Biología Celular - Tema 11 PDF

BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BLOQUE 3: REGULACIÓN CELULAR Unidad Didáctica 11. Ciclo celular. BLOQUE 2: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS CÉLULAS 1 Unidad Didáctica 11 Guion de...

BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BLOQUE 3: REGULACIÓN CELULAR Unidad Didáctica 11. Ciclo celular. BLOQUE 2: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS CÉLULAS 1 Unidad Didáctica 11 Guion de la Unidad Didáctica 11 11.1 Descubrimiento de los factores de división celular. Leveaduras. 11.2 Ciclo celular eucariota. 11.3 Reguladores de la progresión del ciclo celular. 11.4 Acontecimientos de la fase M. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 2 Unidad Didáctica 11  Hongo unicelular, con una pared celular rígida, relativamente inmóviles. Son los eucariotas más simples utilizados para la elaboración del pan y de la cerveza. Las levaduras han proporcionado un modelo crucial para el estudio de muchos de los aspectos fundamentales de la biología celular eucariota. Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe. S. pombe se denomina así por la cerveza africana de donde fue aislada. Tiene forma de bastón. Se pueden dividir por gemación y fisión. La célula de levadura exhibe las características típicas de las células eucariotas. Saccharomyces pombe BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 3 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 4 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 5 Unidad Didáctica 1  Genoma: 12 millones de pb de ADN y contiene alrededor de 6000 genes. Su ADN genómico está organizado en 16 cromosomas lineales, y su citoplasma contiene un citoesqueleto y orgánulos subcelulares que incluyen mitocondrias pero no cloroplastos. Las levaduras fueron los primeros organismos eucariotas a los que se le secuenció el genoma completo. Se dividen cada 2 h y pueden crecer fácilmente dando lugar a colonias a partir de una sola célula. Las levaduras mutantes han resultado importantes para la compresión de muchos procesos fundamentales en eucariotas, incluyendo la replicación del ADN, transcripción, procesamiento del ARN, ensamblaje de proteínas, y regulación de la división celular. Entre 2001 y 2013, se han otorgado cuatro premios Nobel por descubrimientos relacionados con la investigación con levaduras. Saccharomyces cerevisiae BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 6 Unidad Didáctica 1  CDKs Cyclin Dependent kinases BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 7 Unidad Didáctica 1  CDKs Cyclin Dependent kinases BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 8 Unidad Didáctica 1 Cyclins BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 9 Unidad Didáctica 1 Vesicles trafficking BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 10 Unidad Didáctica 1  El crecimiento a temperatura El crecimiento a temperatura permisiva muestra restrictiva muestran a las células gemaciones de todos los que han finalizado el primer ciclo tamaños. celular y se detienen en el segundo Los mutantes crecen normalmente a temperatura permisiva Los mutantes pierden la función génica a temperaturas restrictivas Se han identificado miles de mutantes del ciclo celular Saccharomyces Genome Deletion Project web page: http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 11 Unidad Didáctica 1  Las CDK y las ciclinas humanas pueden reemplazar la función de las proteínas de levadura alteradas. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 12 Unidad Didáctica 1  > 70 genes de ciclo celular se han identificado a partir de mutantes sensibles a temperatura BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 13 Unidad Didáctica 1  La división de las células ha de ser finamente regulada y coordinada con el crecimiento celular y la replicación del ADN. La progresión a lo largo del ciclo celular está controlada por una serie de proteínas quinasas cuya función se ha conservado desde las levaduras hasta los mamíferos. En eucariotas superiores, la división celular está controlada por factores de crecimiento que controlan la proliferación celular, permitiendo coordinar la división de las células individuales con las necesidades del organismo como un todo. