l’alcool par un solvant miscible (soluble) dans la paraffine. Exemples : benzoate de méthyle, butanol, toluène, xylène…