Lymphocytes T mémoire: MCB 2991

• Les lymphocytes T mémoire sont le sujet des notes d'étude
• La présentation a été créée par Nathalie Labrecque de l'institut de recherches cliniques de Montréal, pour le cours MCB 2991, le 19 mars 2025.

Phase de la réponse T

• Un lymphocyte T naïf est activé par un antigène (Ag) ce qui cause l'expansion.
• L'expansion mène à la formation des lymphocytes T effecteurs.
• Jour 0 correspond au lymphocyte T naïf.
• Jour 7-9 correspond aux lymphocytes T effecteurs.
• Une contraction se produit suite à l'apoptose.
• L'apoptose des lymphocytes T effecteurs à 90% résulte en lymphocytes T mémoire.
• Jour 40 et plus correspond aux lymphocytes T mémoire
• Les lymphocytes T mémoire offrent une protection à long terme, le succès de la vaccination, une longue demi-vie et un auto-renouvellement.
• Les lymphocytes T effecteurs assurent le contrôle de l'infection et ont une courte demi-vie.

Plan du cours

• Les notes de cours fourniront des informations sur les caractéristiques, sous-populations et développement des lymphocytes T mémoire.
• Les notes de cours fourniront des informations sur les méthodes expérimentales permettant le suivi de la réponse des lymphocytes T in vivo.

Caractéristiques des lymphocytes T mémoire

• Ils ont une réponse plus sensible et plus rapide suite à l'exposition d'un antigène.
• Ils ont une durée de vie très longue.
• Ils se trouvent dans les organes lymphoïdes secondaires, le sang et les tissus.

Réponse plus rapide

• La réponse du lymphocyte T CD8+ et de l'antigène varie durant les étapes 1 à 4.
• L'étape 1 est l'amorçage.
• L'étape 2 est la contraction.
• L'étape 3 est le maintien de la mémoire.
• L'étape 4 est la réponse de 2e niveau.
• L'augmentation du nombre de précurseurs est jusqu'à 1000X.
• L'infection ou l'immunisation prend environ 5 jours.
• La réinfection prend environ 1 jour.
• Les réponses de 2e niveau peuvent durer plus qu'un an.

Preuve expérimentale d'une réponse plus rapide des lymphocytes T mémoire

• Comparaison de la cinétique de la réponse des lymphocytes T CD8 naïfs et mémoire exprimant le même RCT
• Purification des lymphocytes T naïfs CD8+ transgéniques exprimant le RCT 1B2
• Purification des lymphocytes T mémoire CD8+ transgéniques exprimant le RCT 1B2( transfert adoptif de T naïfs dans une souris receveuse suivi d'une immunisation pour générer des T mémoires)
• Stimulation in vitro avec l'antigène et mesure de la quantité de cytokine produite par ELISA
• Ceci nous permet donc d'utiliser une courte stimulation in vitro pour mesurer la réponse des lymphocytes T mémoires à l'aide d'un marquage intracellulaire
• Après stimulation, les cellules mémoires produisent une quantité significativement plus élevée d'IFN-γ et d'IL-2.

Preuve expérimentale de l'augmentation de la sensibilité des cellules T mémoire à leur antigène

• Infection de souris avec le virus LCMV
• Stimulation courte de (6h) in vitro des cellules T avec l'épitope NP(118-126)
• Mesure de la production de INF-Y par marquage intracellulaire
• Pas dû à un changement de l'affinité du RCT des cellules T mémoires, lesquelles lient avec la même affinité le complexe peptide-CMH(tétramère)

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils efficacement et rapidement répondre

• La réponse est si rapide qu'on ne se rend pas compte de la réinfection
• La réponse est si efficace que les lymphocytes T mémoire peuvent maintenant contrôler une infection avec une dose léthale du microorganisme

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils être plus sensibles à leur antigène

• Ils ont besoin d'une plus faible quantité d'antigène pour répondre.

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils être plus sensibles à leur antigène?

• Une plus grande association de lck au co-récepteur CD8
• Quantité égale de lck

Signalisation via le RCT

• lck phosphoryle les chaînes du CD3
• Recrute ZAP-70 au complexe RCT/CD3
• ZAP phosphoryle différents adapteurs
• Les adapteurs propagent le signal vers les 3 voies principales de signalisation -ras-map kinase -PLCg₁ (calcineurine,PKC) -PI-3K

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils être plus sensibles à leur antigène?

• Organisation en nanogroupe du RCT chez les cellules T mémoire

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils être plus sensibles à leur antigène?

