Isolasi dan Pemurnian Enzim

Isolasi dan Pemurnian Enzim

• Tujuan isolasi dan pemurnian enzim meliputi:
  • Mempelajari fungsi enzim/protein
  • Menentukan urutan asam amino
  • Mempelajari struktur
  • Mencapai hasil (yield) yang maksimal
  • Mendapatkan aktivitas yang maksimal
  • Memperoleh tingkat kemurnian yang maksimal
• Enzim diisolasi dan dimurnikan sebagai biokatalis, contohnya pektinase yang membantu ekstraksi jus buah-buahan.

Tingkat Kemurnian Enzim

• Dalam industri, tidak selalu dibutuhkan enzim murni karena faktor ekonomi.
• Pemurnian cukup jika tidak ada kontaminan yang mengganggu enzim.
• Bidang farmasi dan medis membutuhkan tingkat kemurnian yang lebih tinggi karena beberapa protein/enzim dapat menyebabkan alergi pada pasien.

Isolasi Protein

• Sel mengandung ribuan protein.
• Prosedur pemurnian harus membedakan protein yang diinginkan dari protein lain.
• Sifat protein kunci dalam merancang protokol pemurnian.

Lisis Sel

• Lisis sel adalah proses pemecahan sel.
• Metode lisis sel meliputi:
  • Osmosis
  • Freeze/Thaw (Pembekuan/Pencairan)
  • French Press
  • Penggilingan dengan glass beads
  • Sonikasi (untuk bakteri)
• Setelah lisis, dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan pelet (endapan) dan supernatan (cairan di atas endapan). Supernatan mengandung protein terlarut.

Kondisi Stabilisasi

• Protein menjadi kurang stabil di luar lingkungan aslinya (native).
• Meskipun organisme hidup pada temperatur 37°C, pemurnian dilakukan pada temperatur 4°C.
• Inaktivasi enzim (ingat, enzim adalah protein) disebabkan oleh:
  • Panas
  • Proteolisis
  • pH tidak sesuai
  • Oksidasi
  • Agen pendenaturasi
  • Inhibitor
  • Hilangnya kofaktor
• Suhu dikondisikan maksimal 4°C untuk mencegah proteolisis, yaitu proses hidrolisis terhadap enzim yang dikehendaki oleh enzim protease yang juga diproduksi oleh sumber enzim.

Strategi Pemurnian Enzim

• Dasar pemurnian enzim:
  • Sumber enzim
  • Metode homogenisasi
  • Metode separasi

Sumber Enzim

• Sumber enzim meliputi:
  • Jamur (Fungi): 60%
  • Bakteria: 24%
  • Yeast: 4%
  • Streptomyces: 2%
  • Hewan: 6%
  • Tumbuhan: 4%
• Hewan:
  • Beberapa organ dan jaringan hewan sumber dari lipase, esterase, dan protease (tripsin, chymosin).
  • Enzim lisozim sebagian besar diproduksi dari telur ayam.
  • Pemanfaatan enzim chymosin dari sumber anak sapi menghasilkan flavor yang khas.
• Tumbuhan:
  • Ascorbate oxidase dari spesies Curcubita (jenis labu).
  • Urease dari Jack bean (kacang koro).
  • Bromealin dari Pineapple stem/fruit (nanas).
  • Amylase dari Barley (biji gandum).
  • Pectine esterase dari Citrus fruits.
  • Phytase dari Wheat, rye, triticale (gandum, gandum hitam, persilangan gandum & rye).
  • Papain dari pepaya.
• Kelemahan enzim yang dihasilkan hewan dan tumbuhan:
  • Jumlah enzim terbatas dan distribusinya sangat bervariasi.
  • Proses isolasi dan pemurnian enzim sangat sulit sehingga proses mahal.
  • Isolasi dari hewan mengandung risiko terkontaminasi oleh penyakit, contohnya BSE (penyakit sapi gila).
  • Beberapa tanaman mengandung senyawa fenol sehingga tidak disukai.
• Kultur Sel Mamalia:
  • Faktor biaya tinggi.
  • Enzim untuk pengobatan tissue plasminogen activator (TPA) berfungsi melarutkan gumpalan darah agar aliran darah dapat kembali normal (stroke).
• Mikroorganisme:
  • Sumber enzim yang paling signifikan dan mudah didapatkan.
  • Bisa menghasilkan enzim dalam jumlah besar.
  • Dapat ditumbuhkan pada media murah dan waktu yang pendek.
  • Bisa direkayasa genetik untuk meningkatkan produksi enzim.
  • Isolasi dan pemurnian enzim sangat mudah dibanding hewan dan tumbuhan (contoh: chymosin yang semula dari abomasum anak sapi, kini diproduksi dalam E. coli dan Kluveromyces lactis).

