Técnicas Experimentales en Fotoquímica - Parte II PDF

Cinética & Fotoquímica Superior Técnicas Experimentales en Fotoquímica- parte II Técnicas ópticas: EMISION Fenómenos de emisión ESQUEMA BASICO PARA EMISION FLUORESCENTE ESTACIONARIA  Instrumentation for Fluorescence Spectroscopy, en “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Joseph R....

Cinética & Fotoquímica Superior Técnicas Experimentales en Fotoquímica- parte II Técnicas ópticas: EMISION Fenómenos de emisión ESQUEMA BASICO PARA EMISION FLUORESCENTE ESTACIONARIA  Instrumentation for Fluorescence Spectroscopy, en “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Joseph R. Lakowicz Espectrofluorometria de estado estacionario k: factor instrumental que UV Fused Silica Metallic Neutral Density Filters depende de varios parámetros (geometría de observación, eficiencia de transmisión de monocromadores, ancho de sus rendijas, voltaje de foto- multiplicadores, ganancia de las partes electrónicas) “Molecular Fluorescence. Principles and Applications” Bernard Valeur Introduction to Fluorescence Sensing , pp 69-132. Fluorescence Detection Techniques Alexander P. Demchenko. Ed. Springer  Espectros de emisión vs. Espectros de excitación fluoresceina  El espectrofluorómetro ideal… Corre espectros de emisión y de excitación que representen la intensidad relativa de fotones por intervalo de longitudes de onda, para ello… ✓ La fuente de iluminación deber proveer una cantidad de fotones constante a todas las longitudes de onda ✓ El monocromador debe dejar pasar todas las longitudes de onda con igual eficiencia ✓ La eficiencia del monocromador debe ser independiente de la polarización de la luz ✓ El fotomultiplicador debe detectar fotones a todas las longitudes de onda con igual eficiencia  Además puede haber contaminación de señal: -por luz dispersada (muestras turbias) o -por fluorescencia de fondo (impurezas, solvente, etc) Puede hacer falta la corrección de los espectros de fluorescencia Ningún método de corrección es completamente satisfactorio No siempre es necesaria la corrección (en general uno compara espectros medidos con el mismo instrumento) Los instrumentos modernos no producen graves distorsiones (particularmente en el visible y el rojo) Sí son indispensables las correcciones para medir f e integrales de solapamiento  Método de corrección p/ espectros de excitación Uso de un contador cuántico ej: Rodamina B en etilenglicol (3 g/L) absorbe toda la luz incidente entre 220 y 600 nm f y max ( 630 nm) prácticamente no varían con exc Corrige por la intensidad de la fuente de iluminación. Esta intensidad se convierte en una señal proporcional al n° de fotones incidentes.  Método de corrección p/ espectros de emisión Uso de sustancia estándar: Se requiere corregir por la dependencia con  de la sensibilidad del dispositivo para la detección Se utiliza una sustancia de referencia cuyo espectro corregido de emisión sea conocido A partir del espectro de emisión medido se calculan los correspondientes factores de corrección Ej: sulfato de quinina, -naftol, dimetil amino nitro benceno…  Comparación excitación (absorción)/emisión Sólo se puede esperar la relación de imagen especular cuando se comparan espectros de emisión corregidos Los espectros de excitación y de absorción son iguales cuando están corregidos y cuando A < 0 ,05 (¿por qué?) Fuentes de discrepancia: ✓ Intensidad de la lámpara ✓ Reflexión de redes de difracción ✓ Sensibilidad del detector ✓ Reflectividad de elementos ópticos (espejos, prismas…) Efecto del ancho de rendija (slit) Importancia de medir el blanco del espectro de fluorescencia Dispersión de luz de excitación (Rayleigh) Dispersión Raman (*) Fluorescencia del triptofano (*) Para excitación a 280 nm, el pico Raman del agua aparece a 311 nm (o sea, siempre a 3600 cm-1 debajo de la frecuencia de excitación) Efecto de la concentración del fluoróforo  Resumen de errores comunes en la preparación de la muestra para estudios de fluorescencia  Arreglos geométricos para la observación de fluorescencia Convencional (ángulo recto) Iluminación Frontal  Medición de rendimientos cuánticos de fluorescencia f Por comparación con estándares que cumplan las siguientes condiciones: ✓Disponibles en alta pureza ✓Fotoquímicamente estables en solución y en estado sólido (almacenado) ✓Rendimiento cuántico de fluorescencia alto y conocido con exactitud ✓Espectros de absorción y fluorescencia anchos y sin picos agudos ✓Espectro y rendimiento de fluorescencia independientes de  ✓Pequeño solapamiento entre espectros de absorción y fluorescencia (evitar errores por autoabsorción) ✓Emisión