Técnicas de ADN Recombinantes

Ingeniería Genética

• La ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten manipular el genoma de un organismo, permitiendo cambios en un solo par de bases, eliminación de regiones de ADN, adición de nuevos segmentos de ADN, etc.
• La primera producción de moléculas de ADN recombinante se produjo a principios de los años 1970 utilizando enzimas de restricción.

Técnicas de ADN Recombinante

• Localización de genes y sus funciones utilizando bases de datos, artículos de investigación, etc.
• Secuenciación para determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica.
• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para localizar secuencias de ADN específicas y/o modificarlas.
• Enzimas de restricción para preparar fragmentos de ADN para unirse con otros.
• Clonación para generar millones de copias idénticas de un fragmento de ADN.
• Detección y purificación de ADN recombinante.

Enzimas de Restricción

• Son proteínas aisladas de bacterias que fragmentan las secuencias del ADN en un sitio específico, generando fragmentos de ADN con extremos de secuencias conocidas.

Clonación

• Es el aislamiento del ADN a partir de diferentes especies, incorporando una secuencia del gen a un vector para su propagación.
• Un fragmento de ADN se introduce a un elemento genético replicable (plásmido o vector) en una bacteria, generando millones de copias idénticas.

Introducción de un Plásmido en una Bacteria

• Las células procarióticas carecen de núcleos unidos a membranas, por lo que el ADN puede integrarse dentro de un genoma bacteriano más fácilmente.
• La competencia natural es la capacidad genéticamente determinada de los procariotas para tomar ADN del medio ambiente e insertarlo en su propio genoma mediante recombinación homóloga.

Captación y Transformación de ADN por Bacterias Competentes

• Iniciación: El ADN se une a la superficie celular.
• Uptake/Captación: El ADN pasa a través del poro de secretina tipo II.
• Translocación: Una cadena se transloca intacta al citoplasma mediante la proteína Rec2/ComEC; el otro está degradado.
• Recombinación: La nueva cadena se recombina con una secuencia homóloga en el cromosoma, desplazando a la cadena residente.

Células Competentes

• Células que se vuelven competentes mediante manipulación eléctrica o química para utilizarlas en la clonación.
• Células químicas competentes se crean mediante tratamiento con sal seguido de una etapa de choque térmico.
• Los agentes químicos utilizados son CaCl2 y MgCl2, que neutralizan las cargas negativas de la bicapa de fosfolípidos y del ADN.