Contoh Enzim dari Spesies Bakteri dan Fungi

• Amilase dari Bacillus (ekstraseluler) untuk pati.
• Asparaginase dari E. coli (intraseluler) untuk kesehatan.
• Glucosa isomerase dari Bacillus (intraseluler) untuk sirup fruktosa.
• Penicilin amidase dari Bacillus (intraseluler) untuk farmasi.
• Protease dari Bacillus (ekstraseluler) untuk detergen.
• Amilase dari Aspergillus (E) untuk baking.
• Katalase dari Aspergillus (I) untuk pangan.
• Selulase dari Trichoderma (E) untuk limbah.
• Dextranase dari Penicillium (E) untuk pangan.
• Glucose oxidase dari Aspergillus (I) untuk pangan.
• Lactase dari Aspergillus (E) untuk dairy.
• Lipase dari Rhizopus (E) untuk pangan.
• Rennet dari Mucor miehei (E) untuk keju.
• Pektinase dari Aspergillus (E) untuk minuman.
• Protease dari Aspergillus (E) untuk baking.

Tahapan Umum Proses Purifikasi Enzim

• Prinsip dasar: melakukan ekstraksi, dilanjutkan dengan isolasi/memisahkan enzim dari komponen sel lain (karbohidrat, protein lain, asam nukleat, molekul kecil lainnya).
• Prosedur pemurnian protein dapat dilakukan karena adanya variasi muatan, ukuran, kelarutan, dan afinitas (binding specificity).

Prinsip Dasar Pemurnian

• Tahap awal pemurnian menentukan sumber enzim.
• Jenis enzim yang dipurifikasi intraseluler (berada di dalam sel) atau ekstraseluler (disekresi keluar sel, ke medium).
• Pemurnian enzim ekstraseluler lebih sederhana dan murah.

Metode/Teknik Purifikasi Secara Umum

• Persiapan sel penghasil enzim.
• Homogenisasi:
  • Memecah sel dan mengekstraksi enzim agar didapatkan suspensi homogen.
  • Jangan sampai berbusa karena enzim yang terekstrak akan terdenaturasi.
  • Proses dilakukan pada suhu 2-4°C.
  • Tergantung jenis sel dan lokasi enzim.
  • Dapat dilakukan secara mekanis (French press, sonikasi, glass bead), kimiawi (SDS, buffer hipotonik), dan enzimatis (lizozim, protease), atau kombinasi dari 3 cara.
• Fraksinasi:
  • Memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel.
  • Sentrifugasi menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung.
  • Fraksi yang mengandung enzim diambil untuk tahap pemurnian lanjutan.
• Presipitasi protein dengan garam (amonium sulfat):
  • Sebagian besar enzim berada dalam bentuk cairan sel sebagai protein terlarut.
  • Garam yang sering digunakan untuk mengendapkan protein dan enzim adalah amonium sulfat.
  • Bertujuan untuk memisahkan protein dari zat-zat lain yang terlarut (garam-garam, asam-asam nukleat, lipid, dsb).
  • Kelebihan amonium sulfat:
    • Mempunyai kelarutan yang tinggi
    • Tidak mempengaruhi aktivitas enzim
    • Mempunyai daya pengendap yang efektif
    • Mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan enzim
    • Digunakan pada berbagai pH
    • Harganya murah. -Solubility(SaltingOut): Garam berkompetisi dengan air. Protein mengalami agregasi melalui interaksi van der Waals dan hidrofobik dan mengendap dalam bentuk native 1-4 M (NH4) SO2 4.
• Pemisahan garam dengan dialisis:
  • Digunakan untuk memisahkan garam dari larutan protein.
  • Setelah presipitasi, garam harus dipisahkan dengan dialisis karena keberadaan garam mengganggu.
  • Proses terjadi karena perbedaan tekanan osmosis antara cairan di dalam membran dan yang di luar.
  • Molekul protein/enzim berukuran besar tertahan dalam kantung dialisis.
  • Molekul kecil (garam anorganik) keluar melalui pori-pori membran.
  • Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion tidak seimbang.
  • Digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar kantong dialisis.
  • Membran yang digunakan adalah selofan.
• Pemurnian dengan aneka kolom kromatografi:
  • Jika membutuhkan tingkat kemurnian tinggi.
• Gel filtrasi (berdasarkan ukuran).
• Ion-exchange (berdasarkan muatan).
• Afinitas (berdasarkan afinitas/ikatan).