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 14 Unidad Didáctica 11 Ciclo celular Ciclo celular en eucariotas BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 15 Unidad Didáctica 11  Los procesos del ciclo celular están altamente coordinados Procesos del ciclo celular: ✓ Crecimiento celular ✓ Replicación del ADN ✓ Distribución de los cromosomas duplicados a las células hijas ✓ División celular El ciclo celular de una célula eucariota en cultivo dura 24h aproximadamente. (1h) (23h) A microscopio óptico se aprecian dos fases diferenciadas: interfase y mitosis. La parte más llamativa del ciclo corresponde con 2 (4h) la separación de los cromosomas y termina en la división celular o citocinesis. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 16 Unidad Didáctica 11  Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular. También sirve para cuantificar el número de células de determinadas poblaciones celulares marcadas específicamente con sustancias fluorescentes y para aislar poblaciones celulares. Especialmente útil para el estudio de poblaciones normales y patológicas de células sanguíneas y de médula ósea. El citómetro tiene los siguientes componentes: ✓ Sistema fluídico de transporte de muestras. ✓ Sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser (argón). ✓ Detector electrónico, que convierte la luz en señal digital. Las células pasan en un capilar muy fino de forma que pasan de una en una. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 17 Unidad Didáctica 11 Citometría de flujo Según van pasando las células, el rayo impacta sobre ellas y se produce una distorsión del rayo, que es la que es registrada por el detector. Este sistema cuantifica el número de eventos (células) que son impactados por el láser, pero también es capaz de analizar la forma y la complejidad interna de la célula. El grado de alteración que se produce cuando el láser atraviesa los límites celulares da lugar a una dispersión frontal (FSC, forward scatter) que se relaciona con el tamaño de la célula (a mayor FSC, mayor tamaño celular). La complejidad interna de las células produce una dispersión lateral u ortogonal (SSC, side scatter). Las células granulares o complejas producirán un mayor SSC. 18 Citometría de flujo BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 19 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo Otra posibilidad es marcar una población celular específicamente con un fluorocromo. Un fluorocromo muy utilizado es el yoduro de propidio, que absorbe a 540 a 580 nm y emite a 600 a 660 nm. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 20 Unidad Didáctica 1  Las células en estadios diferentes del ciclo celular se diferencian por su cantidad en ADN Las células en G1 son diploides (2n), donde n designa el contenido de ADN haploide en el genoma. Durante la fase S, mediante la replicación del ADN, la célula pasa de 2n a 4n. En la fase G2 y M la cantidad de ADN en la célula es de 4n, y se reduce a 2n tras la citocinesis. La cantidad de ADN celular se puede determinar experimentalmente incubando las células con una tinción fluorescente que se una al ADN (ioduro de propidio) y cuantificando su intensidad mediante citometría de flujo. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 21 Unidad Didáctica 11  La progresión de las células a través del ciclo de división celular se regula por señales extracelulares del medio, así como por señales internas que supervisan y coordinan los diversos procesos que tienen lugar durante las diferentes fases del ciclo celular Levaduras Células animales BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 22 Unidad Didáctica 11  La progresión de las células a través del ciclo de división celular se regula por señales extracelulares del medio, así como por señales internas que supervisan y coordinan los diversos procesos que tienen lugar durante las diferentes fases del ciclo celular Punto de restricción FACTORES DE CRECIMIENTO BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 23 Unidad Didáctica 11 Los sucesos que tienen lugar durante las diferentes etapas del ciclo celular han de coordinarse entre sí de tal manera que ocurran en el orden adecuado En la mayoría de las células, esta coordinación de las fases del ciclo celular depende de un sistema de puntos de control, que previenen la entrada en la siguiente fase del ciclo celular hasta que los eventos de la fase precedente hayan sido completados. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 24 Unidad Didáctica 11 Los sucesos que tienen lugar durante las diferentes etapas del ciclo celular han de coordinarse entre sí de tal manera que ocurran en el orden adecuado Maquinaria de CONTROL DE replicación del DNA LA METAFASE ¿Se ha producido daño en Maquinaria de la el DNA? mitosis ¿Se ha replicado todo el DNA? Entorno ¿Es el entorno favorable? ¿Están todos los cromosomas ¿Se ha producido daño en Crecimiento ¿Tiene la célula el alineados en el huso? el DNA? celular tamaño adecuado? ¡COMENZAR ¡FINALIZAR CONTROL DE MITOSIS! MITOSIS! LA FASE G2 CONTROL DE CONTROL DE LA FASE S LA FASE G1 ¡CONTINUAR LA SÍNTESIS ¡ENTRAR EN DE DNA! CICLO! ¿Tiene la célula el tamaño Crecimiento ¿Se ha producido daño en adecuado? celular el DNA? ¿Es el entorno favorable? Entorno ¿Se ha producido daño en BLOQUE III: REGULACIÓN CELULARel DNA? 25 Unidad Didáctica 11 Ciclo celular Reguladores de la progresión del ciclo celular BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 26 Unidad Didáctica 11 El ciclo celular de todos los eucariotas está controlado por un conjunto de proteínas quinasas, conservadas entre los distintos organismos, y que son las responsables de inducir el paso de un estado del ciclo celular al otro Factor promotor de la mitosis o factor promotor de la maduración (MPF). Dimero constituido por la ciclina B y por la proteína quinasa Cdk1. La ciclina B es necesaria para la actividad catalítica de Cdk1. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 27 Unidad Didáctica 11  El complejo Cdk1-ciclina B tiene diferentes niveles de regulación Una vez activado el complejo CDK1-ciclina B, la Cdk1 fosforila varias proteínas diana que inician la fase M. La actividad de Cdk1 también provoca la degradación de la ciclina B, que se produce por una proteólisis mediada por una ubiquitina. La ubiquitilación de la ciclina B está mediada por una ubiquitina ligasa denominada complejo de promoción de anafase/ciclosoma (APC/C) que es activada como consecuencia de la fosforilación por la Cdk1/ciclina B. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 28 Unidad Didáctica 11  Familias de ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas La uniones entre las ciclinas y las Cdk son altamente específicas. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 29 Unidad Didáctica 11  Familias de ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas ** Cdk1 sería la única Cdk imprescindible en las células de mamífero (y de lavadura) que puede sustituir a las demás en caso de estar ausentes BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 30 Unidad Didáctica 11 Mecanismos de regulación de Cdks BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 31 Unidad Didáctica 11 Mecanismos de regulación de Cdks BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 32 Unidad Didáctica 11  Factores de crecimiento y regulación de las Cdks de G1 La síntesis de la ciclina D se induce en respuesta a la estimulación por factores de crecimiento, como resultado de la señalización a través de la vía Ras/Raf/MEK/ERK, y la ciclina D sigue siendo sintetizada mientras los factores de crecimiento están presentes. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 33 Unidad Didáctica 11  Regulación del ciclo celular por Rb y E2F En su estado poco fosforilado, Rb se une a miembros de la familia E2F reprimiendo la transcripción de los genes regulados por E2F. La fosforilación de Rb por los complejos Cdk4,6/ciclinaD provoca su disociación de E2F en la fase G1 avanzada. E2F activa la expresión de sus genes diana (incluida la ciclina E), que codifican proteínas necesarias para la continuación del ciclo celular. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 34 Unidad Didáctica 11  La progresión a lo largo del punto de restricción y la entrada a la fase S está mediada por la activación de complejos Cdk2/ciclina E En la fase G1 temprana, los complejos Cdk2/ciclina E se encuentran inhibidos por el inhibidor de Cdk p27. El paso por el punto de restricción induce la síntesis de la ciclina E vía la activación de E2F. Además, la señalización del factor de crecimiento inhibe la síntesis de p27. Cuando Cdk2 se activa, fosforila p27 y lo marca para ser degradado, dando lugar a la activación plena de los complejos Cdk2/ciclina E y a la entrada en la fase S. La ubiquitina ligasa APC/C también es inhibida por Cdk2, con lo que los niveles elevados de ciclina se mantienen a través de S y G2. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 35 Unidad Didáctica 11  Fase S y regulación de la replicación del ADN Los complejos Cdk2/ciclina E inician la fase S activando la síntesis de ADN en los orígenes de replicación, constituido por el complejo ORC (complejo de reconocimiento del origen) Las células de mamífero utilizan miles de orígenes para replicar el ADN, y todos estos orígenes deben estar minuciosamente controlados para que cada segmento del genoma se copie una sola vez durante la fase S. La replicación del ADN se inicia mediante la actividad de las proteínas MCM helicasa, que son reguladas por los complejos Cdk/ciclina en diferentes estadios del ciclo celular. (MCM: Mantenimiento de mini-cromosomas). Las proteínas MCM helicasa se unen al complejo ORC constituyendo el complejo de pre-replicación. La replicación del ADN se inicia en la fase S por medio de de las Cdk2/ciclina E, que activan varias proteínas de activación reclutadas en el complejo de pre-replicación, y la proteína quinasa DDK. DDK y las proteínas activadas por Cdk2/ciclina E activan a las proteínas MCM helicasa. La activación de MCM inicia la activación de la replicación del ADN y las proteínas MCM se alejan del origen de replicación con la horquilla de replicación. La alta actividad de las Cdks evita que las proteínas MCM vuelvan a asociarse a los ORC durante la fases S, G2 y M, con lo que los complejos de pre-replicación solo pueden volverse a formar durante G1. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 36 Unidad Didáctica 11  Puntos de control de lesiones del ADN Las proteínas quinasas ATR y ATM son activadas en complejos de proteínas que reconocen el ADN dañado. ATR y ATM fosforilan y activan las proteínas quinasas de los puntos de control Chk1 y Chk2 respectivamente. Chk1 y Chk2 fosforilan e inhiben a la proteína fosfatasa Cdc25, que son necesarias para activar Cdk1 y Cdk2, de modo que su inhibición da lugar a la detención en los puntos de control de lesiones al ADN en G1, S y G2. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 37 Unidad Didáctica 11  Papel de p53 en la detención del ciclo celular Rotura de doble hebra La fosforilación por parte de ATM y Chk2 estabiliza p53, resultando en incrementos rápidos de los niveles de p53 en respuesta a las lesiones de ADN. P53 activa la transcripción del inhibidor de Cdk p21, dando lugar a la inhibición de los complejos de Cdk2/ciclina E o ciclina A y a la detención del ciclo celular. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 38 Unidad Didáctica 11 Papel de p53 en la detención del ciclo celular BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 39 Unidad Didáctica 11 Ciclo celular Acontecimientos de la Fase M BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 40 Unidad Didáctica 11  Etapas de la mitosis en la célula animal Se divide en 4 etapas: profase, metafase, anafase y telofase. ✓ Profase: los cromosomas se condensan y los centrosomas se desplazan a los lados opuestos del núcleo, comenzando la formación del huso mitótico. La ruptura de la envuelta nuclear permite a los microtúbulos del huso anclarse a los cinetócoros de los cromosomas. ✓ Pro-metafase: los cromosomas se agitan hacia delante y hacia atrás entre los centrosomas y el centro de la célula, para finalmente quedar anclados en la zona media del huso (metafase). ✓ Anafase: las cromátidas hermanas se separan y migran a los polos opuestos del huso. ✓ Telofase: se reconstituyen las envueltas nucleares y los cromosomas se descondensan. Al final de esta fase se da la citocinesis que da lugar a dos células hijas. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 41 Unidad Didáctica 11 Etapas de la mitosis en la célula animal BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 42 Unidad Didáctica 11  La fase de la mitosis también está regulada por proteínas quinasas El complejo Cdk1/ciclina B actúan como los reguladores principales de la transición a la fase M, tanto a través de la activación de otras proteínas quinasas mitóticas, como por fosforilación directa de proteínas estructurales que participan en la reorganización celular. Entre las proteínas quinasa activadas se encuentran las cinasas Aurora (Aurora A y Aurora B) y las cinasas tipo Polo. Las cinasas Aurora y las tipo Polo actúan con Cdk1 en forma de bucle de retroalimentación positiva. Esta activación induce varios cambios en el núcleo y en el citoplasma durante la mitosis mediante la fosforilación de proteínas como condensinas, cohesinas, laminas de la envuelta nuclear, proteínas de matriz del Golgi, y proteínas asociadas a centrosomas, cinetocoros y microtúbulos. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 43 Unidad Didáctica 11  Acción de las cohesinas y condensinas Las cohesinas y las condensinas son miembros de la familia SMC (mantenimiento estructural de la cromatina o structural maintenence of chromatine) que juegan un papel importante en la organización de los cromosomas eucariotas. Las cohesinas se unen al ADN durante la fase S y mantienen la unión entre cromátidas hermanas después de la replicación del ADN en S y en G2. Cuando la célula pasa a la fase M, las condensinas son fosforiladas por las cinasas Aurora B y tipo Polo. Las cohesinas son sustituídas por condensidas a lo largo de la mayor parte del cromosoma, conservándose solo en el centrómero. Las condensinas provocan la condensación de la cromatina. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 44 Unidad Didáctica 11  Degradación de la envuelta nuclear Cdk1/ciclina B fosforila las laminas nucleares además de las proteínas de los poros nucleares y de la membrana nuclear interna. La fosforilación de las láminas causa que los filamentos que forman la lámina nuclear se disocien en dímeros libres de laminina. Las proteínas integrales de la membrana nuclear son absorbidas a continuación por el retículo endoplásmico, que permanece como una red intacta y se distribuye a las células hijas durante la mitosis. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 45 Unidad Didáctica 11  Reorganización del Aparato de Golgi El aparato de Golgi se fragmenta en pequeñas vesículas en la mitosis que pueden absorberse por el retículo endoplásmico o distribuirse directamente a las células hijas durante la citocinesis. La descomposición del aparato de Golgi en vesículas está mediada por la fosforilación de múltiples proteínas de la matriz del Golgi que llevan a cabo Cdk1 y las cinasas tipo Polo. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 46 Unidad Didáctica 11  Reorganización del citoesqueleto Al inicio de la profase, los centrosomas, duplicados en la fase S, se separan y se desplazan hacia los extremos opuestos del núcleo. Antes de separarse, pasan por un proceso de maduración en el que se alargan y reclutan -tubulina y otras proteínas necesarias para formar el huso. La maduración del centrosoma, la separación y el ensamblaje del huso están producidas por las cinasas Aurora A y tipo Polo situadas en los centrosomas. La rotura de la envuelta nuclear permite a algunos microtúbulos del huso unirse a los cinetócoros de los cromosomas y empieza el movimiento de los cromosomas que caracteriza la prometafase. Entre las proteínas que se reúnen en el cinetocoro se incluyen la cinasa Aurora B. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 47 Unidad Didáctica 11  Punto de control del ensamblaje del uso La progresión hacia la anafase está mediada por la activación de la APC/C ubiquitina ligasa. Los cinetocoros libres dan lugar al ensamblaje de una serie de proteínas (el complejo del punto de control mitótico, MCC) que inhiben la APC/C. Una vez que todos los cromosomas se han alineado en el huso, el complejo inhibidor ya no se forma y se activa el APC/C. APC/C ubiquitiliza la ciclina B, dando lugar a su degradación y a la inactivación de Cdk1. Adicionalmente, APC/C ubiquitiliza a la securina, dando lugar a la activación de la separasa. La separasa degrada una subunidad de la cohesina, rompiendo el enlace entre cromátidas hermanas e iniciando El complejo promotor de la anafase (también llamado el la anafase. ciclosoma o APC / C) es una ubiquitina ligasa E3 que marca las Una vez la célula ha llegado a la anafase, el APC/C también proteínas del ciclo celular objetivo para la degradación por el desencadena la degradación de las cinasas Aurora y tipo Polo proteasoma 26S. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 48 Unidad Didáctica 11  Citocinesis Tras la conclusión de la mitosis se produce la citocinesis, dando lugar a dos células hijas. La citocinesis suele producirse durante la anafase tardía y se desencadena por la inactivación de Cdk1. La citocinesis se produce por la contracción de un anillo de filamentos de actina y miosina, y estrangula a la célula dividiéndola en dos. La formación de este anillo está activada por las cinasas Aurora y tipo Polo. BLOQUE III: REGULACIÓN CELULAR 49 Unidad Didáctica 11