• L'organisation des nanogroupes de RCT augmente la sensibilité.
• Le cluster TCR indépendant de l'activation inclut le nano cluster T cell et le TCR nanocluster.
• Pour les cellules naïves, la direction est lente.
• Pour les cellules mémoires, la direction est forte.
• Le cluster TCR dépondant de l'activation inclut le T cell et le TCR microcluster APC.
• Il y a une forte stimulation et une formation de cSMAC.

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils répondre plus rapidement?

• Grâce à l'augmentation du nombre de cellules T exprimant un RCT spécifique de l'antigène
• Ouverture de la chromatine au sein des gènes codant pour les molécules effectrices
• Transcription constitutive des gènes codant pour les molécules effectrices

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils répondre plus rapidement?

• Transcription constitutive des gènes codant pour certaines molécules effectrices
• La production de la protéine nécessite une stimulation avec l'antigène

Comment les lymphocytes T mémoire peuvent-ils répondre plus rapidement?

• Transcription de certains gènes codant pour les fonctions effectrices chez les lymphocytes T mémoire (ex IFN-γ, perforine)

• Induction plus rapide de la transcription des gènes codant pour les fonctions effectrices(IL-2, IL-4, IL-5, chémokines…)

• Modification de la structure de la chromatine qui permet de maintenir la transcription ou de l'induire rapidement

• Les lymphocytes T mémoire peuvent être activés par les signaux innés

• Ces signaux incluent LCMV, MCMV et plasmodia.

• Ces signaux activent le monocyte Ly6C+CD11b+CCR2 pour se lier à la cellule NK et au lymphocyte T mémoire CD8+.

Caractéristiques des lymphocytes T mémoire

• Réponse plus sensible et plus rapide
  • Augmentation du nombre de cellules T spécifiques pour l'antigène (jusqu'à 1000X)
  • Réorganisation du RCT et sa machinerie de signalisation.
  • Réorganisation de la chromatine au locus de certains gènes( expression constitutive de l'ARNm de l'IFN-gamma, perforine…; induction plus rapide de la transcription de certains gènes codants pour des molécules effectrices; production de la protéine requiert la stimulation antigénique)
  • Réponse aux signaux innés -Présence dans les tissus périphériques non lymphoïdes

Caractéristiques des lymphocytes T mémoire

• Localisation dans les tissus et les organes lymphoïdes secondaires

• Les sous-types de lymphocytes T mémoire qui ont accès aux tissus ont modifié l'expression de certaines molécules de surface qui participent à l'adhésion et à la chimiotaxie

• Une sous-population de lymphocytes T mémoire réside dans les tissus (TRM)

• Une sous-population de lymphocytes T mémoire recircule dans le sang et les tissus (TEM)

• Une sous-population de lymphocytes T mémoire circule dans les organes lymphoides secondaires (TCM)

• L'expression différentielle des récepteurs aux chémokines et des molécules d'adhésion dicte la localisation et la circulation des sous-populations de lymphocytes T mémoire.

• TCM : cellules T mémoire centrales, l'expression de CCR7 et CD62L permet leur localisation dans les ganglions lymphatiques.

• TEM : cellules T mémoire effectrices, l'absence de CD62L et CCR7 empêche leur entrée dans les ganglions lymphatiques et elles circulent dans le sang, la rate et le foie.

• TRM : cellules T mémoire résidentes, l'absence de CD62L et CCR7 empêche leur entrée dans les ganglions lymphatiques et l'expression de différents récepteurs au chémokine et différentes molécules d'adhésion permet leur migration et rétention dans les tissus.

  • Exemples de tissus : peau, poumon, intestin, cerveau, muqueuse vaginale, cad site entrée des pathogènes
    • Exemples spécifiques : l'intestin exprime CCR9 et a4ẞ7 alors que la peau exprime CCR4, CCR10 et CLA

• Les TRM dans les tissus déclenchent l'alarme pour recruter les cellules T mémoire circulantes.

• Les TRM participent également directement au contrôle du pathogène.

• Jour 4-5 suivant l'infection: réponse primaire

• Immédiat: réponse secondaire

Sous-populations de lymphocytes T mémoire

• Les types de cellules, le phénotype, la localisation et les propriétés fonctionnelles varient dans les lymphocytes T mémoire.
• TCM cellule: CD62LhiCCR7hi phénotype, se trouve dans les ganglions lymphatiques, la rate, le sang, a un potentiel prolifératif, une production accru de IL-2, une migration accrue et une diminution des fonctions d'effecteur et de la cytotoxicité.
• TEM cellule: CD62LlowCCR7low phénotype, se trouve dans la rate, le sang et le foie, a un potentiel prolifératif diminué, une production diminué de IL-2, une migration accrue et une augmentation des fonctions d'effecteur et de la cytotoxicité.
• TRM cellule: CD103hiCD69hiCD62LlowCD27low phénotype(l'expression du récepteur chémochine spécifique à la peau et de l'intégrine), se trouve dans la peau, les poumons, l'intestin, le cerveau, a un potentiel prolifératif diminué, une production diminuée de IL-2, une migration diminuée et une augmentation des fonctions d'effecteur et de la cytotoxicité.

