Real-time PCR e SYBR Green
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Questions and Answers

Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo al SYBR Green?

  • È una molecola fluorescente che si lega solo ai primer.
  • È una molecola fluorescente che si lega solo al DNA denaturato.
  • È una molecola fluorescente che si lega solo al DNA amplificato.
  • È una molecola fluorescente che si lega a tutte le doppie eliche di DNA, inclusi i dimeri di primer. (correct)

    • Qual è il vantaggio principale dell'utilizzo del SYBR Green nella Real-time PCR?

  • È necessario progettare una sonda specifica per ogni target.
  • È una metodica molto costosa.
  • Consente l'analisi della curva di melting. (correct)
  • È altamente specifico per un determinato target.

    • Quale fattore influisce sull'intensità della fluorescenza rilevata durante la Real-time PCR con SYBR Green?

  • La temperatura di estensione della DNA polimerasi.
  • La concentrazione di SYBR Green utilizzata nella reazione. (correct)
  • Il volume della reazione.
  • La temperatura di annealing dei primer.

    • Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla Tm?

    <p>È la temperatura a cui la doppia elica di DNA si denatura. (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale processo si verifica durante la fase di allungamento nella Real-time PCR con SYBR Green?

    <p>L'aumento della fluorescenza. (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste opzioni è la definizione corretta di "Linea soglia" nella Real Time PCR?

    <p>È il valore al di sopra del quale inizia l'accumulo di un amplificato. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale parametro viene misurato in tempo reale durante la Real Time PCR?

    <p>La fluorescenza emessa dal marcatore fluorescente. (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste affermazioni descrive correttamente il Ciclo soglia (Ct) nella Real Time PCR?

    <p>È il ciclo in cui la fluorescenza emessa dal campione supera la fluorescenza della linea soglia. (D)</p> Signup and view all the answers

    Qual è la dimensione ideale della regione del genoma da amplificare utilizzando una sonda specie-specifica?

    <p>Tra 100 e 700 bp (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale metodo viene utilizzato per verificare la specificità della sonda specie-specifica?

    <p>PCR (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste opzioni spiega perché la misurazione dell'amplificazione in tempo reale è più precisa rispetto ai metodi tradizionali?

    <p>La Real Time PCR permette di misurare l'amplificazione durante la fase esponenziale, quando l'efficienza è massima. (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale è la funzione della "Linea di base" nella Real Time PCR?

    <p>Correggere la fluorescenza di fondo del campione. (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale è la concentrazione cellulare necessaria per ottenere 125 ng di DNA totale?

    <p>10^8 cellule (B)</p> Signup and view all the answers

    Cosa si intende per "fase esponenziale" nella Real Time PCR?

    <p>La fase in cui la quantità di DNA amplificato aumenta in modo esponenziale. (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale metodo viene utilizzato per ottenere delle curve di calibrazione nella q-PCR?

    <p>Reazione a catena della polimerasi (PCR) (A)</p> Signup and view all the answers

    Quali tipi di marcatori fluorescenti vengono utilizzati nella Real Time PCR?

    <p>Marcatori fluorescenti specifici per il DNA amplificato. (C)</p> Signup and view all the answers

    Cosa rappresenta il CT in una curva di calibrazione della q-PCR?

    <p>Il numero di cicli necessari per rilevare il segnale di amplificazione (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale dato viene utilizzato nella q-PCR per analizzare l'espressione genica?

    <p>Il numero di cicli necessari per rilevare il segnale di amplificazione (CT) (B)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il vantaggio principale di utilizzare la Real Time PCR rispetto ai metodi tradizionali di analisi del DNA?

    <p>La Real Time PCR permette di quantificare il DNA nel campione. (C)</p> Signup and view all the answers

    Cosa si intende per 'quantitativa relativa' in un plot di amplificazione?

    <p>Il confronto della quantità di DNA tra il campione e un controllo (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste opzioni descrive correttamente come la Real Time PCR è utilizzata in campo medico?

    <p>La Real Time PCR viene utilizzata per diagnosticare la presenza di infezioni, malattie genetiche e tumori. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste opzioni descrive correttamente il principio di funzionamento della Real Time PCR?

    <p>La Real Time PCR utilizza un marcatore fluorescente che si lega al DNA amplificato e la fluorescenza emessa viene misurata in modo continuo durante la reazione. (C)</p> Signup and view all the answers

    Utilizzando la q-PCR, come si determina il DCT?

    <p>Sottraendo il CT del campione dal CT del controllo (C)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il primo passo nella RT-PCR per valutare l'espressione di un gene?

