Preparazione della Libreria NGS
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Questions and Answers

Quali dei seguenti fattori si legano al promotore nella preiniziazione?

  • Cohesin (correct)
  • Tutti i precedenti
  • Mediator (correct)
  • PIC (correct)

    • Quale dei seguenti è il ruolo del Mediatore nella preiniziazione?

  • Stabilizzare la formazione del PIC
  • Legame al promotore
  • Tutte le precedenti (correct)
  • Regolare la trascrizione

    • Come è correlata la coesina alla preiniziazione?

  • Regola la stabilità del PIC
  • Si lega stabilmente al promotore
  • Ha un ruolo transitorio nella preiniziazione (correct)
  • Non ha un ruolo nella preiniziazione

    • Dove si verifica la preiniziazione?

    <p>Nel nucleo (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste affermazioni sulla preiniziazione è vera?

    <p>Tutte le precedenti (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo al grafico?

    <p>Il grafico mostra la co-localizzazione di MED1 e OGDH in un intervallo di 20 kb attorno al centro di un picco. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quali sono gli elementi mostrati nel grafico che sono co-localizzati?

    <p>MED1 e OGDH (C)</p> Signup and view all the answers

    Il grafico mostra che la co-localizzazione di MED1 e OGDH è correlata all'angolo di rotazione del DNA?

    <p>No, la co-localizzazione non mostra correlazione con l'angolo di rotazione del DNA. (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa indica l'asse y del grafico?

    <p>La percentuale di co-localizzazione tra MED1 e OGDH. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quanto è ampio il grafico?

    <p>40 kb (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale potrebbe essere un possibile scopo del grafico?

    <p>Indagare se MED1 e OGDH sono co-localizzati in determinate regioni del genoma. (D)</p> Signup and view all the answers

    Il grafico mostra che la co-localizzazione di MED1 e OGDH è maggiore sul lato destro o sinistro del picco?

    <p>Lato destro (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa suggerisce la linea che rappresenta MED1/tot.MED1?

    <p>La percentuale di MED1 associata ad OGDH rispetto al totale di MED1. (A)</p> Signup and view all the answers

    Cosa suggerisce l'utilizzo di una scala diversa sull'asse y per 'with MED1' e 'with MED1/tot.MED1'?

    <p>La differenza nel modo di misurare la co-localizzazione tra i due metodi. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quali potrebbero essere i limiti di questo grafico?

    <p>Mostrare solo un piccolo intervallo del genoma potrebbe limitare le conclusioni. (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale tra queste proteine non è una componente del complesso della deidrogenasi a catena ramificata (BCKDH)?

    <p>Med24 (B)</p> Signup and view all the answers

    In base al grafico, quale di questi è un regolatore positivo dell'attività dell'enzima DLD?

    <p>Med24 (A)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il ruolo principale dei mediatori nel processo mostrato nel grafico?

    <p>Regolazione dell'espressione genica (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine ​​è coinvolto nella formazione di Succinyl-CoA?

    <p>BCKDHA (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste linee nel grafico rappresenta l'attività degli enzimi non associata al mediatore?

    <p>IgG (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine è coinvolto nel metabolismo della valina?

    <p>Pdha1 (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale di questi enzimi è coinvolto nella produzione di α-chetoglutarato?

    <p>OGDH (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine è responsabile della conversione del piruvato in acetil-CoA?

    <p>Pdha1 (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine ​​mostra un aumento dell'attività quando il mediatore è presente?

    <p>Med24 (C)</p> Signup and view all the answers

    Quali di questi sono enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi a catena ramificata?

    <p>BCKDHA, BCKDHB, E1, E2, E3 (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine ​​è principalmente coinvolta nel metabolismo degli amminoacidi come leucina, isoleucina e valina?

    <p>Med19 (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale di questi enzimi è coinvolto nella produzione di α-chetoacido da amminoacidi a catena ramificata?

    <p>BCKDHA (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale di queste proteine ​​ha un ruolo simile a Med1?