Caractéristiques des lymphocytes T mémoire

• Durée de vie très longue.
• Réponse à des facteurs de survie comme IL-7 et IL-15.
• Auto-renouvellement -Une division homéostatique à tous les 10-14 jours -Acquisition d'un programme génique semblable aux cellules souches hématopoïétiques -IL-15, WNT et les lymphocytes T CD4+ promeuvent l'auto-renouvellement.

Comparaison des caractéristiques des les lymphocytes T naïfs, effecteurs et mémoire

• La costimulation varie avec le type de cellule.
  • Le lymphocyte T naïf requiert une costimulation (CD28/B7).
  • Lymphocytes T effecteur n'en requiert aucune.
  • Lymphocytes T mémoire n'en requiert aucune.
• Le temps requis pour l'activation varie avec le type de cellule
  • Le lymphocyte T naïf prend 24 à 48 heures.
  • Les lymphocytes T effecteur et mémoire prennent moins d'une heure.
• La localisation varie avec le type de cellule
  • Le lymphocyte T naïf se trouve dans les organes lymphoïdes secondaires.
  • Les lymphocytes T effecteur se trouvent dans les tissus périphériques, sites inflammés et organes lymphoïdes secondaires.
  • Les lymphocytes T mémoire se trouvent dans les tissus périphériques, sites inflammés, le sang et les organes lymphoïdes secondaires.
• La longévité varie avec le type de cellule
  • Le lymphocyte T naïf dure 5-7 semaines.
  • Le lymphocyte T effecteur dure 2 à 3 jours.
  • Le lymphocyte T mémoire dure jusqu'à 50 ans.

Développement des lymphocytes T mémoire

• Un lymphocyte T naïf est activé par un Ag, ce qui cause l'expansion
• L'expansion mène à la formation des lymphocytes T effecteurs
• Une contraction se produit suite à l'apoptose
• L'apoptose des lymphocytes T effecteurs résulte en lymphocytes T mémoire
• Quels signaux dictent le devenir des lymphocytes T effecteurs?
• Quels signaux contrôlent le développement des lymphocytes T mémoire?

Comment identifier les cellules T effectrices qui vont survivre à la phase de contraction et se différencier en lymphocytes T mémoires?

• Une sous-population de cellules T CD8 est responsable de la production de cellules T mémoire

• Seul le transfert des cellules IL-7Rhi-CD8 T dans des souris naïves a mené à une expansion robuste des cellules CD8 spécifiques à l’antigène suite à une attaque secondaire

• Il existe 2 sous-populations de lymphocytes T effecteurs

  • SLEC : cellules effectrices à courte durée de vie
  • MPEC : cellules effectrices précurseurs des cellules à mémoire

• Les SLEC(KLRG-1+CD127faible) éliminent l’agent infectieux

• Les MPEC(KLRG1-CD127fort) sont des cellules T mémoire assurant la protection contre la réinfection

L'aide CD4 est indispensable à la formation fonctionnelle des lymphocytes CD8+ de mémoire

• Les souris de type sauvage ou les souris dépourvues de lymphocytes CD4 T sont infectées par une infection bactérienne exprimant un antigène d’ovalbumine OVA
• Après 7 jours d'infection, les deux types de souris ont augmenté un nombre similaire de lymphocytes CD8 T spécifiques d'OVA
• Après 70 jours, les souris ont été réinfectées, et seul les souris de type sauvage peuvent élargir les cellules à mémoire spécifiques à l’OVA

Quels sont les signaux qui contrôlent la différenciation des effecteurs dans SLEC et le MPEC?

• signaux inflammatoires : Cytokines !
• Courte durée de vie : effecteur
• Mémoire : précurseur
• IL-12 IFN-1 :IL-2
• SLECMPEC

Comment l'inflammation et l'IL-2 contrôlent le choix de la différenciation des effecteurs?

• Par l'expression de facteurs de transcription
• Beaucoup d'inflammation: expression élevée de T-bet et faible de Eomes et BCI-6
• Beaucoup d'IL-2: expression élevée de Blimp-1
• Peu d'inflammation: expression faible de T-bet et élevée de Eomes et BCI-6
• Peu d'IL-2: faible de Blimp-1

Méthodes expérimentales permettant le suivi de la réponse des lymphocytes T in vivo

• Tétramères de molécules de classe I liés au peptide antigénique

• Les tétramères sont fait des molecules MHC, des peptides, TCR, CD8, et des streptavidins.

