Enzimi chiave e processi nella biologia molecolare

Valutazione della qualità e quantità del DNA: Corsa Elettroforetica

• La valutazione della qualità e quantità del DNA può essere effettuata mediante corsa elettroforetica.
• Gli acidi nucleici, essendo carichi, possono essere separati in un campo elettrico attraverso una matrice porosa.
• Il sistema include una cameretta con 2 elettrodi e un tampone (TAE 1X o TBE1 o 0,5X) con EDTA per evitare degradazione.
• La velocità di migrazione dipende dalla dimensione e, in parte, dalla forma delle molecole.

Matrici Elettroforetiche

• Le matrici possono essere di diversi tipi, tra cui agarosio e acrilammide.

Agarosio

• È un polisaccaride che crea una matrice porosa con pori di dimensione variabile a seconda della quantità presente.
• Consente di separare frammenti che differiscono di almeno 20/30 bp (basi azotate) e non di pochi nucleotidi.
• È utilizzato per separare frammenti di dimensioni comprese tra 50bp fino a 25kbp, variando la concentrazione di agarosio.
• Più agarosio è utilizzato per frammenti piccoli, meno per frammenti grandi.
• La corsa viene effettuata a voltaggio costante di 3 V/cm.
• Esistono versioni modificate per lavorare con frammenti più grandi/piccoli.

Acrilammide

• Offre una maggiore risoluzione e consente una separazione di frammenti molto simili tra loro.
• La concentrazione minima utilizzata è il 3% ed è adatta per frammenti fino a 500bp.

Elettroforesi in Campo Pulsato

• Per la separazione di frammenti di DNA molto grandi, si utilizza l'elettroforesi in campo pulsato.
• Gli elettrodi sono posizionati a 45 gradi e il campo elettrico cambia continuamente.
• Permette a frammenti più grandi di attraversare più facilmente le maglie della matrice.
• Viene utilizzata per la separazione dei cromosomi di lievito.

Preparazione e Visualizzazione dei Campioni

• I campioni vengono caricati in pozzetti con loading buffer colorato e glicerolo, aumentandone la densità.
• La corsa si effettua in presenza di coloranti; storicamente si usava l'etidio bromuro (mutageno).
• Oggi si usano sostanze intercalanti del DNA, che danno un segnale visivo fluorescente dopo eccitazione con UV o luce blu.
• La visualizzazione avviene grazie a un translilluminatore o gelDOC (SYBR Green).
• In alternativa, si possono usare metodi radioattivi (silver staining).
• Le bande di DNA sono visibili alla fine della corsa; il DNA genomico è in alto, i prodotti di PCRT in basso nel gel.

Stima di Dimensioni e Concentrazione

• Per stimare la dimensione dei frammenti, si utilizza un marcatore di pesi molecolari, caricato insieme al campione.
• Confrontando la migrazione del campione con la migrazione di frammenti a peso molecolare noto si determina la dimensione.
• La concentrazione del DNA può essere stimata "occhiometricamente" in gel.
• Si utilizza DNA genomico di fago lambda a concentrazioni note per creare una scala confrontata con il campione.
• L'intensità della banda del campione viene confrontata con la scala per stimare la concentrazione.

Qualità del DNA e Recupero di Frammenti

• La qualità del DNA si valuta osservando la banda: una banda unica indica DNA integro, uno smear indica DNA degradato.
• Frammenti di interesse possono essere recuperati dal gel, rappresentando un ulteriore metodo per purificare il DNA.

Sistemi di Microfluidica

• Sistemi di "lab-on-a-chip" basati su chip con pozzetti per i campioni e canali con matrici.
• Sistemi di rilevazione visualizzano la corsa usando coloranti, fornendo un'immagine digitale.

Analisi Spettrofotometrica

• Il DNA in soluzione acquosa ha un picco di assorbanza a 260nm, usato per dedurne la concentrazione.
• Per risultati attendibili, l'assorbanza deve essere tra 0,1 e 1 OD in cuvette di quarzo trasparenti a UV.
• Lo spettrofotometro va azzerato con il bianco prima della misurazione.
• Per ottenere la concentrazione dall'assorbanza si usa: 1OD = 50ng/µL per dsDNA (40ng/µL per ssDNA).

Valori di Assorbanza e Nanodrop

• Altri valori di assorbanza misurati includono: 280nm (proteine), 230nm (contaminanti) e 320nm (controllo).
• Il rapporto OD260/OD280 deve essere tra 1,8 e 2.
• La contaminazione è misurata a 230nm, con valori di 2.0/2.2.
• L'assorbanza a 320nm deve essere molto bassa, a conferma della purezza del campione.
• Il Nanodrop è uno spettrofotometro per lavorare con volumi ridotti (1,5-2µL), evitando sprechi.
• Una goccia di DNA viene caricata e un braccio crea una colonna liquida dove passa il raggio UV per la misurazione.

