Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR PDF

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR  Maria Luisa Savo Sardaro Elettroforesi di DNA su gel di agarosio Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR  Maria Luisa Savo Sardaro Elettroforesi di DNA su gel di agarosio Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 2 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Principio: Consentedi separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campoelettrico Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo (anodo) (CATODO) (ANODO) Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 3 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Da cosa dipende la velocità di migrazione ❑DIMENSIONE DEL DNA ❑CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL ❑CONFORMAZIONE DEL DNA ❑VOLTAGGIO APPLICATO circa 5 Volt/cm (distanzaanodo- catodo) ❑PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO ❑COMPOSIZIONE (FORZA IONICA) DEL BUFFER Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 4 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ DIMENSIONEDELDNA K relazione di proporzionalità diretta tra pb e PM: V= - molecole grandi migrano lentamente Log10 bp - molecole piccole migrano velocemente (K varia al variare della concentrazione di agarosio nel gel) Direzione migrazione Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 5 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ CONCENTRAZIONE DI AGAROSIONELGEL D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattoso L’agarosio è un polimero lineare che forma una matrice semisolida avente pori di dimensione diversa in funzionedella concentrazione utilizzata Lasuaconcentrazione determina il potere risolutivo delgel Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 6 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ CONFORMAZIONE DEL DNA DNA superavvolto, lineare e circolare hanno velocità di migrazione diversa anche se di dimensione uguale: - La forma SUPERAVVOLTAcorre più Superavvolto tà Veloci veloce perché è più compatta; - La forma CIRCOLAREcorre più lenta perché è la più “ingombrante” e fa più fatica a muoversi all’interno dei pori del gel; Lineare - La forma LINEARE si colloca a metà (la forma lineare è, ad esempio, quella che si ritrova come prodotto nellaPCR). Circolare Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 7 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del gel diagarosio Pesare la quantità desiderata di Bollire, aggiungere etidio agarosio e bromuro o Sybr green e scioglierla in un versare nell’apposito volume adatto di apparato per la corsa tampone elettroforetica Caricare la reazione alla quale Avvenuta la sia stato aggiunto un colorante, corsa, illuminare il in uno dei pozzetti del gel gel con raggi UV d’agarosio o e far avvenire la per rendere corsa elettroforetica fornendo visibile il DNA energia elettrica. Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 8 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ PRESENZADI BROMURO DI ETIDIO Colorante fluorescente (intercalante) che consente di visualizzare il DNA Assorbimento a 254 nm (U.V.) ed emissione nel visibile (590 nm) Riduce la velocità di migrazione di circa il 15% Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 9 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del gel diagarosio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 10 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Caricamento del gel I campioni di DNA vengono miscelati ad un colorante (orange) con funzione di addensante ed indicatore del fronte elettroforetico Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 11 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Caricamento del gel Marcatore di dimensioni: È costituito da frammenti di DNA aventi dimensioni note e consente di determinare la dimensione del DNA campione Viene fatto migrare insieme ai campioni di DNA come riferimento dimensionale Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 12 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Il risultato Risultato della PCR dellaPCR 612bp 692bp 612 501bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 c Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 13 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time Analisi PCR quantitativa PCR Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 14 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time Analisi PCR quantitativa PCR impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo reale la quantità dello specifico prodotto di PCR Termociclatore con detector per fluorocromi e software per analisi dati Linea di base (baseline): valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato Linea soglia (Threshold): scelta dall’operatore in modo da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Ciclo soglia: E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 15 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Li ne a s o g l i a s c e l ta da l l ’o pe rato re In maniera da intersecare le curve di tutti i c a m p i o n i n e l l a fa s e e s p o n e n z i a l e Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 16 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 17 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time PCR Sistemi di rilevamento 1. Coloranti che si intercalano nella doppia elica SYBR Green La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente Tm Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 18 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Durante l’allungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 19 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro SYBR Green metodica semplice, non costosa, aspecifica Analisi della curva di melting 82.6 88.1 Tm melting peak Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 20 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro 2. Sonde specifiche marcate con molecole fluorescenti Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCR R Q 3’ 5’ Primer 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 5’ 3’ R REPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza Q fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter 3’ 5’ 3’ 5’ Si libera 1 molecola di reporter per ogni copia di DNA duplicata 3’ 5’ 5’ Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 21 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Probe Forward primer Reverse primer Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 22 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto vNecessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) vPer tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT vNecessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) vGli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro DCT con quello del controllo endogeno Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 23 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALL’INTERNO DI UNA MATRICE 1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica in grado di amplificare una regione specifica del genoma del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra 100-700 bp Ø verifica in PCR (specificità e curva di melting) 2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto da cui estrarre e dosare il DNA totale Ø 108 cellule 125 ng Ø 10 cellule 6 10 ng Ø 10 cellule 4 0.9 pg 3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il range di linearità e la corrispondenza tra: CT : quantità di DNA : quantità di cellule Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 24 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA MATRICE IN ESAME q Estraggo il DNA totale dalla matrice ed eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i dati ottenuti in fase di messa a punto del metodo: v primers specifici v curva di calibrazione Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 25 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantitativa relativa Plot di amplificazione Control Sample Numero di cicli DCT Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 26 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Studio dell’espressione genica 1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse 2. Estrazione dell’RNA e Real-time PCR per valutare se il gene viene trascritto L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 27 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro =REVERSE TRANSCRIPTASE PCR La RT-PCR amplifica un RNA convertendolo prima in DNA (o DNA omplementare all’RNA) tramite l’enzima trascrittasi inversa, e poi amplificandolo tramite PCR con primers specifici per la sequenza di interesse. Estrarre l’RNA totale dal campione biologico che si vuole esaminare Trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l’mRNA trascritto dal gene di interesse) in cDNA tramite la reazione di trascrizione inversa Evidenziare il cDNA di interesse tramite la reazione di PCR Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 28 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantitativa relativa: analisi dei dati Ø Normalizzare il gene target con un controllo endogeno (ref) espresso costitutivamente (DCT) in una condizione di controllo Ø Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed eseguire l’analisi. Il controllo endogeno non dovrebbe variare. La variazione di espressione del gene in studio va valutata in riferimento all’espressione dello stesso gene nelle condizioni di controllo Ø Comparare ciascun DCT così ottenuto con il DCT del controllo ratio = ( Etarget)ΔCt target (control-treated) (Eref)ΔCt ref (control-treated) E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 29 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 30 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 31 di 31