Saccharomyces cerevisiae en Investigación Biológica

• Las siguientes notas de estudio cubren los temas de Biología Celular, Bloque 3: Regulación Celular, Unidad Didáctica 11: Ciclo celular.

Guion de la Unidad Didáctica 11

• Abarca el descubrimiento de los factores de división celular en levaduras.
• Trata sobre el ciclo celular eucariota.
• Abarca los reguladores de la progresión del ciclo celular.
• Explica los acontecimientos de la fase M.

Introducción a las Levaduras

• Hongo unicelular, con una pared celular rígida, relativamente inmóviles.
• Son los eucariotas más simples utilizados para la elaboración del pan y de la cerveza.
• Han proporcionado un modelo crucial para el estudio de aspectos fundamentales de la biología celular eucariota.
• Se clasifican en dos tipos principales: Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe.
• La especie S. pombe se llama así por la cerveza africana de donde fue aislada, y tiene forma de bastón.
• Se pueden dividir por gemación y fisión.
• La célula de levadura exhibe las características típicas de las células eucariotas.

Genoma y Características de las Levaduras

• Genoma: 12 millones de pares de bases (pb) de ADN y contiene alrededor de 6000 genes.
• Su ADN genómico está organizado en 16 cromosomas lineales.
• Su citoplasma contiene citoesqueleto y orgánulos subcelulares (mitocondrias, pero no cloroplastos).
• Fueron los primeros organismos eucariotas a los que se secuenció el genoma completo.
• Se dividen cada 2 horas y pueden crecer fácilmente dando lugar a colonias a partir de una sola célula.
• Las levaduras mutantes han sido importantes para entender procesos fundamentales en eucariotas como la replicación de ADN, transcripción, etc.
• Entre 2001 y 2013 se otorgaron cuatro premios Nobel por descubrimientos relacionados a la investigación con levaduras.

Científicos Clave en el Estudio del Ciclo Celular

• Leland Hartwell usó la levadura Saccharomyces cerevisiae para estudios genéticos del ciclo celular. En experimentos aisló células de levadura con genes mutados que controlaban el ciclo celular.
• Paul Nurse identificó el gen cdc2, regulador clave del ciclo celular, en la levadura Schizosaccharomyces pombe y demostró que tiene la misma función que el gen CDC28 en levaduras.
• Tim Hunt descubrió las ciclinas, proteínas que se unen a las moléculas CDK y regulan su actividad, siendo degradadas durante la mitosis.

El Premio Nobel y el Tráfico Vesicular

• Randy W. Schekman descubrió genes que codifican proteínas reguladoras del tráfico vesicular, comparando células de levadura normales y mutadas para identificar genes que controlan el transporte a diferentes compartimentos celulares.

Mutantes y Genes del Ciclo Celular

• El crecimiento a temperatura permisiva muestra gemaciones de todos los tamaños.
• El crecimiento a temperatura restrictiva muestra células que han finalizado el primer ciclo celular y se detienen en el segundo.
• Los mutantes crecen normalmente a temperatura permisiva.
• Los mutantes pierden la función génica a temperaturas restrictivas.
• Se han identificado más de 70 genes del ciclo celular a partir de mutantes sensibles a la temperatura.

Regulación del Ciclo Celular y Progresión

• La división celular debe ser finamente regulada y coordinada con el crecimiento celular y la replicación del ADN.
• La progresión a lo largo del ciclo celular está controlada por proteínas quinasas, cuya función se ha conservado desde las levaduras hasta los mamíferos.
• En eucariotas superiores, la división celular está además controlada por factores de crecimiento que regulan la proliferación celular.

Citometría de Flujo

• La citometría de flujo es una técnica que analiza el número, tamaño y forma de una suspensión celular, cuantificando células de determinadas poblaciones y aislándolas.
• Es útil para estudiar poblaciones normales y patológicas de células sanguíneas y de médula ósea.
• El citómetro tiene un sistema fluídico para el transporte de muestras, un sistema óptico de iluminación con láser y un detector electrónico que convierte la luz en señal digital.
• Según van pasando las células, el rayo impacta causando una distorsión registrada por el detector, que cuantifica el número de eventos y analiza la forma y complejidad interna de la célula.
• La dispersión frontal (FSC) se relaciona con el tamaño celular, y la dispersión lateral u ortogonal (SSC) con la complejidad interna, donde células granulares o complejas producirán un mayor SSC.
• Se puede marcar una población celular con un fluorocromo como el yoduro de propidio, que absorbe a 540-580 nm y emite a 600-660 nm.