    <p>Med15 (A)</p> Signup and view all the answers

    In base al grafico, quale di queste proteine ​​ha un'attività significativamente maggiore quando il mediatore è presente rispetto a quando il mediatore è assente?

    <p>Med24 (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale di questi enzimi è coinvolto nella produzione di succinil-CoA da α-chetoglutarato?

    <p>OGDH (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un esempio di software di allineamento delle sequenze utilizzato nell'analisi RNA-seq?

    <p>Bowtie2 (A), GSNAP (B), Novoalign (C), Tutti i precedenti (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni sull'analisi RNA-seq è vera?

    <p>L'analisi RNA-seq è utilizzata per studiare il trascrittoma. (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un approccio utilizzato dal software di allineamento delle sequenze BWA-mem?

    <p>Burrows-Wheeler (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti software di allineamento delle sequenze è specificamente progettato per l'RNA-seq?

    <p>TopHat (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un risultato tipico di un'analisi RNA-seq?

    <p>Un elenco di geni differenzialmente espressi (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni su R è vera?

    <p>R è un linguaggio di programmazione utilizzato per l'analisi dei dati. (C)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il primo passo in un flusso di lavoro RNA-seq?

    <p>Importare e visualizzare i dati RNA-seq in R (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è vera riguardo al software di allineamento delle sequenze Bowtie2?

    <p>Utilizzabile per l'allineamento di sequenze di DNA e RNA, di singola e di doppia estremità (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni sullo studio è corretta?

    <p>Lo studio ha utilizzato cellule RAW 264.7 trattate con siRNA per studiare l'effetto dell'inibizione di MED16. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei due geni studiati è associato a un numero maggiore di letture per milione nel gruppo di controllo (NT)?

    <p>MED16 (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei due geni studiati mostra un cambiamento significativo nei livelli di espressione quando MED16 viene abbattuto?

    <p>DLST (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti enzimi è coinvolto nella produzione di Acyl-CoA?

    <p>OGDH (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti enzimi è un mediatore?

    <p>MED1 (B)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il nome del tipo di esperimento condotto?

    <p>RNA-seq (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un metodo per abbattere l'espressione genica?

    <p>siRNA (C)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il nome del tipo di cellule utilizzate in questo studio?

    <p>Cellule del sistema immunitario (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un esempio di trattamento di controllo in questo studio?

    <p>siRNA-NT (C)</p> Signup and view all the answers

    Cosa significa 'FLAG' in questo contesto?

    <p>Un tipo di marcatura (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un esempio di enzima che produce Acyl-CoA?

    <p>OGDH (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un esempio di mediatore?

    <p>MED1 (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti è un tipo di cellula?

    <p>RAW 264.7 (D)</p> Signup and view all the answers

    Qual è il significato del termine 'colocalizzazione' in questo contesto?

    <p>L'interazione di due proteine nello stesso sito (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo al gene MED1?

    <p>Il gene MED1 è coinvolto nella regolazione della trascrizione (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale tecnica è stata utilizzata per studiare l'espressione del gene MED1?

    <p>Microscopia a fluorescenza (C)</p> Signup and view all the answers

    Quali altri geni, oltre a MED1, sono rappresentati nell'immagine?

    <p>DLAT, OGDH, MED24 (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti geni è associato a una distanza dal picco di circa 10 kb?

    <p>OGDH (B)</p> Signup and view all the answers

    Quali cellule sono state utilizzate per l'analisi?

    <p>Cellule di mammifero HeLa (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti geni mostra un'espressione maggiore in cellule HeLa?

    <p>MED1 (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti geni è stato utilizzato come riferimento per l'analisi dell'espressione genica?

    <p>DAPI (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo all'espressione di MED1 in cellule HeLa rispetto a cellule normali?

    <p>MED1 è espresso a livelli significativamente più alti in cellule HeLa (B)</p> Signup and view all the answers

    Quali delle seguenti proteine ​​sono coinvolte nella regolazione del metabolismo cellulare e sono rappresentate nell'immagine?

    <p>MED1, OGDH, DLAT, MED24, DLST (A)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alle informazioni fornite nell'immagine?

