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Formazione del complesso Ag-Ab e reazione di equilibrio

• Gli anticorpi (Ab) sono proteine appartenenti al gruppo delle immunoglobuline.
• Gli Ab sono classificabili in cinque classi: IgG, IgA, IgM, IgE e IgD.
• Gli IgG sono strutturalmente più semplici, composti da quattro catene polipeptidiche, due leggere e due pesanti, uguali a due a due.

Formazione dell'immunocomplesso

• Il legame tra un antigene (Ag) e il suo anticorpo (Ab) corrispondente porta alla formazione di un immunocomplesso.
• L'unione Ag-Ab è altamente specifica.
• Questa reazione è regolata da forze chimico-fisiche non covalenti che agiscono tra i determinanti dell'antigene e dell'anticorpo (forze di Coulomb, forze di Van der Waals, legami H).

Metodi immunochimici

• Sfruttano le caratteristiche di selettività e avidità del legame Ab-Ag per quantificare l'analita in matrici complesse.
• L'avidità del legame Ag-Ab si misura con la costante di affinità Kaff, una costante termodinamica di equilibrio Keq.
• Un Ab è considerato idoneo per metodi immunochimici se ha un valore Keq tra 10^9 e 10^12 M^-1.
• Ka e Kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso, mentre Keq è la costante di equilibrio del processo.
• L'affinità dell'Ab per l'analita si determina tramite il diagramma di Scatchard, ottenuto incubando quantità crescenti di analita con una quantità costante di Ab e misurando in condizioni di equilibrio la formazione del complesso AgAb (Ag libero e legato all'Ab).
• La concentrazione totale di Ab, Abₜ, è data dalla somma di [Ab]eq e [AgAb]eq.

Diagramma di Scatchard

• È un grafico che mette in relazione [AgAb] (legato) sull'asse delle ascisse e il rapporto sull'asse delle ordinate.

Sensibilità del metodo

• Le caratteristiche dell'Ab usato in un saggio immunochimico determinano la sensibilità del metodo e l'intervallo di concentrazioni di [Ag] misurabili.
• Un Ab con una costante di affinità maggiore rispetto a un altro, a parità di concentrazione, produce un segnale analitico più intenso alla stessa concentrazione di [Ag].

Metodi immunochimici senza tracciante

• In queste determinazioni, la formazione del complesso AgAb è evidenziata direttamente, senza separare le forme legate e non legate.
• Se la concentrazione è sufficientemente alta, i complessi sono visibili a occhio nudo.
• Per concentrazioni inferiori, si sfrutta la loro capacità di deviare un raggio luminoso per la quantificazione.
• I metodi senza tracciante includono tecniche come agglutinazione, precipitazione e l'uso di immunosensori (es. resonant mirror biosensor, surface plasmon resonance).

Fotometria

• Oltre all'assorbimento, si possono sfruttare altri fenomeni come riflessione, assorbimento, rifrazione e diffrazione.
• La riflessione fenomeno per cui un'onda, quando colpisce l'interfaccia tra differenti mezzi, cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza
• La rifrazione è la deviazione di un'onda che passa da un mezzo a un altro. Dipende dall'indice di rifrazione del mezzo attraversato.
• La diffusione (o scattering) è un fenomeno in cui le particelle vengono deviate (cambiano traiettoria) a causa di collisioni con altre particelle.
• La diffrazione si verifica quando un'onda incontra un ostacolo o fenditura con dimensioni simili alla sua lunghezza d'onda.
• La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta (assorbanza).
• La luce può essere emessa da una sostanza che assorbe a una certa lunghezza d'onda e la riemette a un'altra (fluorescenza).
• La luce può essere diffusa o rifratta da particelle in sospensione (turbidimetria o nefelometria).

Turbidimetria e nefelometria

• Tecniche immunochimiche attuali che valutano la luce diffusa in sistemi eterogenei come soluzioni colloidali o sospensioni.
• Si applicano a tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida.
• Maggiore concentrazione dell'analita corrisponde ad un maggior numero di particelle che impediscono al luce di passare attraverso la soluzione, aumentando cosi la quantita di luce riflessa
• Si tratta di metodi nei quali luce può essere assorbita in modo significativo, attenuando l'intensità del raggio durante il percorso.
• La luce è significativamente diffusa dalle particelle in sospensione, anche con il contributo dei fenomeni di riflessione e rifrazione derivanti da parte delle particelle, noto come effetto Tyndall.
• Le particelle nei colloidi sono abbastanza grandi da disperdere un raggio di luce, questo puo essere osservato dal lato.

