Lezione 4 - Riassunto dei Complessi Ag-Ab e della Turbidimetria PDF

Lezione 4 Serena Bonin FORMAZIONE DEL COMPLESSO Ag-Ab E REAZIONE DI EQUILIBRIO Gli Ab sono proteine del gruppo delle Immunoglobuline Gli Ab sono classificabili in 5 classi: IgG, IgA, IgM, IgE e IgD. Quelli strutturalmente più semplici sono le IgG: 4 catene polipeptidiche – 2 leggere e 2 pesanti...

Lezione 4 Serena Bonin FORMAZIONE DEL COMPLESSO Ag-Ab E REAZIONE DI EQUILIBRIO Gli Ab sono proteine del gruppo delle Immunoglobuline Gli Ab sono classificabili in 5 classi: IgG, IgA, IgM, IgE e IgD. Quelli strutturalmente più semplici sono le IgG: 4 catene polipeptidiche – 2 leggere e 2 pesanti, a due a due uguali fra loro FORMAZIONE DEL COMPLESSO Ag-Ab E REAZIONE DI EQUILIBRIO Il legame che si instaura tra un Ag ed il corrispondente Ab porta alla formazione di quello che viene definito IMMUNOCOMPLESSO. Tale unione è altamente specifica ed è regolata da forze di tipo chimico- fisico (legami di natura non covalente) che agiscono tra i determinanti dell’antigene e dell’anticorpo (Forze di Coulomb, Forze di Van der Waals, legami H); FORMAZIONE DEL COMPLESSO Ag-Ab E REAZIONE DI EQUILIBRIO I metodi immunochimici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e avidità del legame fra Ab e Ag, consentono di realizzare metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita anche in matrici complesse. L’avidità del legame Ag-Ab si misura con la cosatnate di affi nità Kaff , che è una costante termodinamica di equilibrio K eq. Un Ab è idoneo per lo sviluppo di metodi immunochimici se ha un valore di Keq di 10 -10 M 9 12 -1 Ka Kd Ab + Ag AbAg Keq = = FORMAZIONE DEL COMPLESSO Ag-Ab E REAZIONE DI EQUILIBRIO Ka e Kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo. L’affi nità dell’Ab per l’analita può esser determinata dal diagramma di Scatchard che si ottiene sperimentalmente incubando quantità crescenti di analita con una quantità costante di Ab e misurando in condizioni di Eq della reazione di formazione del complesso AgAb, la [Ag] libero e legato all’Ab: = Keq Abt – Keq [AgAb]eq La conc totale di Ab, Ab t = [Ab]eq + [AgAb]eq DIAGRAMMA DI SCATCHARD Abt = [Ab]eq + [AgAb]eq Il diagramma di Scatchard è un plot che riporta in ascisse la [AgAb] (legato) e in ordinata il rapporto fra Ag legato e libero. Ab Monoclonale Ab Policlonale Le caratteristicher dell’Ab usato in un saggio immunochimico è determinante per valutare la sensibilità del metodo e quindi l’intervallo di [Ag] misurabili Un Ab con > costante di affinità rispetto ad un altro, a parità di concentrazione fa registrare un segnale analitico più intenso alla medesima [Ag].  METODI IMMUNOCHIMICI SENZA TRACCIANTE Nelle determinazioni immunochimiche senza tracciante (label -free) la formazione del complesso AgAb viene evidenziata direttamente, senza dover separare le forme di Ag e Ab non legate. PRINCIPIO ANALITICO METODO Agglutinazione Emoagglutinazione Agglutinazione al lattice Precipitazione Rocket immunoelettroforesi Immunoturbidimetria /Nefelometria Immunosensori Resonant mirror biosensor Surface plasmon resonance In questi metodi se la conc è sufficientemente elevata, i complessi sono evidenziabile a occhio nudo. Per concentrazioni inferiori si quantificano sfruttando la loro capacità a deviare un raggio luminoso.  FOTOMETRIA Oltre all’assorbimento della radiazione esistono altri fenomeni che possono essere sfruttati per le misure  Titolo principale RIFLESSIONE: è il fenomeno per cui un’onda, quando colpisce l’interfaccia tra differenti mezzi, cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza RIFRAZIONE: è la deviazione subita da un’onda quando passa da un mezzo ad un altro (ad es. da un mezzo meno denso ad uno più denso e dipende dall’indice di rifrazione del mezzo stesso) DIFFUSIONE: o scattering, è un fenomeno in cui le particelle vengono deflesse (cambiano traiettoria) a causa della collisione con altre particelle DIFFRAZIONE: quando un’onda incontra un ostacolo o una fenditura, che abbia dimensioni simili alla sua lunghezza d’onda, avviene la diffrazione.  