Curs 2 Genetica Umană - Structura Genomului Uman

CURS 2 GENETICA UMANĂ  U.M.F IAŞI B. STRUCTURA GENOMULUI UMAN  Genomul uman (GU) = – conţinutul ADN celular sau – ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 în nucleu: 22 autosomi+X+Y şi 1 în mitocondrii), = 3,2 miliarde...

CURS 2 GENETICA UMANĂ  U.M.F IAŞI B. STRUCTURA GENOMULUI UMAN  Genomul uman (GU) = – conţinutul ADN celular sau – ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 în nucleu: 22 autosomi+X+Y şi 1 în mitocondrii), = 3,2 miliarde de pb  GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%). U.M.F IAŞI 2. STRUCTURA GENOMULUI UMAN GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%). 25.000 gene U.M.F IAŞI 2.1. GENOMUL NUCLEAR  Enorm (3,2 miliarde pb),  Fragmentat: (22A+X+Y) molecule de ADN + proteine → cromozomi  Complex, heterogen: ADN nerepetitiv ADN moderat repetitiv ADN înalt repetitiv  ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)  U.M.F IAŞI 2.1. Genomul nuclear a) ADN GENIC (25%)  Gena = unitatea de informaţie genetică → codifică un produs primar specific (proteine sau ARN)  Structura genelor este foarte complexă - ADN genic:  ADN codant = exoni (10%)  ADN necodant (90%) = introni, secvenţe reglare, gene nefuncţionale (pseudogene) sau fragmente de gene  U.M.F IAŞI b) ADN EXTRAGENIC (75%)  Secvenţe netrasncrise (necodante);  Funcţii puţin cunoscute: - rol “tampon” a mutaţiilor; - împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză şi schimbul egal (CO) de segmente cromozomiale → recombinare genică – sursă de variabilitate !!!.  Alcătuit din:  ADN nerepetitiv = secvenţe unice sau un nr mic de copii (60%)  ADN repetitiv (40%).  U.M.F IAŞI (1) ADN EXTRAGENIC NEREPETITIV (60%)  SECVENŢELE UNICE sau SECVENŢE ÎNTR-UN NR MIC DE COPII  DUPLICAŢII SEGMENTALE (5% GU) – blocuri (~10Kb) ce flanchează genele (pe acelaşi cromozom) ; rol în sinapsa corectă a omologilor in meioză *.  Importanţă: fiind identice - pot genera erori de împerechere a cromozomilor omologi → CO inegal → mutaţii: duplicaţii /deleţii genice → BOLI GENOMICE  U.M.F IAŞI (2) ADN EXTRAGENIC REPETITIV (40%)  ADN moderat repetitiv (~30%): secvenţe scurte repetate de sute de mii de ori, dispersate în genom  (ex SINEs şi LINEs)  ADN înalt repetitiv (~10%): secvenţe foarte scurte, repetate în tandem →→→, de milioane de ori; 3 tipuri:  ADN satelit (blocuri HCRT la centromer, telomere, CS) = rol structural;  ADN minisatelit (minisateliţi hipervariabili), dispersat în toţi cromozomii = markeri genetici individuali = folosiţi în “amprenta genetică”  ADN microsatelit  U.M.F IAŞI 3. GENOMUL MITOCONDRIAL  ADNmt – câteva mii de copii per celulă = 0,5%  Genomul mitocondrial diferă de genomul nuclear: mic (16.569 pb); circular; neasociat cu proteine; fără ADN repetitiv; compact: 97%=secvenţe codante 37 de gene: contigue, fără introni. Codul genetic mitocondrial diferă puţin de cel nuclear  U.M.F IAŞI GENOMUL MITOCONDRIAL  Genomul mitocondrial al zigotului provine, prin ovul, exclusiv de la mamă.  ADNmt poate suferi mutaţii germinale sau somatice  Mutaţiile germinale produc o serie de boli degenerative în SNC, SNP, muşchi, etc, care se transmit maternal: de la mamă la toţi descendenţii; bărbaţii bolnavi nu transmit boala  U.M.F IAŞI  ADNmt poate suferi mutaţii somatice, după naştere:  produse de radicalii liberi de O2 (generaţi în mitocondrii);  favorizate de structura ADNmit (absenţa histonelor; densitate mare de gene; etc)  Mutaţiile se acumulează rapid datorită absenţei mecanismelor de reparare  Determină scăderea producţiei de energie → boli degenerative, cancer şi senescenţă  U.M.F IAŞI 1. APARATUL GENETIC AL CELULEI (v. LP 1) APARATUL GENETIC: structurile celulare care conţin ADN: nucleul + mitocondriile (1). NUCLEUL → 99,5% ADN ADN + proteine → (fibre) CROMATINĂ ↓↑ CROMOZOMI. Cromatina şi cromozomii = două modalităţi diferite de organizare morfo - funcţionlă a materialului genetic în inetrfază şi diviziune. (2). MITOCONDRIILE → 0.5% ADN, origine exclusiv maternă.  