Inmunología: Capacidades de Fagocitos

UT5. Valoración de la funcionalidad de la inmunidad celular

• Los linfocitos son responsables de la inmunidad específica.
• Estudiar los linfocitos es fundamental para comprender el sistema inmunitario.
• Los estudios incluyen pruebas de funcionalidad y cuantificación.
• Para realizar estudios es necesario separar los linfocitos del resto de componentes sanguíneos.

Técnicas de Separación de Linfocitos

• El gradiente de Ficoll es la técnica más habitual para obtener preparaciones de linfocitos purificados o enriquecidos para técnicas in vitro.
• La sangre total desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se vierte en un tubo hasta la mitad con Ficoll.
• La centrifugación separa los linfocitos.
• La separación produce leucocitos mononucleares (linfocitos y monocitos), siendo los linfocitos más abundantes en la sangre periférica.

El medio de Separación (Gradiente de Ficoll)

• El medio presenta un gradiente discontinuo con dos componentes:
  • Ficoll 400: Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina de 400 kDa, soluble en agua. Tiene mayor densidad que los linfocitos, pero menor que los eritrocitos y granulocitos. Produce aglutinación de eritrocitos.
  • Diatrizoato de sodio: Mezclado con Ficoll, crea soluciones de baja viscosidad y alta densidad. Proporciona la densidad óptima para la separación celular y la osmolaridad necesaria para la viabilidad celular.

Preparación del medio

• Preparar una disolución al 14% p/v de Ficoll 400 agitando durante toda la noche a temperatura ambiente.
• Mezclar 12 partes de solución de Ficoll con 5 partes de diatrizoato de sodio al 32.8%.
• Ajustar la densidad y osmolaridad del medio.
• Esterilizar por filtración.
• Conservar a 4°C en oscuridad (el diatrizoato de sodio es fotosensible).
• Existen preparaciones comerciales disponibles.

Fundamento del Proceso

• La centrifugación de la sangre desfibrinada en el medio de separación permite la separación de los componentes.
  • Los granulocitos, más densos que el medio de separación, pasan a través de él y se depositan en el fondo.
  • Los eritrocitos, que se aglutinan al contacto con el Ficoll, se depositan en el fondo también.
  • Las células mononucleares (linfocitos y monocitos) permanecen en la interfase entre el plasma y el medio de separación debido a su menor densidad.

Observación de las fases

• Después de la centrifugación, se observan tres fases:
  • La superior: Plasma
  • La intermedia (blanca): Células mononucleadas
  • La inferior (rojiza): Sedimento de eritrocitos y granulocitos.

Procedimiento para obtener las células purificadas

• Preparar el medio o utilizar el medio comercial.
• Diluir 2ml de sangre total (EDTA) con otros 2ml de medio de cultivo sin suero (Ej: RPMI).
• Colocar la sangre diluida sobre el medio de separación sin mezclar.
• Centrifugar durante 20 minutos a 400 xg a temperatura ambiente con rotor oscilante.
• Separar en las 3 fases; la superior se desecha, la intermedia se recoge y se transfiere a un tubo separado, y la inferior se desecha.

Procedimiento detallado (continuación del paso 5)

• Añadir 10 ml de medio sin suero a la fase intermedia (linfocitos recuperados) y suspender.
• Lavar las células por centrifugación (utilizando 100 xg durante 10 minutos), eliminando el sobrenadante. Repetir el proceso.
• Añadir medio de cultivo adecuado (Ej: RPMI con suero bovino) para conservar las células.
• Cuantificar la viabilidad celular y efectuar el recuento (utilizando azul de tripán para diferenciar las células vivas de las muertas).