    <p>Le informazioni mostrano che il gene MED1 è coinvolto nella regolazione della trascrizione. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla posizione del gene OGDH nell'immagine?

    <p>L'immagine mostra che OGDH si trova a sinistra di MED1. (C)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla funzione del gene DLST?

    <p>DLST è coinvolto nel metabolismo degli zuccheri. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quali sono i possibili significati dell'osservazione che il gene MED1 ha un'espressione maggiore in cellule HeLa rispetto alle cellule normali?

    <p>L'espressione di MED1 è correlata alla crescita tumorale e proliferazione cellulare. (D)</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla tecnica della microscopia a fluorescenza?

    <p>La microscopia a fluorescenza permette di visualizzare l'espressione di un gene a livello di traduzione. (B)</p> Signup and view all the answers

    Quale dei seguenti metodi potrebbe essere utilizzato per determinare la funzione specifica del gene MED1?

    <p>Knockout genico. (C)</p> Signup and view all the answers

    Flashcards

    Pre-inizio della natura

    Fase in cui la trascrizione dell'RNA è prontamente avviata.

    Loopping cromatinico

    Struttura che connette gli enhancer ai promotori per attivare i geni.

    Complesso Mediator

    Componente chiave che stabilizza l'interazione tra enhancer e promotore.

    Cohesin

    Proteina che collega le due catene di DNA durante la trascrizione.

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    Estratto nucleare

    Preparato contenente componenti del nucleo cellulare per studi

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    MED1

    Una proteina coinvolta nella regolazione genica.

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    Colocalizzazione

    Quando due o più molecole si trovano nello stesso luogo cellulare.

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    DAPI

    Un colorante usato per visualizzare il DNA nelle cellule.

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    DLAT

    Possibile indicatore di un'informazione specifica nel contesto.

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    Punto A1

    Un punto di riferimento specifico nelle analisi.

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    OgdH

    Possibile sigla o abbreviazione per un gene o proteina.

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    H 2S5

    Riferimento a una molecola o composto chimico.

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    La

    Riferimento a un nucleo specifico o posizione di una cellula.

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    D

    Simbolo che può rappresentare una variabile in un contesto scientifico.

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    R

    Una nota o etichetta usata per il riferimento.

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    siRNA

    RNA interferente piccolo usato per silenziare geni specifici.

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    Acyl-CoA

    Componente essenziale nei processi metabolici di ossidazione degli acidi grassi.

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    RAW 264.7

    Una linea cellulare di macrofagi utilizzata in studi di immunologia.

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    Trascrizione

    Il processo di copia dell'informazione genetica in RNA.

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    Fattori di trascrizione

    Proteine che regolano la trascrizione dei geni.

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    Metabolismo

    Insieme delle reazioni chimiche che avvengono in un organismo.

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    Mediator

    Un complesso proteico coinvolto nella trascrizione genica.

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    Enzimi

    Proteine che accelerano le reazioni chimiche in organismi.

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    Riassunto della lettura

    Analisi della lettura ottenuta da esperimenti scientifici.

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    Gene

    Un tratto di DNA che contiene l'informazione per creare una proteina.

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    RNA polimerasi

    Enzima che sintetizza RNA a partire da un template di DNA.

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    Sequenziamento

    Il processo di determinare l'ordine dei nucleotidi in un DNA o RNA.

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    RNA-seq

    Una tecnica utilizzata per analizzare l'espressione genica in diverse condizioni.

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    Espressione differenziale

    Confronto dell'espressione genica tra due stati o condizioni.

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    Allineamento delle sequenze

    Il processo di confronto di letture di sequenziamento con un genoma di riferimento.

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    Software STAR

    Un allineatore di sequenze basato su hash utilizzato per RNA-seq.

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    Workflow RNA-Seq

    La sequenza di passaggi per analizzare i dati RNA-seq.

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    Analisi statistica

    Valutazione dei dati per determinare significatività e modelli.

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    BCKDHA

    Enzima coinvolto nel metabolismo degli aminoacidi a catena ramificata.