U.M.F IAŞI 2. CROMATINA (v. LP ) 2.1. EUCROMATINA ŞI HETEROCROMATINA CROMATINA = ADN + proteine Caracteristici EUCROMATINA HETEROCROMATINA Exclusiv în nucleu! Condensare Fin dispersată Puternic condensată (cromocentri) Două tipuri morfo-funcţionale Colorare Slabă Intensă distincte: Replicare în faza Precoce Tardivă S - EUCROMATINA Activitate Activă Inactivă  genetică activă genetic Compoziţie Predomină p.b. C - G; Predomină p.b. A - T; ADN dispersată chimică ADN nerepetitiv; proteine nehistonice repetitiv; proteine histonice - HETEROCROMATINA Rol morfologic Alcătuieşte benzile Alcătuieşte benzile R pozitive (sau G R negative (sau G pozitive) inactivă genetic negative) condensată (cromocentri) U.M.F IAŞI EUCROMATINA ŞI HETEROCROMATINA (v. LP )  HETEROCROMATINA:  constitutivă – constantă în structura cromozomilor: benzi G, benzi C (cen, Yq, p A, CS)  facultativă – diferită în celule / organisme diferite (hetrocromatinizarea o formă de reglaj genic) ex., cromatina sexuală  U.M.F IAŞI 2.2. CROMATINA SEXUALĂ (v. LP )  CROMATINA SEXUALĂ - definiţie: un corpuscul de HCRT=, cromocentru poziţie, mărime, formă ≠ alţi cu particularităţi morfologice bine definite, cromocentri care permite identificare NR cromozomilor sexuali→ - determinarea sexului genetic (XX sau XY); - anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY). Morfologie – v.LP  La femeie: cromatina X (corpusculul Barr)  La bărbat: cromatina Y (corpusculul F)  U.M.F IAŞI ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE  CROMATINA X: rezultă prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) → va forma (prin heterocromatinizare) corpusculul Barr Ipoteza Lyon (1961): (1) inactivarea cromozomului X este totală; ambele sexe → un singur X activ. (corect = parţială* →regiuni/gene active în ambii cromozomi X) (2) se produce precoce (i.u) şi este definitivă; (posibil = uneori reversibilă) (3) are loc la întâmplare (XM sau XP) şi independent în fiecare celulă (posibil = uneori ne întâmplătoare) U.M.F IAŞI Numărul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi (numărul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1) DIAGNOSTIC Femeie Bărbat Nr. C. Barr 0 1 2 0 1 2 Sex genetic XX XY (în stări intersex) Anomalii de număr XO XXX XXY XXXY cromozomi sexuali XXYY în obs. clinice de disgenezii gonadice  U.M.F IAŞI CROMATINA SEXUALĂ  CROMATINA Y: reprezintă heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung cromozom Y (colorată cu flurocromi – ex., quinacrină – şi vizibilă la microscop UV ca un corpuscul fluorescent ) corpuscul F) exclusiv la barbati Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y ex., bărbaţii XYY au 2 corpusculi F  U.M.F IAŞI 2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI  Analiza cromatinei la microscopul electronic evidenţiază un sistem ierarhizat de compactare a moleculei de ADN → fibre de cromatină,  de dimensiuni diferite,  alcătuite din ADN, histone şi proteine nehistonice.  U.M.F IAŞI 1) Filamentul cu nucleozomi (10nm)  Un segment de ADN (146 pb) - se înfăşoară (1 tur şi 3/4) - în jurul unui "miez" histonic, cilindric (8 mol.) → un NUCLEOZOM.  