ADN: Estructura y Organización Genómica PDF

ADN: Estructura y organización genómica Capítulo 10 Karp “La naturaleza del gen y del genoma” 10.7 – 10.8, 10.10 – 10-11 Juan Carlos Collantes, PhD  Superenrollamiento Tipo 1 del ADN Si bien el superenrollamiento es importante Tip...

ADN: Estructura y organización genómica Capítulo 10 Karp “La naturaleza del gen y del genoma” 10.7 – 10.8, 10.10 – 10-11 Juan Carlos Collantes, PhD  Superenrollamiento Tipo 1 del ADN Si bien el superenrollamiento es importante Tipo 2 para compactar el ADN para su empaquetamiento, las células deben modificar esta organización del ADN para llevar a cabo procesos metabólicos como replicación, transcripción, reparación, Tipo 2 división celular, etc. Enzimas especializadas llamadas topoisomerasas se encargan modificar el superenrollamiento Tipo I: generan rotura de cadena simple, eliminando la tensión y el superenrollamiento Tipo II: generan roturas de doble cadena controlada para superenrollar o relajar el ADN El ADN es una molécula grande, por lo que el superenrollamiento es importante para su empaquetamiento en el núcleo (eucariotas) o en el citoplasma (procariotas) Enzimas topoisomerasas ayudan al superenrollamiento y desenrollamiento del ADN de acuerdo a las necesidades celulares  Superenrollamiento del ADN Topoisomerasa tipo I Topoisomerasa Tipo I: genera rotura de cadena simple, eliminando la tensión y el superenrollamiento  Rotura de cadena simple ADN intacto  Superenrollamiento Topoisomerasa tipo II del ADN Tipo II: generan roturas de doble cadena para superenrollar o relajar el ADN Estas roturas permiten a una cadena (segmento T, transportado) pasar a través de otra a la cual se introdujo la rotura de doble cadena (segmento G, gate o puerta) Una vez que el segmento T ha pasado a través de G, la rotura es sellada https://www.youtube.com/watch?v=5hwaDamU-jo https://www.youtube.com/watch?v=gbSIBhFwQ4s Complejidad del genoma Organización del ADN en las células, secuencias repetitivas, secuencias únicas  2nd ed. Pierce, Benjamin. Genetics: A Conceptual Approach, Organización del genoma El genoma es la secuencia total de ADN que corresponden a una especie o individuo Los genes son las unidades funcionales del genoma, cuyas funciones son específicas del organismo y del tejido donde se expresan Los individuos de una especie tienen la misma información en sus genomas, con pequeñas Todas las células de un organismo tienen variaciones (alelos) exactamente la misma secuencia genómica (a excepción de las células B y T del sistema inmune)  Una propiedad importante del ADN para que el genoma pueda expresarse y replicarse, es la desnaturalización de la molécula ¿Qué es la desnaturalización del ADN? 😎 🥵 25°C 95°C Desnaturalización del ADN La temperatura a la cual se ha llegado a la mitad del aumento de Se refiere a la capacidad del ADN de absorbancia se separar sus cadenas, debido a que están denomina temperatura de fusión o de melting unidas por puentes débiles de hidrógeno. (Tm) En laboratorio, la desnaturalización del ADN se logra aumentando la temperatura  ¡Consulta 1! Desnaturalización del ADN La temperatura a la cual se ha llegado a la mitad del aumento de Se refiere a la capacidad del ADN de absorbancia se separar sus cadenas, debido a que están denomina temperatura de fusión o de melting unidas por puentes débiles de hidrógeno. (Tm) En laboratorio, la desnaturalización del ↑%GC ↑Tm (?) ADN se logra aumentando la temperatura  NH2 C=O Pares de bases G-C son más H C=O fuertes NH2 Temperatura C=O Los pares de bases G-C son más estables que A-T debido a que los primeros forman 3 puentes de hidrógeno, requiriendo más energía para separar que pares de bases A-T, NH2 C=O que sólo forman dos puentes de hidrógeno Desnaturalización del ADN Renaturalización del ADN  Es la capacidad que tiene el ADN desnaturalizado de reasociarse con sus cadenas complementarias al bajar la temperatura lentamente Renaturalización del Regenera los pares de bases originales, recuperando sus características de material genético (capacidad de transformación en ADN bacterias) Esta observación permitió el desarrollo de técnicas moleculares como hibridación in situ, clonación, PCR, secuenciación, etc.  Reacción en cadena de la polimerasa °T = ∽98°C °T = 55 – 72°C °T = 68 – 72°C Denaturación Renaturación  Hibridación in situ Secuencias altamente Secuencias no repetitivas: centrómeros repetitivas: genes únicos Hibridación in situ La unión de la sonda al ADN objetivo se revela mediante autorradiografía (detección de radiactividad). El patrón de migración del ADN depende del tamaño del fragmento: ↑migración ↓tamaño y vice versa Sonda marcada La propiedad de reasociación del ADN también nos permite analizar la complejidad de los genomas  ¡Los genes que codifican para proteínas ocupan menos del 2% del genoma humano! Leypold, N. A., & Speicher, M. R. (2021). Trends in Genetics, 37(10), 903-918 ¿Cómo podemos usar la renaturación del ADN para determinar la complejidad de un genoma?  