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    Oxaloacetato

    Intermediario nel ciclo di Krebs e nella gluconeogenesi.

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    E1, E2, E3

    Sottocomplessi dell'enzima BCKD (deidrogenasi dei chetoacidi ramificati).

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    Succinil-CoA

    Intermediario del ciclo di Krebs e del metabolismo degli acidi grassi.

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    Alpha-Cetoglutarato

    Intermediario del ciclo di Krebs e precursore di aminoacidi.

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    Isoleucina

    Amminoacido essenziale appartenente alla categoria BCAA.

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    Valina

    Amminoacido essenziale, uno dei BCAA.

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    Citrate

    Un sale o estere dell'acidocitrico, coinvolto nel ciclo di Krebs.

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    Cdk8

    Chinasi ciclina-dipendente, regola la trascrizione genica.

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    Log2 Fold Change

    Misura della variazione delle espressioni geniche in studi di RNA conosciuti.

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    Evidenziazione DAPI

    Un colorante per evidenziare il DNA nelle cellule.

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    Centri di picco

    Rappresenta la posizione massima dell'attività genica.

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    距离

    Si riferisce alla distanza nel contesto della genetica.

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    Dati biologici

    Informazioni quantitativo o qualitativo sui processi biologici.

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    Flusso cellulare

    Il movimento delle sostanze attraverso le membrane cellulari.

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    Segnalazione cellulare

    Il modo in cui le cellule comunicano tra loro.

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    Cellule tumorali

    Cellule che si dividono incontrollabilmente.

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    Microscopia

    Tecnica per ingrandire piccole immagini per visualizzarle meglio.

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    Apoptosi

    Processo di morte cellulare programmata.

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    Chimica cellulare

    Studio delle reazioni chimiche che avvengono nelle cellule.

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    Study Notes

    NGS Library Preparation

    • Illumina next-generation sequencing (NGS) uses a fundamentally different approach than Sanger chain-termination.
    • It employs sequencing by synthesis (SBS) technology, tracking the addition of labeled nucleotides as the DNA chain is copied in a massively parallel fashion.
    • Next-generation sequencing generates vast amounts of DNA sequence data, richer and more complete than Sanger sequencing.
    • Data output ranges from 300 kilobases to multiple terabases in a single run, depending on the instrument and configuration.

    Illumina Sequencing Technology

    • Sequencing by synthesis (SBS): Detects single bases as they're incorporated into growing DNA strands.
    • DNA molecules and primers are first attached to a slide or flow cell, amplified to form clonal DNA colonies (clusters).
    • Reversible terminator bases (RT-bases) are added to determine the sequence, and unincorporated nucleotides are washed away.
    • Fluorescently labeled nucleotides are imaged.
    • The dye and terminal blocker are chemically removed, allowing the next cycle to begin.
    • Unlike pyrosequencing, DNA chains are extended one nucleotide at a time, and image acquisition can be performed at a delayed moment—allowing for very large arrays of DNA colonies to be captured by sequential images from a single camera.

    Library Preparation

    • Samples of longer fragments are sheared into a random library of 100-300 base-pair long fragments.
    • After fragmentation, the ends of the DNA fragments are repaired, and an A-overhang is added to the 3' end of each strand.
    • Adapters necessary for amplification and sequencing are ligated to both ends of the DNA fragments.
    • These fragments are then size-selected and purified.

    Basic Steps for Sequencing

    • Library Preparation: Libraries are prepared and barcodes are added to individual samples.
    • Pooling: Samples are pooled together.
    • Sequencing: Sequences are determined in parallel.
    • Demultiplexing: Reads are separated based on the added barcodes.
    • Alignment: Sequences are aligned to a reference genome.

    Sample Multiplexing

    • Two representative DNA fragments from two unique samples are attached to specific barcode sequences.
    • Libraries for each sample are pooled and sequenced in parallel.
    • Each new read contains both the fragment sequence and its sample-identifying barcode.
    • Barcode sequences are used to de-multiplex the reads from each sample.
    • Each set of reads is aligned to a reference sequence.