Nucleosomii → legaţi printr-un segment de ADN liniar (60 p.b.) → FILAMENTUL CU NUCLEOZOMI (~ "şirag de mărgele").  FN - menţinut împachetat de către histona H1, ce leagă doi nucleozomi vecini.  Rată de "compactare" a ADN nativ este de circa 10:1  U.M.F IAŞI 2) Fibra de cromatină (30nm)  Filamentul cu nucleozomi se spiralizează în solenoid → fibra de cromatină (FC) (30 nm) Rată de "compactare" a filamentului cu nucleozomi este de circa 5:1  3) U.M.FFibra IAŞI pliată în bucle laterale (300 nm)  FC (30 nm) se pliază în bucle laterale ataşate la un “schelet” de proteine nonhistoince → FPBL = 300nm  O buclă (domeniu crs) – de ~75Kb – câteva gene = unitate funcţională (de transcripţie şi replicare).  Rată de "compactare" este de circa 10:1  U.M.F IAŞI 4) Cromozomul metafazic (300 nm)  În profază fibra de cromatină se condensează (20:1) → cromatida (700 nm) unui cromozom  Cromozomii – grad maxim de condensare în metafaza diviziunii  U.M.F IAŞI STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI sinteză ADN FILAMENT F I B R A FIBRA CROMATIDA CU DE PLIATĂ ← UNUI NUCLEOSOMI CROMATINĂ ÎN BUCLE CROMOZOM INTERFAZA DIVIZIUNE  Fiecare cromatidă are o singură moleculă de ADN  organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate,  compactată de ~ 10.000 ori, pentru a face posibilă: localizarea în nucleu distribuţia corectă a materialului genetic în diviziune  U.M.F IAŞI STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI Sinteză  Buclele fibrei de 300 nm se fixează neregulat de scheletul proteic:  zone cu mici aglomerări = cromomere  zone mai laxe  Prin condensarea cromatidei în profază, cromomerele se unesc şi formează benzi intens condensate şi colorate (benzi G + = heterocromatină) care alternează cu benzi mai puţin condensate şi mai clare (benzi R + = eucromatină).  U.M.F IAŞI STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI Sinteză  Fiecare cromozom are o structură internă eterogenă caracteristică (permite identificarea lui precisă)  U.M.F IAŞI 3. CROMOZOMII UMANI  CROMOZOMI = organite nucleare care fixează intens coloranţi bazici (“chroma” + “soma”)  Funcţii:  Transportă + distribuie materialul genetic în cursul diviziunii → stabilitatea proceselor ereditare.  Asigură recombinarea genetică în meioză  U.M.F IAŞI 3.1. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANI a). Elemente comune tuturor cromozomilor: Cromatidele Centromerul (1) COMATIDELE Telomerele - Crz = bicromatidian← după replicare; - Cromatidele surori ≡ 1 moleculă de ADN + Pr  U.M.F IAŞI a). Elemente comune tuturor cromozomilor (2) CENTROMERUL  locul de ataşare a cromatidele surori (prin proteina ISS)  unic → constricţie primară  împarte cromatidele în braţele “p” şi “q”  poziţie fixă – determinată de o secvenţă ADN repetitiv (ADN satelit) identică la toţi cromozomii) + ADN specific fiecărui cromozom;  cromozomi M, SM, A  U.M.F IAŞI a). Elemente comune tuturor cromozomilor (2) CENTROMERUL  Rol esenţial pentru SEGREGAREA cromozomilor din cursul diviziunii celulare:  La ADN cen se fixează proteine CENP = kinetocorii → locul de fixare a filamentelor fus de diviziune → ce vor tracta cromatidele la poli (în anafază)  U.M.F IAŞI a). Elemente comune tuturor cromozomilor (3) TELOMERELE = structuri specializate, formate din ADN repetitiv + proteine asociate, care “acoperă” şi protejează capetele cromozomilor. Funcţii:  menţinerea integrităţii structurale;  asigurarea replicării complete;  poziţionare cromozomilor omologi în nucleu  U.M.F IAŞI b). Elemente caracteristice unor cromozomi (1) SATELIŢII = mase mici de