Renaturalización del ADN ADN no repetitivo La velocidad de renaturalización o reasociación refleja la complejidad del genoma Genomas simples como virales o bacterianos tienden a generar curvas simples de reasociación, debido a que tienen una secuencia lineal simple de ADN genes repetitivo El tiempo de reasociación es inversamente proporcional a la complejidad: Secuencias únicas tardan más tiempo en reasociarse que secuencias repetitivas Complejidad del genoma Renaturalización del ADN En eucariotas, como plantas y animales, el genoma es más complejo, por lo que las curvas de reasociación tienen una tendencia escalonada Se debe a que estos genomas complejos tienen tres tipos de secuencias: Altamente repetitivas Moderadamente repetitivas Secuencias altamente repetitivas se reasocian más No repetitivas rápidamente que secuencias únicas (no repetidas) debido a la abundancia de regiones complementarias Regiones repetitivas Secuencia única Secuencias altamente repetitivas Conocidas como repeticiones en tándem, o regiones altamente repetitivas, ocurren aproximadamente entre 1% y 10% del total del genoma 3 tipos: Satélites El número de repeticiones en tándem Mini satélites puede variar de individuo a individuo, y Microsatélites esto puede ser usado para identificación ¿Cómo se generan estas repeticiones en tándem en los genomas? Entrecruzamiento desigual genera duplicaciones génicas en tándem Deleción Duplicación Repeticiones en tándem Satélites Son repeticiones de secuencias cortas (5-100+ pb) que se extienden a lo largo de millones de pares de bases. Se encuentran en regiones como centrómeros Cumplen funciones estructurales y regulatorias En hibridación in situ, dan señal en todos los cromosomas  Acusado Víctima Minisatélites Son repeticiones de secuencias cortas (10-100 pb) que se repiten hasta 3000 veces Ocupan menor espacio que los satélites El número de copias es variable, y puede cambiar de una generación a otra Debido a la alta variabilidad de estas secuencias, se usan en identificación de individuos (fingerprinting) en paternidad o forense Estos marcadores se conocen como ¿Es culpable? repeticiones cortas en tándem (short tandem repeats, STR) STR Man 3 👍  Microsatélites Repeticiones cortas de 1 a 9 pb, repetidos entre 10 y 40 veces. El número de repeticiones es variable, y cambia de una generación a otra. Útiles para comparaciones genómicas entre poblaciones (e.g. ancestría, migraciones, etc.) En poblaciones africanas existe una mayor diversidad de estos marcadores, indicando que fue el lugar origen de la humanidad A medida que las poblaciones migraron fuera de África, la diversidad disminuye (efecto fundador/cuello de botella) Secuencias moderadamente repetitivas Moderadamente repetitivas Dependiendo del organismo, puede abarcar entre el 20% y el 80% del total del genoma En humanos es alrededor del 50% del total del genoma No se repiten en tándem a diferencia de los satélites Están dispersos a lo largo del genoma (i.e. no surgen como resultado de duplicaciones génicas, como las secuecnias altamente repetitivas) ¿Cuál es el mecanismo de duplicación? Ocurren normalmente en regiones intergénicas, pero también se encuentran en algunos genes específicos, como el gen del ARN ribosomal o histonas. Se clasifican en dos tipos, dependiendo de la naturaleza de las repeticiones SINE: short interspersed nuclear elements, elementos nucelarescortos dispersos LINE: long interspersed nuclear elements, elementos nucleares largos dispersos Secuencias no repetitivas No repetitivas Secuencias únicas, no repetidas en el genoma, generalmente genes únicos Tienden a reasociarse más lentamente que las regiones altamente y moderadamente repetitivas A diferencia de los satélites, al realizar hibridación in situ, la señal proviene de un sitio discreto del genoma  Las secuencias no repetitivas, o secuencias únicas, toman más tiempo en reasociarse, debido a la escacés de estas secuencias en el genoma Naturaleza dinámica del genoma Elementos genéticos móviles 🤔  Feschotte, C., et al. (2002). Nature Reviews Genetics Elementos genéticos móviles Existen secuencias repetidas a lo largo del genoma que se encuentran dispersas (i.e. no en tándem) en múltiples cromosomas (LINEs y SINEs) Este fenómeno no se explica mediante entrecruzamiento desigual En los años 50, Barbara McClintock del CSHL, observó que en el maíz existían variaciones en coloración que aparecían o desaparecían de una generación a la siguiente Propuso que existían elementos genéticos móviles a los cuales denominó elementos transponibles, y el proceso de “salto” entre un sitio y otro del genoma lo llamó transposición  Transposón Tn5 bacteriano Transposones En 1960 se descubrieron elementos móviles en genomas bacterianos, los cuales fueron denominados transposones Estos elementos codifican para una enzima llamada transposasa Esta enzima cataliza la escisión del transposón de un sitio genómico y su inserción (integración) en otro sitio objetivo Mecanismo “cut & paste” (transposon de ADN) Las repeticiones que flanquean el transposón sirven como señal de reconocimiento de la transposasa  Secuencias Transposones moderadamente repetitivas Los transposones ocurren en todos los organismos, y son importantes para la biología humana 1 de 500 enfermedades genéticas resultan de transposones integrados en genes codificantes (e.g. ciertos casos hemofilia, DMD, neurofibromatosis, etc.) Entre 45% - 60% del total del genoma humano corresponde a elementos genéticos móviles Solo un pequeño porcentaje de estos elementos pueden aún moverse de un lugar a otro, y algunos están asociados a enfermedades Sus “restos” se encuentran inactivos en el genoma debido a procesos de silenciamiento genético o mutaciones xinglab.genetics.rutgers.edu deletéreas  En el genoma humano existen principalmente 2 tipo de transposones: Transposones Transposones de ADN (≈3%) Retrotransposones (≈40%) Mecanismo de transposón de ADN eucariota: “corta y pega” (cut & paste)  En el genoma humano existen principalmente 2 tipo de transposones: Transposones Transposones de ADN (≈3%) Retrotransposones (≈40%) Mediante este mecanismo, los transposones se duplican en cada evento de transposición Mecanismo de retrotransposón eucariota: “copia y pega” (copy & paste)