Estudio de la funcionalidad de los Linfocitos B

• Se puede estudiar la funcionalidad induciendo la mitosis in vitro de los linfocitos.
• Se realizan estudios in vitro que reflejan los mecanismos de activación celular y proliferación de los linfocitos B a lo largo de la respuesta inmunológica in vivo.
• La producción de anticuerpos es un indicador importante de la funcionalidad de los linfocitos B. Esta función ayuda al diagnóstico de inmunodeficiencias.
• La determinación de la producción de anticuerpos se realiza cuantificando las inmunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) mediante diferentes métodos (inmunodifusión radial, turbidimetría)

Estudio de la funcionalidad de los Linfocitos T

• El nivel de proliferación de los linfocitos T se estudia utilizando diferentes técnicas.
• Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos.
• Estudio de proliferación mediante citometría de flujo.
• Valoración de citoquinas.
• Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada.

Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos

• Los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno se transforman en linfoblastos que se dividen activamente. El cultivo se hace en presencia del mitógeno.
• La proliferación de linfoblastos implica síntesis de ADN que se mide a través de la incorporación de timidina tritiada a las células.
• La tasa de incorporación se utiliza para determinar la funcionalidad de los linfocitos T.

Procedimiento para proliferación en respuesta a mitógenos

1. Separar los linfocitos por centrifugación con Ficoll y Diatrizoato.
2. Lavar varias veces los linfocitos con medio de cultivo celular.
3. Efectuar recuento y ajustar a una concentración de 5 a 10 células/ml, añadiendo más o menos medio de cultivo según sea necesario.
4. Dispensar en una placa de microtitulación de 96 pocillos.
5. Incluir la solución de antígenos, con excepción de los pocillos de control.
6. Incubar 72 horas a 37°C en atmósfera de CO2.
7. Añadir Timidina tritiada a todos los pocillos e incubar 16 horas.
8. Recoger las células sobre filtros de fibra de vidrio y colocarlas en viales con líquido de centelleo para medir la radioactividad.
9. Calcular la tasa de proliferación, comparando la radioactividad de las células estimuladas y el control.

Estudio de proliferación mediante citometría de flujo

• Se utiliza un marcador en los linfocitos y se mide la reducción de la intensidad de la señal de fluorescencia.
• Esta reducción es proporcional a la actividad mitógena.

Valoración de citoquinas

• Se analizan los sobrenadantes de los cultivos estimulados con antígenos o mitógenos para determinar la presencia de citoquinas.
• Se realiza mediante un ELISA en sándwich de dos anticuerpos:
  • Tapizar las placas con un anticuerpo monoclonal frente a la citoquina.
  • Añadir la muestra y lavar.
  • Añadir otro anticuerpo monoclonal (marcado con biotina) frente a la citoquina.
  • Incubar y lavar.
  • Añadir el conjugado.
  • Incubar a temperatura ambiente y lavar.
  • Añadir el sustrato e incubar a temperatura ambiente hasta que el color se desarrolle.
  • Cuantificar el color con un lector de placas. Se usa una curva patrón para valorar los resultados, considerando positivos los valores que superan en 3 desviaciones el valor medio de los controles negativos.

Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada

• La prueba consiste en la inoculación intracutánea de antígeno PPD (derivado proteico purificado).
• Se observa la zona de inyección tras 48-72 horas.
• La prueba es positiva si aparece una pápula de más de 2 mm de diámetro.
• Un resultado positivo puede indicar algún tipo de inmunodeficiencia.

Deficiencias del sistema inmune

• Se presentan cuadros de deficiencias inmunes en categorías:
  • Congénitas: Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral (Ataxia-telangiectasia, síndrome de Nezelof, inmunodeficiencia combinada severa, síndrome de Wiskott-Aldrich), Celulares (síndrome de DiGeorge, candidiasis monocutánea)
  • Adquiridas: Síndrome de inmunodeficiencia adquirida, sarcoidosis, leucemia linfocítica crónica, carcinoma.

Cuantificación de Linfocitos

• Los linfocitos no son distinguibles morfológicamente. Este es el motivo por el que se utilizan métodos de laboratorio para detectar proteínas marcadoras de sus membranas para diferenciarlos.
• Se utilizan técnicas manuales de inmunofluorescencia directa y recuento microscópico; sin embargo, la citometría de flujo es una técnica que se utiliza para cuantificar linfocitos B.
• Técnica de formación de rosetas-E: Técnica barata y sencilla para cuantificar linfocitos T. Usa eritrocitos de carnero para formar rosetas con linfocitos T viables (utilizando CD2 y LFA-3).
• Prueba de citotoxicidad por liberación de cromo: Detecta linfocitos T citotóxicos (CD8+) capaces de lisar células diana que expresan un antígeno específico marcando las células diana con un isótopo radiactivo (Cr).