Manipolazione Enzimatica del DNA Purificato

• Il DNA può essere manipolato con enzimi purificati o prodotti in modo ricombinante.
• Le nucleasi tagliano il DNA nei legami fosfodiesterici e le esonucleasi accorciano degradando gli acidi nucleici dalle estremità.
• Le endonucleasi rompono i legami fosfodiesterici internamente, agendo su singolo o doppio filamento.
• Le endonucleasi di restrizione tagliano il DNA in sequenze specifiche, producendo estremità piatte o coesive per il clonaggio classico.
• La reazione di restrizione consiste nell'aggiunta di DNA, buffer tipico, e enzima a 37°C per un tempo variabile in base all'uso.
• Dopo una stima delle volte in cui l'enzima taglia, si carica il campione in gel, purificandolo se serve per il clonaggio.
• Diversi enzimi richiedono buffer specifici.
• Le ligasi uniscono molecole di acidi nucleici riparando discontinuità tra nucleotidi su singola e doppia elica.
• L'efficienza è maggiore per estremità coesive.
• Viene usata la T4 DNA ligasi di E. coli.
• La PCR può creare primer con siti di restrizione al 5' per inserire il frammento in un vettore.
• Le polimerasi copiano gli acidi nucleici usando uno stampo e necessitano di un primer.
• La DNA polimerasi I ha attività polimerasica ed esonucleasica in direzione 5'-3'.
• Il frammento di Klenow deriva dalla DNA polimerasi I con sola attività di sintesi.
• La Taq DNA polimerasi I di Thermus aquaticus è termostabile ed è usata nella PCR.
• La trascrittasi inversa deriva dai virus e sintetizza cDNA da RNA stampo.
• Gli enzimi di modificazione aggiungono o rimuovono gruppi chimici.
• La fosfatasi alcalina rimuove i fosfati in 5' dal DNA e la polinucleotide kinasi (PNK) aggiunge fosfati in 5' terminale per la ligazione.
• Questi enzimi possono sostituire il fosfato con un isotopo radioattivo.

Ibridazione Molecolare

Denaturazione e Rinaturazione

• È basato su denaturazione e rinaturazione del DNA.
• L'aumento di temperatura causa la denaturazione (DNA ds → ss).
• Il processo è reversibile e, con il raffreddamento, avviene la rinaturazione.

Fattori Che Influenzano il Processo

• Dipende dalla composizione del DNA (numero di GC).
• Il numero di GC influenza il calore necessario per la denaturazione.
• La temperatura di melting è la temperatura a cui il 50% delle molecole di DNA sono denaturate.

Processo di Ibridazione

• Filamenti di DNA ss tendono ad ibridarsi abbassando la temperatura.
• Inizialmente si ha un ibrido instabile che diventa stabile con un numero sufficiente di legami ad idrogeno.
• La stabilità dell'ibrido dipende dalla complementarietà delle basi e dalla temperatura.

Applicazioni Dell'ibridazione

• L'ibridazione DNA/DNA studia l'organizzazione dei geni nel genoma (Southern blotting), screening librerie genomiche o di cDNA.
• Diversi esempi di applicazioni:
  • Quantificare i membri di una famiglia genica (Southern blotting).
  • Verificare quante copie di transgeni sono inserite in organismi transgenici (Southern blotting).
  • Arricchire geni specifici per tessuti.
  • Isolare cloni genomici che portano il gene di interesse (librerie genomiche o di cDNA).
  • Eseguire analisi microarray.

Southern Blotting

• Per identificare un gene di interesse in una sequenza di DNA.
• È il primo protocollo che utilizza l'ibridazione molecolare del DNA.
• Sfrutta DNA genomico trasferito su membrana, testato poi con sonde per l'ibridazione.
• Il DNA genomico deve essere digerito (minimo 10μg).
• La separazione è fatta su gel, poi il gel viene usato per il trasferimento su membrana.
• Si costruisce il castelletto con tampone di trasferimento, supporto di vetro, carta assorbente, gel, membrana di nitrocellulosa e carta assorbente.
• Il liquido risale per capillarità portando il DNA dal gel alla membrana (overnight).
• In alcuni casi, il DNA è trattato con HCl (depurinazione) e soluzione denaturante, seguito da neutralizzazione.
• Il giorno dopo, si recupera la membrana e il DNA viene saldato con UV o calore a 80°C.
• Viene ibridata con sonde marcate dopo aver saturato la membrana.
• L'ibridazione avviene in tubo/vaschetta, lasciata overnight alla temperatura di ibridazione.
• La membrana viene lavata ed esposta per rilevare l'appaiamento della sonda (autoradiografia se radioattiva).