heterocromatină ataşate pe braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici (exceptând Y) = variante normale (2) CONSTRICŢIILE SECUNDARE= blocuri de heterocromatină situate pe 1q, 9q, 16q – lângă centromer = variante normale (3) SITUSURILE FRAGILE = lacune necolorate pe cromatidele unor cromozomi. Majoritatea = variante normale; excepţie fra Xq27 asociat cu retard mintal = Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn)  U.M.F IAŞI c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE  Prin diferite tratament – se observă pe cromozomii metafazici o serie continuă de benzi longitudinale, - unele intens colorate (benzi G) - ce alternează cu benzi slab colorate (benzi R)  U.M.F IAŞI c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE  Benzile reflectă structura internă, heterogenă, a cromozomilor.  Fiecare cromozom – are un model caracteristic de benzi → identificarea sa precisă.  U.M.F IAŞI 3.2. TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP) a). Principiile metodelor (!!!) (1) Obţinerea de celule în diviziune:  Culturi celulare: limfocite, fibroblaste, celule fetale (← amniocenteză); - 0,5 ml sânge periferic (recoltat steril, pe heparină) → mediu cultură cu PHA (stimulează diviziunile) → 72 ore  Ţesuturi care se divid activ: măduvă osoasă (← punvţie medulară), trofoblast (← placentocenteză); (2) Obţinerea de celule în metafază: blocare cu colchicină (3) Obţinerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare pe lame, colorare, ± tehici de marcaj în benzi. (4) Analiza preparatelor* → cariotip  U.M.F IAŞI EVOLUŢIA TEHNICILOR DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP) (1) TEHNICI DE GENERAŢIA I (1956) - cromozomi uniform coloraţi; - identificare imprecisă* (2) TEHNICI DE GENERAŢIA II (1970) - marcaj în benzi G sau R cromozomi metafazici (400 benzi); - identificare precisă  U.M.F IAŞI TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP) (3) TEHNICI DE GENERAŢIA III (1977) - Înaltă rezoluţie: cromozomi M PM P pro-matafazici (550 benzi) sau profazici (850 benzi) - o bandă = 3-5 Mb  U.M.F IAŞI TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP) (4) TEHNICI DE GENERAŢIA IV (1991) - citogenetică moleculară - FISH metafazic - se pot identifica f. precis remanierile cromozomiale şi microdeleţiile - FISH interfazic Ce este FISH ? tehnică de analiză cromosomică F fluorescence I in Hibridare fluorescentă S situ in situ H hybridization Tehnică moleculară Tehnică moleculară pentru detecţia pentru localizarea anomaliilor secvenţelor genice  PRINCIPIUL TEHNICII FISH Hibridare (formare de legături de hidrogen) între o sondă specifică de ADN (marcată fluorescent sau imunohistochimic) şi secvenţa complementară prezentă într-un anumit segment cromosomic hibridizarea se bazează pe legea complementarităţii bazelor azotate, conform căreia în moleculele de ADN se formează următoarele perechi: A-T C-G  a. Proba şi ADN ţintă b. Marcarea probei – indirectă (stg.) şi directă (dr.) c. Denaturarea probei şi a ADN-ului ţintă d. Hibridarea între probă şi ADN-ul ţintă e. Fixarea fluoroforului la haptenă (marcaj indirect) PRINCIPIUL TEHNICII FISH  AVANTAJELE TEHNICII FISH  SENSIBILITATE ŞI SPECIFICITATE CRESCUTE  TIMPUL SCURT DE OBŢINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE;  POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE ÎN DIVIZIUNE SAU INTERFAZĂ  REZOLUŢIE MARE (sonde de până la 40 kb) DEZAVANTAJELE TEHNICII FISH  COSTUL RIDICAT AL SONDELOR ŞI REACTIVILOR;  COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITE  GRADUL ÎNALT DE TEHNICITATE