Fases del Ciclo Celular y su Determinación

• Las células en distintas fases del ciclo celular se diferencian por su cantidad de ADN.
• Las células en fase G1 son diploides (2n) donde n es el contenido de ADN haploide.
• Durante la fase S, la célula pasa de 2n a 4n debido a la replicación del ADN.
• En las fases G2 y M, la cantidad de ADN es 4n, reduciéndose a 2n tras la citocinesis.
• La progresión a través del ciclo se regula por señales extracelulares e internas que supervisan los procesos.
• Los puntos de control en el ciclo celular previenen la entrada a la siguiente fase hasta que los eventos de la fase anterior se hayan completado.

Reguladores de la Progresión del Ciclo Celular

• El ciclo celular eucariota está controlado por proteínas quinasas.
• El factor promotor de la mitosis o factor promotor de la maduración (MPF) es un dímero de ciclina B y proteína quinasa Cdk1, siendo la ciclina B necesaria para la actividad catalítica de Cdk1.
• Una vez activado el complejo CDK1-ciclina B, la Cdk1 fosforila varias proteínas diana que inician la fase M.
• La actividad de Cdk1 también provoca la degradación de la ciclina B por proteólisis mediada por una ubiquitina.
• La ubiquitilación de la ciclina B está mediada por la ubiquitina ligasa llamada complejo APC/C, activada por fosforilación por la Cdk1/ciclina B.

Familias de Ciclinas y Quinasas Dependientes de Ciclinas

• Las uniones entre las ciclinas y las Cdk son altamente específicas.
• Las Cdks son enzimas conocidas como quinasas dependientes de ciclina que controlan la actividad de otras proteínas mediante fosforilación.

Mecanismos de Regulación de las Cdks y su Inhibición

• La regulación de Cdks implica la asociación con ciclinas y la fosforilación activadora.
• Existen inhibidores de Cdks (CKI) como los de la familia Cip/Kip (p21, p27, p57) y la familia Ink4 (p15, p16, p18, p19).
• Las Cdks están relacionadas con el daño de ADN, esto induce p53, lo que causa una inhibición de la Cdk.

Factores de Crecimiento y Regulación de las Cdks de G1

• La síntesis de la ciclina D se da tras estímulos de factores de crecimiento, como resultado de señalización a través de Ras/Raf/MEK/ERK.
• En ese caso, la ciclina D se sigue sintetizando mientras los factores de crecimiento están presentes.

Papel de Rb y E2F en la Regulación del Ciclo Celular

• Rb, en estado poco fosforilado, se une a E2F, reprimiendo la transcripción.
• La fosforilación de Rb por los complejos Cdk4,6/ciclina D provoca la disociación de E2F.
• La actividad de las Cdks evita que las proteínas MCM vuelvan a asociarse a los ORC durante esas fases, y evita que los complejos pre-replicación puedan volver a formarse hasta G1.

Progreso a través del Punto de Restricción y Entrada a la Fase S

• En la fase G1 temprana, los complejos Cdk2/ciclina E se encuentran inhibidos por p27.
• El paso por el punto de restricción induce la síntesis de la ciclina E a través de la activación de E2F, además señalizando el factor de crecimiento inhibe la síntesis de p27.
• Cuando Cdk2 se activa, fosforila p27, provocando una activación plena de Cdk2/ciclina E y la entrada en la fase S.
• La ubiquitina ligasa APC/C también es inhibida por Cdk2, con lo que los niveles elevados de ciclina se mantienen a través de S y G2.

Fase S y Regulación de la Replicación del ADN

• Los complejos Cdk2/ciclina E activan la síntesis de ADN en los orígenes de replicación, constituido por el complejo ORC.
• La replicación del ADN se inicia mediante las proteínas MCM helicasa, reguladas por los complejos Cdk/ciclina.
• La replicación del ADN se inicia por medio de de las Cdk2/ciclina E.
• La alta actividad de las Cdks evita que las proteínas MCM vuelvan a asociarse a los ORC durante las fases S, G2 y M, con lo que los complejos de pre-replicación solo pueden volverse a formar durante G1.