Membrane Utilizzate

• Nitrocellulosa: bassa capacità di legame (frammenti piccoli), legame idrofobico non covalente, poco robusta, basso background.
• Nylon: maggiore capacità di legame, legame covalente, più robusta, diverse tipologie.

Condizioni di Ibridazione

• Preibridazione della membrana con stessa soluzione di ibridazione per evitare legami aspecifici.
• Ibridazione in tubi in rotazione, bustine di plastica o vaschette a 65°C o 42°C a seconda del buffer.
• Il buffer di ibridazione può essere la presenza di formammide per abbassare la temperatura.
• Le membrane sono lavate con buffer che contengono concentrazioni decrescenti di sostanze.
• La sonda ibridata può essere rimossa per riutilizzare la membrana.

Oligonucleotidi Da Usare Come Sonde

• Si sceglie il gene di interesse, amplificato e purificato (Tm di almeno 10°C sopra quelli dell'ibridazione).
• Maggiore è la lunghezza, maggiore è la specificità.
• Si usano sonde eterologhe per geni condivisi tra organismi diversi.
• Si creano sonde degenerate (nucleotidi variabili).
• La sonda deve essere resa visibile marcandola (radioattività o non).

Metodi Di Marcatura Delle Sonde

• Marcatura terminale: la sonda viene marcata in posizione terminale con l'uso della polinucleotide chinasi.
• Marcatura interna: L'ATP con fosfato radioattivo viene inserita usando DNA polimerasi I o frammenti di Klenow.
• Nick translation: l'ATP marcata viene incorporata riparando un nick creato da DNasi I con DNA polimerasi.
• End filling: le estremità a singolo filamento vengono riparate con Klenow.
• Random priming: oligonucleotidi randomici di 6-7bp per dare origine a un ds che legherà Klenow.
• Marcatura non radioattiva: meno pericolose, più veloci, meno costose, molti kit disponibili, sistema di rilevazione indiretto.

Analisi Microarray

• Supporto solido con oligonucleotidi complementari a tutti i geni del genoma nei pozzetti.
• cDNA da organismo in condizione specifica è marcato e ibridato al supporto solido per valutare l'espressione genica.

Analisi del DNA Mediante PCR

PCR

• La PCR si compone di tre step: denaturazione, annealing, extension.

Disegno dei Primer

• Il processo è basato sul primer per creare innesti di dsDNA.
• I primer presentano una sequenza da 20-25 paia di basi con una temperatura precisa di melting e annealing.
• La temperatura melting è definita dall'operatore e corrisponde alla temperatura a cui il primer e il templato sono dissociati.
• La formula per calcolare la temperatura Tm è (4 x GC) + (2 x AT).
• La temperatura di annealing deve essere la più vicina possibile alla temperatura di melting, favorendo la specificità, ma garantendo un corretto appaiamento ed efficienza; la temperatura di anenaling è fondamentale per garantire la specificità della reazione.
• La Tm deve essere compresa tra 50°C e 60°C mentre la temperatura di annealing è minore di 5 °C rispetto la prima.
• Il primer forward corrisponde alla sequenza 5'→3' e il primer reverse è il reverse complement letto dalla fine.
• È possibile modificare il 5' del primer ma il 3' non deve essere modificato; il 3' deve essere ricco di sequenze con molto GC per facilitare l'appaiamento.
• Al 5' sono invece consentite le seguenti modifiche: siti di restrizione per clonaggio e aggiunta di gruppi fluorescenti (fluorofori)
• Sono inoltre presenti software che disegnano i primer che presentano una sequenza ottimale.

Allestimento Della Reazione e Componenti

• I reagenti necessari per allestire una tipica reazione di PCR sono:

Buffer

• Il buffer aiuta a mantenere le condizioni di PH e può contenere anche le componenti di caricamento di gel.

Magnesio

• Il Magnesio aiuta a fare avvenire la reazione specifica.

dNTP'Ss

• Il dNTP'Ss invece servono per "evitare" che la sequenza si saturi interrompendo la PCR.

Primers

• Prima dell'amplificazione i primers devono essere forniti allo stato liofilizzato, successivamente devono essere risospesi a seconda della condizione ottimale.