Estudio de células fagocíticas

• Los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) son componentes esenciales del sistema inmunitario innato.
• Se evalúa la funcionalidad mediante métodos que incluyen:
  • Evaluación de la capacidad fagocítica.
  • Evaluación de la activación de los fagocitos.
  • Evaluación de la actividad microbicida.
  • Ensayos de quimiotaxis.

Evaluación de la capacidad fagocítica

• Se incuba una fracción de leucocitos con partículas inertes (microesferas de látex o microorganismos como bacterias o levaduras) para permitir la fagocitosis.
• Posteriormente se cuantifica la fagocitosis.
• Se evalúan las células teñidas para distinguir entre las partículas fagocitadas y las moléculas adheridas a la superficie.
• Se puede usar citometría de flujo con colorante fluorescente.

Evaluación de la activación de los fagocitos (Prueba de Reducción del NBT)

• Se realiza mediante la prueba de reducción de NBT (azul de tetrazolio nitrado).
• Permite evaluar el estallido respiratorio de los fagocitos, una respuesta a la activación.
• Induce la producción de aniones superóxido a partir de proteínas de membrana y citoplasma (sistema NADPH oxidasa).
• El NBT se reduce a un cristal de formazán de color púrpura oscuro en los fagocitos que han realizado el estallido respiratorio.

Evaluación de la actividad microbicida

• Se incuba a los fagocitos con microorganismos (bacterias o levaduras), a una concentración conocida.
• A continuación, se cuenta la viabilidad residual del agente microbiano.
• Permite evaluar la capacidad de destrucción de los fagocitos. En la actividad se observa la reducción en el número de agentes patógenos.

Ensayos de quimiotaxis

• Se evalúa la capacidad de locomoción direccional de los neutrófilos en respuesta a estímulos.
• Se utilizan cámaras aisladas separadas por un filtro. Las células se colocan en una cámara y el estímulo en otra.
• Se analiza el movimiento de las células a través del filtro hacia el estímulo.
• El dispositivo más utilizado es la cámara de Boyden.

Estudio del Complemento

• El sistema del complemento es un conjunto de proteínas plasmáticas que se activan en cascada en respuesta a diferentes estímulos.
• Su función principal es la lisis de las membranas de los agentes patógenos.
• También promueve procesos inflamatorios y colabora en la fagocitosis y eliminación de inmunocomplejos.
• Los defectos en el sistema del complemento pueden producir inmunodeficiencias y enfermedades autoinmunes.
• El sistema se activa a través de tres vías: clásica, alternativa y lectinas.

Estudio del Complemento (pruebas de evaluación)

• Se pueden evaluar las alteraciones del complemento mediante pruebas funcionales y pruebas inmunoquímicas.
  • Cuantificación de las fracciones C3 y C4.
  • Análisis de la vía clásica:
    • Técnica CH50: Se mezcla suero fresco con eritrocitos sensibilizados. La vía clásica activa y se mide, por la cantidad de suero involucrada, la cantidad de complemento.
    • Técnica de hemólisis en gel de agarosa: Se prepara un gel de agarosa con eritrocitos sensibilizados. Se incuba una muestra con complemento y se observa un halo de lisis de los eritrocitos, proporcional a la concentración de complemento. 

Cuantificación de C3 y C4

• La cuantificación de los componentes C3 y C4 (que activan los fagocitos) se realiza mediante técnicas como la inmunodifusión radial.
• Inconvenientes de ellas: Miden tanto los componentes funcionales como los inactivados y fragmentos degradados.

Otros datos relevantes

• Existen diferentes técnicas para separar las diferentes poblaciones de linfocitos.