Misura turbidimetrica

• Si misura l'intensità della luce trasmessa attraverso una sospensione, usando colorimetri o spettrofotometri UV-VIS.
• In turbidimetria, il rilevatore è allineato con la luce incidente e la luce rilevata diminuisce con l'aumento delle particelle di analita.

Misura nefelometrica

• Si valuta la luce diffusa da una sospensione a 90° rispetto alla radiazione incidente.
• Il rilevatore è posizionato a 90° rispetto al raggio entrante per evitare il rilevamento della luce diretta.
• Le misure nefelometriche sono molto sensibili e condizionate da fattori come il pH del mezzo e la presenza di interferenti.

Spettroscopia di riflettanza

• Si applica per determinare analiti che formano una sostanza colorata su una striscia reattiva (chimica secca) o per la lettura di strisce con fasi separate e colorate (elettroforesi).
• Il principio si basa sulla variazione dell'intensità della luce riflessa a una specifica lunghezza d'onda da una superficie dove è avvenuta una reazione chimica.
• Studia la luce riflessa o diffusa da un solido in funzione della lunghezza d'onda.
• Il campione assorbe parte della luce incidente, riducendo l'intensità della luce riflessa.
• DRY CHEMISTRY:Reazioni cromogene su supporti solidi (cellulosa modificata o altri materiali

Zone reattive delimitate

• Analita nel fluido biologico
• Intensità della colorazione in funzione della concentrazione dell'analita
• Misure della luce riflessa
• Analisi quantitativa

Vantaggi della spettroscopia di riflettanza

• Possibilità di applicare reattivi diversi in zone diverse dello stesso supporto (strisce ad immersione per l'analisi delle urine). -
• Reattivi nel supporto allo stato secco (facilità di conservazione).
• I reattivi possono essere stratificati e separati (dissoluzione solo al momento dell'analisi).
• La zona reattiva può essere costruita per assorbire una quantità standard di campione.

Applicazioni della spettroscopia di riflettanza

• Include la misurazione di glucosio, colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi, creatinina, enzimi (GOT, GPT), emoglobina, anaboliti/cataboliti nelle urine.
• Dosaggio qualitativo della malaria
• Dosaggio quantitativo di vari analiti nel sangue
• Determinazione di alcuni analiti presso studi medici
• Determinazione di alcuni analiti in veterinaria

Kodak Ektachem

• La tecnica dry chemistry sviluppata dalla Kodak, e adattata a strumentazione di laboratorio per grossa routine, è impiegata largamente per l'esecuzione del test al letto del paziente e per il POINT OF CARE TESTINTG (P.O.C.T.).
• La tecnica si basa su LASTRE O STRISCE a vari strati chimici
• Ektachem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio che usa una tecnologia a vetrino secco per test quantitativi automatizzati su piccoli volumi di campione.
• Fornisce misurazioni rapide e affidabili di analiti come enzimi, elettroliti e marcatori biochimici.

Strati chimici della lastra

• Strato di diffusione: porosità isotropica e distribuisce uniformemente il campione trattenendo molecole (proteine, lipidi, pigmenti).
• Strato di reagenti: contiene reagenti specifici (completi o parziali) dove avviene la reazione.
• Membrana semipermeabile: consente il passaggio solo del prodotto intermedio di reazione.
• Strato indicatore: contiene il reattivo finale che porta al colore.
• Supporto trasparente: pellicola per la lettura fotometrica (per riflessione).

Determinazione semi-quantitativa in dry chemistry

• L'applicazione più diffusa in questo contesto è l'utilizzo delle strisce reattive per la determinazione dei caratteri chimici delle URINE.
• Una goccia di campione di urina reagisce su un supporto imbevuto del reagente specifico
• Il colore risultante viene poi letto, mediante riflessione, con l'utilizzo di sistemi a fibre ottiche.
• In questa determinazione, l'intensità del colore risulterà proporzionale alla concentrazione dell'analita.

Vantaggi della chimica secca

• Agevola lo smaltimento dei rifiuti (solo solidi)
• Rapidità di esecuzione e di ottenimento del dato analitico

Svantaggi della chimica secca per le determinazioni quantitative

• Pochi produttori sul mercato (monopolio)
• Rigidità delle calibrazioni per ogni serie di lastre o strisce
• Sistema rigorosamente "chiuso"