La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta nella soluzione (assorbanza) La luce può essere emessa da una sostanza che assorbe la luce su una lunghezza La luce può essere d'onda e diffusa o rifratta l'emette su da particelle un'altra lunghezza sospese nella d'onda soluzione (fluorescenza) (turbidimetria o  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA A una maggiore concentrazione dell'analita corrisponde un maggior numero di particelle che impediscono il passaggio della luce attraverso la soluzione facendo aumentare la quantità di luce riflessa TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA sono le tecniche immunochimiche attualmente più utilizzate che non richiedono l’uso di tracciante. Sono tecniche basate sulla valutazione della LUCE DIFFUSA da parte di un sistema eterogeneo quale soln colloidali o sospensioni. Turbidimetria e nefelometria si applicano a tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida.  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Nei colloidi le particelle sono abbastanza grandi da disperdere la luce, perciò quando un raggio di luce le colpisce, un osservatore di CASI LIMITE lato può osservarne  La luce è assorbita in maniera notevole per cui l’intensità del raggio uscente il percorso. è particolarmente attenuata  La luce è notevolmente diffusa dalle particelle in sospensione anche grazie ad un insieme di fenomeni di riflessione e rifrazione da parte delle particelle sospese (effetto Tyndall) originando la cosiddetta luce opalescente Nei colloidi le particelle sono abbastanza grandi da disperdere la luce, perciò quando un raggio di luce le colpisce, un osservatore di lato può osservarne il percorso. In realtà, i due fenomeni limite coesistono sempre, ma con intensità alquanto  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Quando l’assorbimento prevale sulla diffusione, si valuta l’entità dell’assorbimento: MISURA TURBIDIMETRICA In TURBIDIMETRIA si misura l’intensità della luce trasmessa da una sospensione: si possono usare colorimetri o spettrofotomeri UV-VIS. In turbidimetria, il rilevatore viene posizionato in asse con la luce incidente e la luce rilevata diminuisce con l'aumentare delle particelle di analita presenti.  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Quando il fenomeno di diffusione è molto più intenso, es per fasi disperse molto fini, allora si procede alla valutazione della luce diffusa dalla sospensione a 90° rispetto la radiazione incidente e si fa una MISURA NEFELOMETRICA In nefelometria, il rilevatore viene posizionato a 90° rispetto al raggio entrante nella cuvette rispetto al percorso del fascio luminoso, per evitare il rilevamento della luce che passa attraverso il campione. Le misure nefelometriche sono molto sensibili e la loro precisione è condizionata da molti fattori, come il pH del mezzo, la presenza di interferenti o che si possono adsorbire sulle particelle colloidali della sospensione.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Si applica per la determinazione di analiti che, dopo una reazione chimica, formano una sostanza colorata sopra una striscia reattiva (CHIMICA SECCA O DRY CHEMISTRY) oppure per la lettura di strisce ove è stata fatta una separazione di varie fasi, successivamente colorate (ELETTROFORESI). PRINCIPIO: si basa sulla variazione dell’intensità luminosa della luce riflessa (ad una specifica lunghezza d’onda) da una superficie dove è avvenuta una reazione chimica.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Studia la luce in funzione della lunghezza d’onda riflessa o diffusa da un solido Il campione assorbe alcune componenti della radiazione riducendo l’intensità della luce diffusa.