Real-time PCR e SYBR Green

Presentazione e Argomento

• L'argomento è la "Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR"
• Il relatore è Maria Luisa Savo Sardaro
• L'istituzione è l'Università San Raffaele di Roma

Elettroforesi su gel di agarosio

• La tecnica separa molecole cariche tramite un campo elettrico
• Il DNA, carico negativamente a pH neutro, migra verso l'anodo (polo positivo)
• La dimensione dei frammenti di DNA influenza la velocità di migrazione; i frammenti più piccoli migrano più velocemente
• Altri fattori che influenzano la velocità di migrazione sono la concentrazione di agarosio nel gel, la conformazione del DNA, il voltaggio applicato (circa 5 Volt/cm) e la presenza di bromuro di etidio e la composizione (forza ionica) del buffer.

Velocità di migrazione: fattori dipendenti

• Dimensione del DNA
• Concentrazione di agarosio nel gel
• Conformazione del DNA (superavvolto, lineare, circolare)
• Voltaggio applicato
• Presenza di bromuro di etidio
• Composizione (forza ionica) del buffer

Relazione tra dimensione e velocità di migrazione

• Esiste una relazione di proporzionalità diretta tra la dimensione (misurata in coppie di basi - pb - o dal peso molecolare (PM)) e la velocità di migrazione: molecole più grandi migrano più lentamente.
• La costante di proporzionalità varia a seconda della concentrazione dell'agarosio nel gel.

Concentrazione di agarosio

• L'agarosio è un polimero lineare che crea una matrice semisolida con pori di dimensioni variabili a seconda della concentrazione.
• Una maggiore concentrazione di agarosio genera pori più piccoli, migliorando la risoluzione del gel.
• La concentrazione dell'agarosio è cruciale per la separazione ottimale dei frammenti di DNA.

Conformazione del DNA

• La conformazione del DNA (superavvolto, lineare, circolare) influenza la sua velocità di migrazione.
• Il DNA superavvolto migra più velocemente perché è più compatto, mentre il DNA circolare migra più lentamente a causa della sua maggiore complessità strutturale.

Preparazione del gel di agarosio

• Pesare la quantità desiderata di agarosio
• Scioglierla in un volume adeguato di tampone
• Aggiungere etidio bromuro o Sybr green
• Versare il gel nell'apposito apparato
• Caricare la reazione alla quale è stato aggiunto un colorante in un pozzetto del gel
• Far avvenire la corsa elettroforetica fornendo energia elettrica
• Illuminare il gel con raggi UV per rendere visibile il DNA.

Presenza di bromuro di etidio

• Colorante fluorescente intercalante che permette la visualizzazione del DNA.
• Assorbe la luce UV ed emette luce visibile
• Riduce la velocità di migrazione del DNA (circa il 15%)

Caricamento del gel

• I campioni di DNA sono miscelati con un colorante (arancione) che agisce come addensante e indica il fronte elettroforetico.
• Vengono caricati in appositi pozzetti del gel.
• Un marcatore di dimensioni (ad es., 1 Kb DNA Ladder) viene incluso per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA nel campione.

Analisi PCR quantitativa (Real-time PCR)

• Misura l'amplificazione del DNA in tempo reale durante la fase esponenziale.
• Permette risultati più accurati e quantitativi.
• Si usa un termociclatore con rivelatore per fluorocromi e un software per l'analisi dei dati.
• Vengono utilizzati marcatori fluorescenti per monitorare la PCR in tempo reale.
• I valori di soglia (baseline, threshold) vengono utilizzati per determinare il ciclo soglia (CT) del campione.
• La relazione tra CT e quantità iniziale del DNA è lineare.

Sonde specifiche (TaqMan)

• Sono oligonucleotidi che si ibridano con la sequenza bersaglio per amplificare e facilitare la rilevazione in tempo reale della sequenza di interesse durante la fase esponenziale della PCR.
• Il reporter e il quencher sono uniti alla sonda; quando si forma il duplex, la fluorescenza del reporter è bloccata dal quencher.
• Quando si rompe il duplex, sono separati e la fluorescenza è rilasciata.

Quantificazione

• Assoluta: si utilizzano standard di concentrazione nota
• Relativa: si confrontano i campioni tra loro, e si usa un controllo endogeno per normalizzare i risultati.

Studio dell'espressione genica

• Vengono utilizzati primers specifici per amplificare i geni di interesse
• L'RNA viene estratto e poi retrotrascritto in DNA per poter essere amplificato tramite PCR.
• Il confronto dei risultati con un controllo endogeno permette di evidenziare quanto il gene di interesse venga trascritto nel caso dei campioni studiati.