Templato

• Il templato, che deve provenire o da plasmidi o attraverso del DNA genomici, si dice che nel caso di DNA plasmidico servono piccole quantità.
• Invece per il DNA genomico bisogna "evitare" la presenza di inibitori e quindi bisogna diminuire il quantitativo di DNA.

Taq DNA-Polimerasi

• Quantificata in attività.
• La quantificazione è essenziale per riuscire a capire quello che "funziona" e non la concentrazione.
• Durante l'allestimento in ghiaccio è importate "evitare" di mettere a contatto, a temperatura ambiente, il genoma con i primers.
• Questo perchè tenderanno ad ibridarsi (comportando degli aspecifici).
• Alcune altre caratteristiche tipiche riguardano:

Processività

• Capacità di allungare 1000 BP al minuto; Alcune tag presentano dià attività di proofreading ovvero attività esonucleasica 3'→5'
• Se si vuole fare il "clonaggio" di un gene per avere una porzione specifica, si utilizza una tag perfett.
• A-tailing: consiste dell'aggiunta di A al 3' terminante senza che è sia necessario avere T complementari (alla fine).
• Non è una caratteristica condivisa da tutti i tag: La caratteristica A-tailing, è utile in caso di clonaggi che sfruttano A protruding termale per favorire una legione più forte con I Protruding
• Il primer della tag hot start è sono fatti in modo che se il primer non è più complesso, esso andrà via.
• Questo per impedire che l'inizio della sua azione (primer) avvenga nella giusta forma (condizioni di annelaing).

Cicli

• Denaturazione Iniziale (93'C)
• Denaturazione (93'C): separazione filamenti del DNA stampo
• Anneling (Tm-5)
• Estensione (72°C): la tag polimerasi riconosce I Primers
• Estensione finale (72'C)

Possibilità di Ottimizzazione

• è importantissimo ricordarsi il rapporto temperatura e lunghezza del frammento.
• La temperatura è inversamente proporzionale ai Primer; ergo diminuendo la temperatura avviene un ibridazione aspecifica, mentre se la temperatura è troppo alta i primer non si legano.
• Se diminuisco i dNTP's la tag collassa favorendo il manifestarsi della reazione.
• Diminuisco la quantità del primer nel momento che si scassa diminuendola drasticamente

Applicazioni Della PCR

• Multiplex PCR
• Nested PCR
• TouchDown PCR
• PCR Inversa
• Real Time PCR

In conclusione

• Le PCR consistono nella possibilità di selezionare in vari metodi l'amplificazione di un gene d'interesse modificando una certa sequenza.
• E importante conoscere i loci in cui sono le presenti le varianti.
• In una PCR quantitativa lo scopo è principalmente quantificare il target che implica applicazioni nell' ambito della diagnostica molecolare.

Importanza Degli Studi

• Importante è comprendere il funzionamento di una reazione PCR.
• Il Templato presente presenta una particolare modalità durante i cicli
• Durante i cicli bisogna tenere in considerazione
  • In quantitativo di target che si utilizza
  • Poi la fase lineare
    • Fase esponenziale
      • Termine del dNTP'S e il collasso

Analisi Semi Quantitativa

• Il primo approccio e stato di tipo semi-quantitativo
• Il metodo si basa su come si comporta le reazione durante un tot di Cili
• In questo modo si riesce a capire nei dei diversi campioni la quantità di templato in questione
• Però per essere più precisi si utilizza una Real Time PER che consente di seguire l'evoluzione direttamente nella proveta (il tutto in tempo reale)
• In un analisi importante utilizzare una strumentazione ottica adeguata per la fluorescenza che andrà misurara ad ogni ciclo
• La fluorescenza presenterà il classico andamento ad una reazione di PER
• Però se facciamo una curva e non interroghiamo gli Standard, quello che succede è che si può risalire al numero di i Templato che è presente nel campione
• I modi per rilevare una fluorescenza ad ogni ciclo sono 2
• Utilizzare gli Sybrgreen
• Utilizzare una Sondda (tagman)

Dropled Digital PCR

• Consente di valutare una analisi quantitativa assoluta d un di target presente in nel campione in un numero molto passo

I Marcatori Molecolari

• In fine i Marcatori molecolari ci permettono di analizzare sequenze differenti in molti di individui

Questo articolo esplora l'uso di enzimi come Taq polimerasi, trascrittasi inversa e fosfatasi alcalina nella biologia molecolare. Viene inoltre esaminato l'impatto del contenuto di GC sulla temperatura di fusione del DNA e il processo di ibridazione molecolare.