Puntos de Control de Lesiones del ADN

• Las proteínas quinasas ATR y ATM se activan en complejos proteicos reconociendo el ADN dañado.

• ATR y ATM fosforilan y activan las proteínas quinasas de los puntos de control Chk1 y Chk2 respectivamente.

• Chk1 y Chk2 fosforilan e inhiben a la proteína fosfatasa Cdc25, inhibiendo a la detención en G1, S y G2.

Papel de p53 en la Detención del Ciclo Celular

• ATM y Chk2 fosforilan y estabilizan p53 ante lesiones, resultando en incrementos rápidos de los niveles de p53.
• P53 activa la transcripción del inhibidor del Cdk p21, inhibiendo los complejos las complejos de Cdk2/ciclina E o ciclina A y produciendo la detención del ciclo celular.

Acontecimientos de la Fase M

• La fase M consta de cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase.

Etapas de la Mitosis

• Profase: Los cromosomas se condensan y los centrosomas se desplazan a los lados opuestos del núcleo.
• Prometafase: los cromosomas se agitan hacia delante y hacia atrás entre los centrosomas y el centro de la célula, para finalmente quedar anclados en la zona media del huso (metafase).
• Anafase: las cromátidas hermanas se separan y migran a los polos opuestos del huso.
• Telofase: se reconstituyen las envueltas nucleares y los cromosomas se descondensan, finalizando con la citocinesis.
• La fase de la mitosis está regulada por proteínas quinasas como las Aurora (A y B) y las tipo Polo.
• Cdk1/ciclina B actúan como los reguladores principales de la transición a la fase M, tanto a través de la activación de otras proteínas quinasas mitóticas, como por fosforilación directa de proteínas estructurales implicadas en la reorganización celular.

Acción de las Cohesinas y Condensinas

• Miembros de la familia SMC involucrados en la organización cromosómica eucariota.
• Las cohesinas se unen al ADN durante la fase S y mantienen la unión entre cromátidas hermanas después de la replicación.
• En la fase M, las condensinas son fosforiladas por las cinasas Aurora B y tipo Polo.
• Las cohesinas son reemplazadas por condensinas a lo largo, y las condensinas provocan la condensación de la cromatina.

Degradación de la Envuelta Nuclear

• Cdk1/ciclina B fosforila las laminas nucleares, además de las proteínas de los poros nucleares y de la membrana nuclear interna.
• La fosforilación causa que los filamentos que forman la lámina nuclear se disocien en dímeros libres de laminina.
• Las proteínas integrales de la membrana nuclear son absorbidas después por el retículo endoplásmico.

Reorganización del Aparato de Golgi

• El aparato de Golgi se fragmenta en pequeñas vesículas durante la mitosis, que pueden absorberse por el retículo endoplásmico o distribuirse directamente a las células hijas durante la citocinesis.
• La descomposición está mediada por la fosforilación de proteínas de la matriz del Golgi que llevan a cabo Cdk1 y las cinasas tipo Polo.

Reorganización del Citoesqueleto

• Al inicio de la profase, los centrosomas se separan y desplazan hacia los extremos opuestos del núcleo y pasan por un proceso de maduración.
• La maduración del centrosoma, la separación y el ensamblaje del huso están producidas por las cinasas Aurora A y tipo Polo situadas en los centrosomas.
• La rotura de la envuelta nuclear permite que algunos microtúbulos del huso unirse a los cinetócoros de los cromosomas, iniciando el movimiento del ciclo celular que caracteriza la prometafase.

El Punto de Control del Ensamblaje del Huso y la Citocinesis

• La progresión hacia la anafase está mediada por la activación de la APC/C ubiquitina ligasa.
• APC/C ubiquitiliza la ciclina B y securina.
• Separasa degrada una subunidad de la cohesina, rompiendo el enlace entre cromátidas hermanas iniciando la anafase.
• Tras completarse la mitosis, se produce la citocinesis, durante la anafase tardía.
• Esto se da por una contracción de un anillo de filamentos de actina y miosina, estrangulando a la célula, y dando lugar a dos células hijas.
• La formación de este anillo está activada por las cinasas Aurora y tipo Polo.

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