Monitoring Proses Pemurnian

• Kadar protein dan aktivitas enzim dimonitor.
• Parameter dilihat dari protein total, aktivitas enzim total, aktivitas spesifik, yield dan tingkat pemurnian.
  • Protein total (mg) = Jumlah protein dari setiap fraksi.
  • Aktivitas total (unit aktivitas) = aktivitas pada sampel dikalikan volume total.
  • Aktivitas spesifik (unit of activity/mg) = perbandingan antara aktivitas total dengan protein total
  • % Yield adalah aktivitas enzim yang tertinggal dari setiap tahap pemurnian.
  • Tingkat pemurnian.

Karakterisasi Enzim

• Pengaruh pH terhadap aktivitas dan kestabilan enzim.
• Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan kestabilan enzim.
• Pengaruh ion-ion logam terhadap aktivitas.
• Spesifitas terhadap substrat.
• Kinetika enzimatis (pengaruh konsentrasi enzim, substrat, inhibitor dsb).
• Ion-exchange Chromatography (IEX) (berdasar muatan):
  • Prinsip dasar teknik penukar ion adalah memisahkan biomolekul berdasarkan muatan ioniknya.
  • Penukar ion terdiri atas matriks yang tidak larut dan gugus bermuatan yang terikat secara kovalen pada matriks.
  • Gugus-gugus bermuatan berasosiasi dengan counter ion.
  • Counter ion dapat digantikan secara reversibel oleh ion-ion lain yang bermuatan sama.
  • Penukar ion bermuatan positif mempunyai counter ion yang bermuatan negatif (penukar anion).
  • Penukar kation bermuatan negatif, mempunyai counter ion yang bermuatan positif.
  • Protein yang terikat pada penukar dapat dielusi dari kolom dengan mengubah pH atau konsentrasi garam (misalnya NaCl).
  • Penukar ion dengan matriks selulosa yang banyak digunakan dalam pemisahan adalah DEAE-selulosa dan CM- selulosa.
    • Gugus DEAE, -OC2H5NHC2H52 bermuatan positif pada pH 6,0-8,0 (protein bermuatan negatif pada rentang pH tersebut).
    • CM-selulosa selulosa-OCH2COO- (protein bermuatan positif pada pH 4,5).
  • Kelebihan metode dibandingkan dengan metode filtrasi gel: apabila menggunakan sampel yang banyak tidak terlalu dipengaruhi oleh tinggi kolom, sehingga efisiensi diameter kolom dapat ditingkatkan.
• Gel Filtration/Size Exclusion Chromatography (berdasar ukuran).
• Kromatografi Interaksi Hidrofobik:
  • Protein mempunyai daerah hidrofobik di permukaan yang dapat berinteraksi dengan resin.
  • Resin yang mengandung gugus fenil atau alifatik mengikat protein (protein paling hidrofobik akan terikat paling kuat).
  • Elusi dilakukan dengan pelarut yang kurang polar atau dengan menurunkan [garam].

Aktivitas Spesifik

• Speci fic activity = (enzyme activity) / (mg of total protein) (U/mg)
• Meningkat seiring dengan pemurnian target, menunjukkan efektivitas setiap langkah.

Tingkat Pemurnian

• Purification = (specific activity of purified material) / (specific activity of original material)
• Biasanya dinyatakan sebagai fold-purification.

Persentase Yield (atau Recovery)

• Yield = (enzyme units recovered) / (enzyme units at start) * 100
• Biasanya dinyatakan dalam %.

Analisis Tingkat Kemurnian dengan SDS-PAGE

• SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) digunakan untuk memisahkan protein (molekul bermuatan berdasarkan ukuran dalam medan listrik).
• Protein didenaturasi dengan detergen anion.
• Tahapan:
  • Ekstrak kasar
  • Pengendapan dengan garam
  • Kromatografi penukar ion
  • Kromatografi filtrasi gel
  • Kromatografi afinitas