    Tn5-Transposase Based Library Preparation

    • Transposomes attach to genomic DNA, facilitating fragmentation.
    • Tagmentation creates fragments (~300 bp).
    • Primers (e.g., Read 1 Sequencing Primer, Read 2 Sequencing Primer) and indexes are attached to the fragments.
    • PCR amplification generates sequencing-ready fragments.

    Multiplex Sequencing Assay

    • Sample multiplexing allows processing of many samples on a high-throughput instrument.
    • Individual "barcode" sequences are added to each sample to distinguish them in data analysis.
    • Pooling samples significantly increases the number of samples processed in a single run without a substantial increase in cost or time.
    • Highlights of the strategy include speed, high-throughput capacity, and cost-effectiveness.

    Illumina NGS Sequencing

    • Sequencing by synthesis: DNA sequence is copied, one nucleotide at a time.
    • Massive parallelization: Reaction is performed on many templates simultaneously to increase sequencing capacity.

    Cluster Generation

    • Single DNA fragments hybridize to oligonucleotides on the flow cell complementary to the ligated adaptors, and are amplified via bridge amplification.
    • This forms millions of unique clusters.
    • The reverse strands are cleaved during washing.
    • Sequencing primers are hybridized to the DNA templates.

    Sequencing

    • During sequencing, clusters are sequenced simultaneously.
    • DNA templates are copied base-by-base, utilizing fluorescently labeled and reversible terminator nucleotides.
    • After each synthesis step, clusters are excited by a laser, causing fluorescence of the last incorporated base, to determine the sequence.
    • The fluorescence label and blocking group are removed, enabling the next base addition.
    • The fluorescence signal is captured by a built-in camera to produce images of the flow cell.

    RNA-Seq Data Analysis

    • Counts (Text): Matrix containing read counts for all annotated genes in the genome.
    • Statistics (Stats): Applying statistical methods to determine if the differential expression is statistically significant.
    • Differential Expression (Differential Expression): Representing the results in a proper way.

    RNA-Seq in a Nutshell

    • Produce sequencing data from the transcriptome (perturbed and control).
    • Match sequencing reads to the same genome/transcriptome.
    • Count how many reads align to the same region for both conditions.
    • Look for differentially expressed genes.

    Sequence Alignment Software

    • Aligner tools like BWA-mem, Bowtie2, Novoalign, TopHat, STAR, and GSNAP use different approaches for DNA or RNA sequencing applications.

    RNA-Seq Data Analysis Output: Volcano Plot

    • Volcano plots are scatterplots visualizing the results of differential gene expression analyses.
    • They display statistical significance (p-value) versus the magnitude of change (fold change).

    RNA-Seq Data Analysis Output: Principal Component Analysis (PCA)

    • PCA is used to evaluate overall similarity between samples.
    • It identifies samples with similar expression levels and helps analyze experimental designs.

    RNA-Seq Data Analysis Output: Identification of Patterns

    • Heatmaps visually display gene expression profiles to identify pattern similarities.
    • This helps in clustering and classifying samples based on their expression profiles.

    RNA-Seq Data Analysis Output: Molecular Functions

    • GO enrichment analysis categorizes DEGs according to their molecular functions.

    ChIP-Seq Experiments

    • Identifying transcription factors (TFs) or histone modifications.
    • DNA fragmentation (300bp inserts) and adaptor ligation.
    • Sequencing methods (Paired/Single end sequencing).
    • Mapping and filtering.
    • Peak calling, and motif analysis.

    ChIP-Seq Data Analysis Workflows

    • Sequencing platform, imaged analysis, quality control, enriched regions, and downstream analyses.

    Data Analysis

    • Data preprocessing and sequencing reads alignment.
    • Read density and visualizations.

    Conclusions

    • Mediator complexes interact with 2-ketoacid dehydrogenases.
    • Dehydrogenases linked with Mediator are enzymatically active, producing acetyl-CoA.
    • NO (Nitric Oxide) regulates both Mediator's PDH activity and MED-PDH interaction, influencing acetyl-CoA production.
    • Inhibition of NO restoration results in MED-PDH interaction and local Acetyl-CoA production in genomic regions.

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