despolarizada Medición de Rendimientos Cuánticos de Fluorescencia Ver : IUPAC REFERENCE MATERIALS FOR FLUORESCENCE MEASUREMENT DAVID F. EATON, 1988  … Medición de Rendimientos Cuánticos de Fluorescencia referencia Las integrales representan las areas de los respectivos espectros de fluorescencia corregidos Las soluciones deben ser muy diluídas x Efectos de filtro interno de la excitación o de la emisión (autoabsorción) Dependen del arreglo geométrico de la muestra Medición de la anisotropía de la emisión Antraceno  Medición de la anisotropía estacionaria de la emisión Si la distribución de fluoróforos es anisotrópica, la fluorescencia también. Cualquier cambio en la dirección del momento dipolar de la transición durante el tiempo de vida del fluoróforo, causará una disminución de la anisotropía: se induce la depolarización total o parcial de la emisión Las medidas de polarización de la fluorescencia proveen información sobre la movilidad molecular, tamaño, forma y flexibilidad de las moléculas, fluidez del medio, parámetros de ordenamiento, …  Medición de la anisotropía estacionaria de la emisión Excitación con luz polarizada Anisotropía Polarización mide orientación promedio de las moléculas respecto de la orientación de la excitación Modos de la Espectroscopia de Emisión Emisión estacionaria vs. resuelta en el tiempo =cte. Fluorometría resuelta en el tiempo Método pulsado (dominio del tiempo) Método de modulación de fases (dominio de las frecuencias) principios instrumentales diferentes pero teóricamente equivalentes Técnicas pulsadas de fluorescencia o Excitación con lámpara o láser o Determinación de i(t) disparo PM1 OSCILOSC LAMP o MC1 S Técnica de convolución LASER.. MC2  i (t ) = k f M * 1  PM2 señal i (t ) = i (o) exp( −t /  ) 1  = k f + k ic + k isc + k Q [Q ] + k r  Integral de convolución relación entre el decaimiento medido y el decaimiento del sistema Para cualquier función de excitación E(t), la respuesta R(t) de la muestra es el producto de convolución de esta función por la respuesta al pulso   Técnica del Conteo del Fotón Unico (TCSPC: time-correlated single photon counting) Principio: la probabilidad de detectar un fotón individual emitido a un tiempo t de un pulso de excitación es proporcional a la intensidad de la emisión a ese tiempo. La curva de decaimiento de la fluorescencia se construye registrando el número y el tiempo en que un gran número de fotones individuales son emitidos luego de los pulsos de excitación Valeur, cap.6 Tkachenko. Cap.8 Curso Tec. Exp. Cin. Qca. ESR. (UNMdP, 2007)  1000 Shinorine (ac) Conde et al. 100 Counts 10 4 Residuals 2 0 -2 -4 5 10 15 20 25 time / ns  Excitación modulada: medidas en el dominio de las frecuencias La excitación (laser o lámpara de Xe) es variable, modulada en forma de onda seno o coseno con frecuencia  La respuesta se caracteriza por una función armónica de frecuencia angular  con una fase  y una modulación m RF: radio frecuencias Excitación modulada: medidas en el dominio de las frecuencias I exc (t ) = I 0.sen (.t ) I em (t ) = m sen (.t +  )  Evolución temporal del sistema Excitación modulada: (caso de cinética de orden 1 = exponencial simple) I f (t ) = I 0. exp( −t /  ) A bajas frecuencias (1) la fase se aproxima a 90o y la modulación (amplitud de la señal) es pequeña  la frecuencia de excitación es más alta que la velocidad de reacción del sistema y la respuesta está retardada y es baja. log ( ) Excitación modulada: ecuaciones para cinética de orden 1 Para  =1, m  = (1 + 2  2 ) −1 / 2 arc tan 1 -> = 45o m = 2/2 = 0,707 tan ( ) = . Atención! se utiliza la frecuencia de modulación circular (ω = 2π x Hz) en radianes m=0,707 =45° log  La respuesta a la frecuencia de modulación toma una forma distinta si el decaimiento es multiexponencial Datos simulados Se muestran ajustes a funciones mono- exponenciales o biexponenciales N-acetyl-L-tryptophanamide (NATA)  Comparación de técnicas de emisión pulsada y de modulación Interpretación más directa, Igual precisión que métodos se simplifica el análisis de pulsados para decaimiento diferentes modelos cinéticos monoexponenciales. (If  [M*]) Resolución mejor que 1 ns, sin Desde  ~ 10 ps hasta cientos medida extra de la respuesta de ns (limitado por la instrumental. Limitada por el velocidad de repetición de mayor valor de  alcanzable y pulsos típicamente de 1 MHz) la precisión de  y m a altas Mejor determinación de  frecuencias. cortos. Mejor determinación de  Mejor medición de largos (ms). intensidades bajas de emisión Adquisición más rápida para Limitado a muestras que muestras con emisiones emitan no más de un fotón por fuertes. pulso.