Restriktionsenzyme Typ II Quiz

Gentechnik

• Gentechnik ist die Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen.
• Die "rekombinante DNA-Technologie" ermöglicht die gezielte Re- oder Neukombination der Erbinformation.
• Gentechnik umfasst die Herstellung von Proteinen für medizinische und technische Anwendungen.
• Sie umfasst auch die Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren sowie Gendiagnostik und somatische Gentherapie.
• CRISPR/Cas9 ist seit 2018 ebenfalls ein Teil der Gentechnik.

CRISPR/Cas9

• CRISPR/Cas9-Systeme sind weit verbreitete Immunsysteme, die Bakterien und Archaeen vor Phagen und Plasmiden schützen.
• Sie nutzen wiederholt vorkommende kurze Palindromsequenzen und Zwischenabschnitte, um fremde Nukleinsäuren sequenzspezifisch zu deaktivieren.
• Die crRNA-Reifung ist ein wichtiger Schritt in der CRISPR-Aktivierung.
• TracrRNA vermittelt die crRNA-Reifung durch die Aktivität der konservierten RNase III und des CRISPR-assoziierten Proteins.

CRISPR/Cas9: Erworbene Immunität von Bakterien

• Spacer werden aus fremdem genetischem Material gewonnen und in den CRISPR-Array eingefügt.
• Die prä-crRNA wird verarbeitet, um mature crRNA zu erzeugen.
• Fremdes genetisches Material wird gespalten und inaktiviert.
• CRISPR/Cas-Systeme in Streptococcus pyogenes zielen auf lysogene Phagen ab.

CRISPR/Cas9: Gezieltes Genome Editing in eukaryotischen Zellen

• Das CRISPR/Cas9-System wird verwendet, um Genome in eukaryotischen Zellen zu bearbeiten.
• Guide RNA bindet an die Ziel-DNA.
• Cas9 schneidet die Ziel-DNA
• Der Eingriff in die Keimbahn ist seit 2018 verboten.

Keine Gentechnik

• Klassische Züchtungsverfahren
• Extrakorporale Befruchtung
• Embryotransfer
• Herstellung von Pflanzenhybriden
• Herstellung von tierischen Hybriden

Die Werkzeuge der Gentechnologie

• Spender-DNA (z.B. ein Gen oder eine Nukleotidsequenz)
• Vektor- oder Plasmid-DNA (Genfähren)
• Restriktionsenzyme (genetische Scheren)
• Ligasen (genetische Kleber)
• DNA-Transfermethoden

Klonieren

• DNA-Fragment wird in ein Plasmid eingefügt.
• Das rekombinierte Plasmid wird in eine Wirtszelle eingeschleust.
• Die Wirtszelle repliziert das Plasmid und erzeugt identische Kopien/Klone des DNA-Fragments.

Mikroorganismen in der Gentechnik

• Ideale Eigenschaften von Mikroorganismen für die wissenschaftliche Forschung in der Molekularbiologie: klein, schnelle Vermehrung, manipulierbares Genom, leicht zu kultivieren.

Häufig verwendete Klonierungswirte

• Escherichia coli und Bacillus subtilis sind häufig verwendete prokaryotische Klonierungswirte, die eine gut entwickelte Genetik, viele Stämme, und eine leicht transformierbare Natur haben.
• Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter eukaryotischer Klonierungswirt mit einer gut entwickelten Genetik und der Fähigkeit, mRNA und Proteine zu verarbeiten.
• Vorteile und Nachteile der jeweiligen Wirte sind aufgeführt.

Restriktionsenzyme

• Typ I: Schneidet DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt, benötigt ATP.
• Typ II: Schneidet DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz, benötigt kein ATP.
• Typ III: Schneidet DNA etwa 20-25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt, benötigt ATP.
• Nomenklatur der Restriktionsenzyme (z.B. EcoRI), verschiedene Enzyme, Herkunftsorganismen und Erkennungssequenzen.

Isochizomere

• Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen mit identischen Erkennungssequenzen.

PCR (Polymerase Kettenreaktion)

• In-vitro-Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen.
• Typischer Reaktionsansatz (DNA-Template, Primer, Desoxynukleotide, Puffer, Wasser und DNA-Polymerase).
• PCR-Schritte (Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisierung).

Nachweis der PCR-Reaktion

• PCR-Fragmente zeigen eine kalkulierbare Größe, die mittels Elektrophorese sichtbar gemacht werden kann.

Elektrophorese

• Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe.
• Die DNA-Fragmente wandern durch ein Gel unter der Einwirkung eines elektrischen Feldes.

Primer

• Oligonukleotide, die als Startpunkt für die DNA-Polymerase dienen; Kriterien für die Primerwahl.

Klonieren eines Gens

• Verfahren, um ein spezifisches Gen zu klonieren, wenn keine zusätzliche Restriktionsschnittstelle eingefügt werden soll.

Ligation

• Verfahren zur Verknüpfung von DNA-Fragmenten.

Plasmide

• Kleine ringförmige DNA-Moleküle, die sich unabhängig von der Haupt-DNA replizieren. – Resistenzgene, Klonierungsplasmide, Expressionsplasmide.
• Plasmide mit ihren Funktionen (Fruchtbarkeit, Resistenz, Klonierung, Expression)

Genetischer Austausch bei Prokaryoten

• Transformation, Konjugation, Transduktion – Beschreibung der Mechanismen.

Transformation

• Verfahren, bei dem fremd DNA in eine Bakterienzelle aufgenommen wird, Beispiele und Vorgehensweise zur Durchführung chemischer Transformation.
• Nachweis, ob das Plasmid den Insert trägt. (z.B. Blau-Weiß Selektion)

Blau-Weiß Selektion: Das Operon-Modell

• Funktionseinheit von DNA in Prokaryoten zur Regulation der Genexpression – Beschreibung des Modells.
• Das Lac-Operon und seine Funktion im Zusammenhang mit Laktoseabbau.
• Blau-Weiß Selektion: Verfahren zur Identifizierung von Bakterien, die ein gewünschtes DNA-Fragment aufgenommen haben (z.B. X-Gal als Indikator)

Transduktion

• Übertragung von Genen durch einen Virus von einer Zelle zu einer anderen.

Konjugation

• Genetischer Austausch durch Zell-Zellkontakt und Plasmidübertragung.