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Reazioni cromogene su support solido (cellulose modificata o altri DRY CHEMISTRY materiali) Zone reattive delimitate Analita nel fluido biologico Intensità della colorazione in funzione della concentrazione dell’analita Misure della luce riflessa Analisi Quantitativa SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA VANTAGGI Possibile applicare reattivi diversi in diverse zone dello stesso supporto (strisce ad immersione per l’analisi delle urine) Reattivi nel supporto allo stato secco quindi facilità di conservazione I reattivi possono essere stratificati, quindi separati l’uno dall’altro (dissoluzione solo al momento dell’analisi) La zona reattiva può essere costruita in modo da assorbire una quantità standard di campione  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA APPLICAZIONI Glucosio Colestrerolo totale Colesterolo HDL Trigliceridi Creatinina Enzimi : GOT (AST), GPT (ALT) Emogoblobina Anaboliti e cataboliti vari nelle urine (ac.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA APPLICAZIONI Dosaggio qualitativo della malaria Dosaggio quantitativo di vari analiti nel sangue Determinazione di alcuni analiti presso Studi Medici Determinazione di alcuni analiti in Veterinaria La tecnica dry chemistry (sviluppata dalla Kodak e adattata a strumentazione di laboratorio per grossa routine) viene impiegata largamente per l’esecuzione del test al letto del paziente e per il POINT OF CARE TESTINTG (P.O.C.T.) La tecnica si basa su LASTRE o STRISCE a vari strati.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA La chimica secca Kodak Ektachem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio progettata per l'analisi di vari componenti chimici in campioni clinici. Utilizza una tecnologia a vetrino secco per eseguire test quantitativi automatizzati su piccoli volumi di campione. La funzione principale del sistema Ektachem è quella di fornire una misurazione rapida e affidabile di analiti come enzimi, elettroliti e altri marcatori biochimici in ambito clinico.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA La chimica secca Kodak Ektachem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio progettata per l'analisi di vari componenti chimici in campioni clinici. Utilizza una tecnologia a vetrino secco per eseguire test quantitativi automatizzati su piccoli volumi di campione. La funzione principale del sistema Ektachem è quella di fornire una misurazione rapida e affidabile di analiti come enzimi, elettroliti e altri marcatori biochimici in ambito clinico. https://youtu.be/-AMxY_9sGJI 1) STRATO DI DIFFUSIONE: Ha una porosità isotropica (con proprietà fisiche costanti indipendenti dalla direzione) e serve per distribuire uniformemente il campione sulla superficie della lastra trattenendo molecole, quali proteine, lipidi e pigmenti del siero 2) STRATO DI REAGENTI: su di esso sono presenti i reagenti specifici (completi o parziali) e qui avviene la reazione (finale o parziale), prima del passaggio alla successiva membrana. 3) MEMBRANA SEMIPERMEABILE: Essa consente il passaggio del solo prodotto intermedio di reazione. 4) STRATO INDICATORE: contiene il reattivo finale che porta al colore. 5) SUPPORTO TRASPARENTE: È costituito da una pellicola trasparente attraverso la quale viene effettuata la lettura fotometrica (per riflessione)  DETERMINAZIONE SEMI-QUANTITATIVA IN DRY CHEMISTRY: L’applicazione più diffusa è quella delle strisce reattive per la determinazione dei caratteri chimici delle URINE. PROCEDIMENTO: Una goccia di campione (urina) reagisce su un supporto imbevuto del reattivo specifico; la colorazione che si forma è letta per riflessione mediante l’uso di fibre ottiche, mentre l’intensità del colore sarà proporzionale alla concentrazione dell’analita. VANTAGGI DELLA CHIMICA SECCA: Più agevole lo smaltimento dei rifiuti (solo solidi) Rapidità di esecuzione e di ottenimento del dato analitico SVANTAGGI DELLA CHIMICA SECCA PER LE DETERMINAZIONI QUANTITATIVE: Pochi produttori sul mercato, perciò: monopolio Rigidità delle calibrazioni, per ogni serie di lastre o strisce Sistema rigorosamente «chiuso»