Cuantificación de Parámetros y Ciclo Celular

Cuantificación de Parámetros y Ciclo Celular

• Contadores automáticos de células: Emplean métodos como imagen directa (analogía a recuento manual en cámaras de Neubauer, tinción vital con azul tripán), resistencia eléctrica (ESZ).
• ESZ (método Coulter): Mide la variación de resistencia eléctrica causada por células que atraviesan un orificio. Determina el tamaño celular (diámetro) mediante la gráfica de recuento celular (número de células frente al diámetro).
• Citometría de flujo: Clasifica y cuenta células según sus características morfológicas (biomarcadores). Emplea un haz láser que interactúa con células en suspensión, generando señales de dispersión y fluorescencia.
• Fluorescencia Activated Cell Sorting (FACS): Separa células vivas en subpoblaciones marcadas con fluorocromos. Un inconveniente es el posible solapamiento de espectros de emisión en la multifluorescencia, lo que requiere compensación.
• Separación por campo eléctrico: Utiliza diferencias en las propiedades eléctricas de las células para separarlas. Es efectivo para separar gotitas cargadas eléctricamente (carga positiva, negativa o nula).
• Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Separación de células en base a sus antígenos de superficie, usando nanopartículas magnéticas asociadas a anticuerpos. Hay dos tipos: selección positiva (células con antígeno se retienen) y negativa (células sin antígeno se retienen).
• Fluorocromos: Moléculas que absorben radiación UV y emiten luz visible. Utilizados para estudiar la difusión celular, determinación de solutos/iones, hibridación ADN-ARN, unión a proteínas e inmunoglobulinas. Se usan filtros para la captura de luz emitida. Se destacan por su especificidad y su alto contraste.

Estimación del Contenido y Tasa de Síntesis de ADN y Proteínas

• Contenido de ADN: La cuantificación se realiza con técnicas de fluorescencia (fluorímetro, microscopio de fluorescencia, citómetro) o con colorantes (DAPI, PicoGreen, Hoechst 33258) y espectrofotómetro (Nanodrop). El espectrofotómetro mide la absorbancia a 260 nm, mientras que la Nanodrop mide la absorbancia a 260 y 280 nm para análisis de pureza (relación A260/A280).
• Determinación de proteínas: Se utiliza espectrofotómetro o Nanodrop a 280 nm. También se usan ensayos colorimétricos como la reacción de Bradford, que utiliza un producto que absorbe luz a una determinada longitud de onda al reaccionar con proteínas.
• Tasa de síntesis de ADN: Se mide adicionando nucleósidos radiomarcados (ej., timidina tritiada) al medio de cultivo celular y midiendo la radiactividad incorporada por citometría de flujo o inmunocitoquímica.

Proliferación Celular: Curvas de Crecimiento. Migración Celular

• Proliferación celular: Proceso de aumento del número de células. Se debe a un equilibrio entre las divisiones celulares y la muerte o diferenciación celular
• Técnicas para determinar la tasa de proliferación: Marcaje de la síntesis de ADN, determinación de la curva de crecimiento por recuento celular, análisis de las fases o proteínas del ciclo celular, medición de ATP mitocondrial.
• Migración celular: Movimiento de células a través de un sustrato, medido por placas transwell o ensayos de cicatrización de heridas.

Análisis del Ciclo Celular mediante Citometría de Flujo

• Ciclo celular: Periodo entre dos divisiones celulares. Las etapas clave son: G1 (vacío, célula crece), S (síntesis), G2 (prepara mitosis), M (división).
• Sincronización celular: Técnicas para que las células entren en las etapas del ciclo celular al mismo tiempo (cultivo sincrónico)
• Análisis del contenido de ADN: Se utilizan técnicas como el yoduro de propidio o Hoechst para teñir el ADN y evaluar el contenido en diferentes fases del ciclo.

Viabilidad y Citotoxicidad

• Viabilidad celular: Capacidad de las células de sobrevivir y realizar su función. Se mide con diversos métodos, incluyendo tinciones vitales y análisis de la membrana celular.
• Citotoxicidad: Efecto dañino o letal de una sustancia en las células. Se mide como una respuesta biológica al estímulo dañino (EC50, IC50, LD50).