    <p>Estrarre l'RNA dal campione biologico (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa viene utilizzato per convertire l'RNA in DNA durante la RT-PCR?

    <p>Trascrittasi inversa (B)</p> Signup and view all the answers

    Quando si effettua la normalizzazione del gene target, quale tipo di controllo dovrebbe essere utilizzato?

    <p>Controllo endogeno espresso costitutivamente (A)</p> Signup and view all the answers

    Qual è l'obiettivo principale della RT-PCR?

    <p>Valutare se un gene viene trascritto (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale fase non dovrebbe variare quando si analizzano le condizioni di crescita del ceppo?

    <p>Il controllo endogeno (B)</p> Signup and view all the answers

    Durante l'elettroforesi su gel di agarosio, quale delle seguenti affermazioni è FALSA riguardo la velocità di migrazione del DNA?

    <p>Le molecole di DNA più grandi migrano più velocemente rispetto alle molecole più piccole. (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa determina il potere risolutivo di un gel di agarosio durante l'elettroforesi?

    <p>La concentrazione di agarosio nel gel. (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti forme di DNA migra più velocemente attraverso un gel di agarosio?

    <p>Superavvolto. (B)</p> Signup and view all the answers

    In che modo la concentrazione di agarosio nel gel influenza la velocità di migrazione del DNA?

    <p>Una concentrazione di agarosio più elevata diminuisce la velocità di migrazione. (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra le seguenti opzioni NON influenza la velocità di migrazione del DNA durante l'elettroforesi su gel di agarosio?

    <p>Il tipo di vetrino utilizzato per l'elettroforesi. (C)</p> Signup and view all the answers

    Durante l'elettroforesi su gel di agarosio, quale dei seguenti parametri NON è direttamente correlato alla velocità di migrazione del DNA?

    <p>La temperatura ambiente. (A)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il ruolo del bromuro di etidio durante l'elettroforesi su gel di agarosio?

    <p>Rende il DNA visibile sotto luce UV. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla relazione tra la dimensione del DNA e la sua velocità di migrazione durante l'elettroforesi su gel di agarosio?

    <p>Le molecole più piccole migrano più velocemente. (C)</p> Signup and view all the answers

    Perché il DNA superavvolto migra più velocemente rispetto al DNA lineare durante l'elettroforesi su gel di agarosio?

    <p>Perché è più compatto. (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti fattori NON influenza la dimensione dei pori in un gel di agarosio?

    <p>La dimensione del DNA in analisi. (C)</p> Signup and view all the answers

    Qual è la funzione del colorante orange aggiunto ai campioni di DNA?

    <p>Addensare il campione e farne scorrere più facilmente il fronte (A)</p> Signup and view all the answers

    Quali sono i due tipi di colorante fluorescenti utilizzati nella visualizzazione del DNA su gel di agarosio?

    <p>Etidrio bromuro e Sybr Green (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni relative al bromuro di etidrio è FALSA?

    <p>Non è tossico e può essere maneggiato senza precauzione (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni relative al marcatore di dimensioni è VERA?

    <p>Serve per misurare la dimensione del DNA campione (A)</p> Signup and view all the answers

    Qual è la funzione della corsa elettroforetica?

    <p>Separare il DNA in base alla sua dimensione e carica elettrica (A)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il vantaggio della PCR in tempo reale rispetto alla PCR tradizionale?

    <p>Permette di quantificare la quantità di DNA amplificato (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale frazione del DNA viene amplificata durante la PCR?

    <p>Solo la frazione di DNA contenente il gene di interesse (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa significa la sigla "bp" nelle figure?

    <p>coppie di basi (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra le seguenti fasi è presente nella PCR ma non nella corsa elettroforetica?

    <p>Denaturazione (D)</p> Signup and view all the answers

    Quali informazioni si possono ottenere analizzando i risultati della PCR come mostrato in figura?

    <p>La dimensione dei frammenti di DNA amplificati (B)</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Presentazione e Argomento

    • L'argomento è la "Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR"
    • Il relatore è Maria Luisa Savo Sardaro
    • L'istituzione è l'Università San Raffaele di Roma

    Elettroforesi su gel di agarosio

    • La tecnica separa molecole cariche tramite un campo elettrico
    • Il DNA, carico negativamente a pH neutro, migra verso l'anodo (polo positivo)
    • La dimensione dei frammenti di DNA influenza la velocità di migrazione; i frammenti più piccoli migrano più velocemente
    • Altri fattori che influenzano la velocità di migrazione sono la concentrazione di agarosio nel gel, la conformazione del DNA, il voltaggio applicato (circa 5 Volt/cm) e la presenza di bromuro di etidio e la composizione (forza ionica) del buffer.

