Técnicas de detección de bacterias recombinantes

Genes reporteros atreves del cribado o detección azul/blanco

• Técnica rápida y eficaz para la identificación de bacterias recombinantes basada en el operón lac de E. coli.
• La presencia de lactosa en el entorno activa el gen lacZ, produciendo la enzima β-galactosidasa que metaboliza la lactosa.
• La técnica utiliza el sustrato cromogénico X-gal y el inductor IPTG para seleccionar clones que contienen ADN recombinante.

Funcionamiento del cribado azul/blanco

• X-gal se hidroliza en presencia de β-galactosidasa, produciendo un pigmento azul insoluble.
• Las colonias formadas por células no recombinantes aparecen de color azul, mientras que las recombinantes aparecen de color blanco.
• Las colonias recombinantes deseadas se pueden recoger y cultivar fácilmente.

Características de los primers o cebadores

• Especificidad del inserto: cebadores que se hibridan con secuencias específicas en el inserto.
• Diseño de cebadores en secuencia de vectores: cebadores diseñados en las regiones flanqueadas del inserto.
• Orientación de los cebadores: orientación de los cebadores para localizar el fragmento.

PCR de colonias

• Método para seleccionar rápidamente colonias de levaduras o bacterias que han crecido en medios selectivos después de un paso de transformación.
• Verifica que la construcción genética deseada esté presente o amplifica una parte de la construcción.

Electroforesis de proteínas SDS-PAGE

• Basado en la migración de moléculas a través de un sistema de mallas generadas por matrices químicas (poliacrilamida).
• Permite separar proteínas en función de su tamaño molecular cuando se someten a una corriente eléctrica.
• Puede observar las proteínas en dos tipos de condiciones: nativas o desnaturalizadas.

Poliacrilamida

• Homopolímero de acrilamida soluble en agua.
• No es un compuesto con gran toxicidad aguda, pero es cancerígeno, teratogénico y neurotóxico en exposición continua.
• La polimerización reduce el efecto tóxico en un 95% al perdurar los grupos vinilo altamente reactivos.

Gel de electroforesis

• Se requieren dos fases dentro de un mismo gel: gel concentrador y gel separador.
• El gel concentrador evita la dispersión de proteínas y las alinea en una banda delgada.
• Se utiliza un tampón que contiene glicina y TRIS-HCl para la conducción eléctrica y la separación de proteínas.