• Faible liaison, pas d'internalisation, pas de coloration

• Liaison spécifique, avec internalisation

• N.B. Réactifs équivalents pour détecter les lymphocytes T CD4+ spécifiques à un antigène donné

• Suivi de la réponse des lymphocytes T CD8+ suite à une infection avec la bactérie Listeria monocytogenes exprimant l'antigène OVA

• N1N2Δ/Δ pour l'infection bactérienne Listeria monocytogenes exprimant l'antigène OVA

• Marquage des cellules T de la rate avec le tétramère Kb-OVA(tet-OVA)

• Suivi des marquages CD44 Tet OVA

• Transfert adoptif de lymphocytes T exprimant un RCT dont la spécificité antigénique est connue

• 104 cellules T RCT transgéniques naïves (CD45.2+)

• Cellules T effectrices (CD45.2+CD44)

• 5-14 jours

• Injection dans une souris RCT transgénique B6.SJL (CD45.1+)

• Cellule T mémoire (CD45.2+CD44+LY6C (high))

• Après 30 jours

• Transfert adoptif de lymphocytes T exprimant un RCT dont la spécificité antigénique est connue

• Marqueurs : Immunisation, sans immunisation

• Lymphocytes T effecteurs

• CD8, CD44, CD45.2

• Jour 7

• Lymphocytes T mémoires

• LY6C

• Jour 60

• Marquage intracellulaire pour la détection des cytokines

• Les cellules T activées sont traitées avec un inhibiteur qui bloque l'exportation des protéines, permettant aux cytokines de s'accumuler dans le RE.

• La cellule est fixée et perméabilisée avec des détergents doux.

• Des anticorps spécifiques aux cytokines pénètrent dans la cellule pour lier les molécules de cytokine intracellulaires.

• Principe qui permet l'identification des cellules T spécifiques à l'antigène d'intérêt

• re-stimulation antigénique in vitro sur une courte période (4 à 6 heures)

• permet seulement d'induire la production de cytokines (4 à 10 heures) par les cellules effectrices ou mémoires

• Production de la cytokine interféron-gamma par les lymphocytes T CD8+ effecteurs spécifiques pour l'antigène OVA

• Jour 7 post-infection Listeria-OVA

• Courte restimulation in vitro avec OVA

• Marquage intracellulaire anti-cytokine

Modèles de développement des lymphocytes T mémoire

• Linéaire ou bilinéaire
• APC + antigène devient un lymphocyte T naïf
• asymétrique
• précurseur de lymphocytes T effecteurs, les lymphocytes T mémoire précurseurs produisent prolifération secondaire
• les lymphocytes T effecteurs produisent prolifération secondaire
• lymphocytes T mémoire effectrice
• lymphocytes T centrales

Preuve expérimentale en faveur du modèle de différenciation linéaire

• Transfert des effecteurs permet le développement de lymphocytes T mémoire
• Différenciation programmée des cellules T naïves suite à la reconnaissance antigénique
• Pendant la phase de contraction, acquisition graduelle du programme d'expression génique des lymphocytes T mémoire
• Traçage génétique

Évidences expérimentales récentes en faveur du modèle de différenciation linéaire

• Modèle permettant le marquage permanent des lymphocytes T effecteurs
• Utilisant GzmBCreERT2 souris
• Avec ROSA
• STOP
• EYFP
• ROSA 26 EYFP = souris

Évidences expérimentales récentes en faveur du modèle de différenciation linéaire

• Est-ce que les effecteurs marqués deviennent des cellules mémoire?

• Présence de cellules T marquées au stade mémoire

• Les cellules T marquées participent à la réponse secondaire

• Lung , MLN, Spleen avec Day 10, 49, 49+7

Évidences expérimentales en faveur du modèle de différenciation binaire

• Division asymétrique
• Les protéines synaptiques et de polarité se regroupent à certains pôles cellulaires

Évidences expérimentales en faveur du modèle de différenciation binaire

• La division asymétrique lors de la reconnaissance antigénique détermine si une cellule devient une cellule mémoire ou non.
• Cell size
• Granul
• CD62L
• CD69
• Distal/prox

Évidences expérimentales en faveur du modèle de différenciation binaire et de la division asymétrique

• Analyse de l'expression génique d'une cellule au cours de la réponse
• Profil lors de la première division
• Destin différent des cellules filles
• Répartition asymétrique lors de la première division