    Velocità di migrazione: fattori dipendenti

    • Dimensione del DNA
    • Concentrazione di agarosio nel gel
    • Conformazione del DNA (superavvolto, lineare, circolare)
    • Voltaggio applicato
    • Presenza di bromuro di etidio
    • Composizione (forza ionica) del buffer

    Relazione tra dimensione e velocità di migrazione

    • Esiste una relazione di proporzionalità diretta tra la dimensione (misurata in coppie di basi - pb - o dal peso molecolare (PM)) e la velocità di migrazione: molecole più grandi migrano più lentamente.
    • La costante di proporzionalità varia a seconda della concentrazione dell'agarosio nel gel.

    Concentrazione di agarosio

    • L'agarosio è un polimero lineare che crea una matrice semisolida con pori di dimensioni variabili a seconda della concentrazione.
    • Una maggiore concentrazione di agarosio genera pori più piccoli, migliorando la risoluzione del gel.
    • La concentrazione dell'agarosio è cruciale per la separazione ottimale dei frammenti di DNA.

    Conformazione del DNA

    • La conformazione del DNA (superavvolto, lineare, circolare) influenza la sua velocità di migrazione.
    • Il DNA superavvolto migra più velocemente perché è più compatto, mentre il DNA circolare migra più lentamente a causa della sua maggiore complessità strutturale.

    Preparazione del gel di agarosio

    • Pesare la quantità desiderata di agarosio
    • Scioglierla in un volume adeguato di tampone
    • Aggiungere etidio bromuro o Sybr green
    • Versare il gel nell'apposito apparato
    • Caricare la reazione alla quale è stato aggiunto un colorante in un pozzetto del gel
    • Far avvenire la corsa elettroforetica fornendo energia elettrica
    • Illuminare il gel con raggi UV per rendere visibile il DNA.

    Presenza di bromuro di etidio

    • Colorante fluorescente intercalante che permette la visualizzazione del DNA.
    • Assorbe la luce UV ed emette luce visibile
    • Riduce la velocità di migrazione del DNA (circa il 15%)

    Caricamento del gel

    • I campioni di DNA sono miscelati con un colorante (arancione) che agisce come addensante e indica il fronte elettroforetico.
    • Vengono caricati in appositi pozzetti del gel.
    • Un marcatore di dimensioni (ad es., 1 Kb DNA Ladder) viene incluso per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA nel campione.

    Analisi PCR quantitativa (Real-time PCR)

    • Misura l'amplificazione del DNA in tempo reale durante la fase esponenziale.
    • Permette risultati più accurati e quantitativi.
    • Si usa un termociclatore con rivelatore per fluorocromi e un software per l'analisi dei dati.
    • Vengono utilizzati marcatori fluorescenti per monitorare la PCR in tempo reale.
    • I valori di soglia (baseline, threshold) vengono utilizzati per determinare il ciclo soglia (CT) del campione.
    • La relazione tra CT e quantità iniziale del DNA è lineare.

    Sonde specifiche (TaqMan)

    • Sono oligonucleotidi che si ibridano con la sequenza bersaglio per amplificare e facilitare la rilevazione in tempo reale della sequenza di interesse durante la fase esponenziale della PCR.
    • Il reporter e il quencher sono uniti alla sonda; quando si forma il duplex, la fluorescenza del reporter è bloccata dal quencher.
    • Quando si rompe il duplex, sono separati e la fluorescenza è rilasciata.

    Quantificazione

    • Assoluta: si utilizzano standard di concentrazione nota
    • Relativa: si confrontano i campioni tra loro, e si usa un controllo endogeno per normalizzare i risultati.

    Studio dell'espressione genica

    • Vengono utilizzati primers specifici per amplificare i geni di interesse
    • L'RNA viene estratto e poi retrotrascritto in DNA per poter essere amplificato tramite PCR.
    • Il confronto dei risultati con un controllo endogeno permette di evidenziare quanto il gene di interesse venga trascritto nel caso dei campioni studiati.

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    Questo quiz esplora le conoscenze sulla Real-time PCR e sull'uso del SYBR Green. Le domande riguardano l'importanza del SYBR Green, i parametri misurati e la specificità delle sonde. Metti alla prova la tua comprensione di questi concetti cruciali nella biologia molecolare.

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