Chapitre II: Translocation des Protéines (RE)

Chapitre II : Translocation de Protéines à Travers la Membrane du Réticulum Endoplasmique (RE)

• Le chapitre traite de la translocation des protéines à travers la membrane du réticulum endoplasmique (RE).

Réticulum Endoplasmique (RE)

• Le RE est un réseau de saccules et de canalicules délimités par une membrane continue.
• Il occupe une très grande surface dans la cellule et est le lieu de synthèse de nombreuses protéines et lipides.
• Le RE rugueux est recouvert de ribosomes sur sa face cytoplasmique et est impliqué dans la synthèse protéique.
• Une grande quantité de RE rugueux se trouve dans les cellules exocrines du pancréas.
• Le RE lisse n'a pas de ribosomes et est impliqué dans la synthèse d'hormones stéroïdes.
• Une grande quantité de RE lisse se trouve dans les cellules sécrétrices d'hormones stéroïdes, comme les cellules de Leydig.
• L’élément de transition vers Golgi: 1 face lisse et 1 face rugueuse
• L'étude in situ du RE se fait par méthodes cytoenzymologiques (ex: glucose-6-phosphatase) et immunomarquage.
• Le fractionnement du RE produit des microsomes rugueux et lisse qui conservent leur fonction in vitro.
• Le contrôle de pureté des fractions du RE se fait par critères morphologiques (MET) et biochimiques (activités enzymatiques).
• Le RE est un lieu de synthèse protéique, de modifications dans le Golgi, et de transport vers diverses destinations.
• Les protéines destinées à être déchargées de la cellule empruntent la voie sécrétrice (exocytose).
• Les protéines transportées dans des vésicules sécrétrices et déchargées d'une façon continue utilisent la sécrétion constitutive.
• La sécrétion régulée implique le stockage des protéines dans des granules de sécrétion, libérées en réponse à des stimuli appropriés.
• La voie d'endocytose transporte des matériaux de l'extérieur de la cellule vers les endosomes et lysosomes.
• Un modèle de trafic bien défini est nécessaire pour le transport, ainsi que des séquences signaux ou adresses pour acheminer les protéines à leur destination.
• Les protéines sont synthétisées sur des ribosomes libres ou attachés au RE, débutant dans le cytosol.
• Gunter Blobel a fractionné le réticulum endoplasmique par centrifugation pour étudier le mécanisme de translocation.
• Les microsomes sont des petites vésicules découlant du réticulum.
• Les protéines sont sécrétées par les ribosomes attachés à la membrane du RER et sont sécrétées par les cellules pancréatiques, les cellules caliciformes intestinales (protéines muqueuses), les cellules endocrines (hormones), les plasmocytes (anticorps) et les hépatocytes (protéines du sérum sanguin), protéines intégrales membranaires et protéines solubles dans le RE.
• Les protéines synthétisées sur les ribosomes libres restent dans le cytoplasme, sont périphériques du feuillet interne de la membrane plasmique, sont transportées dans le noyau ou sont incorporées dans les peroxysomes, les chloroplastes et les mitochondries.
• L'autoradiographie et l'expérience de Pulse chase ont démontré que le RE est le site de synthèse des protéines sécrétées..
• James Jamieson et George Palade ont utilisé l’autoradiographie.
• L'utilisation de systèmes exempts de cellules a permis de découvrir des activités remarquables des fragments isolés des cellules.
• L'adressage du ribosome synthétisant la protéine se fait vers la membrane du RER.
• La protéine est transloquée à travers la membrane si elle est soluble.
• Si la protéine est membranaire, elle s'insère dans la membrane.
• Le RER bourgeonne continuellement, formant des vésicules qui fusionnent avec le Golgi.
• Les protéines membranaires du RE se retrouvent dans la membrane du Golgi, et les protéines solubles dans les compartiments intra-golgiens.
• Les bourgeonnements et les fusions ultérieurs permettent le transfert de protéines du Golgi vers les vésicules de sécrétion.
• Les vésicules de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique libérant les protéines solubles dans le milieu extracellulaire et insérant les protéines membranaires dans la membrane plasmique.
• Il existe un mécanisme au niveau de chaque transfert qui permet de distinguer les protéines des compartiments donneurs, de celles à transférer.

Importation Co-traductionnelle dans le Reticulum Endoplasmique

• La translocation des protéines à travers la membrane du RE peut être co-traductionnelle ou post-traductionnelle (levure Saccharomyces Cerevisiae) ou co-traductionnelle (mammifères).
• Le site de synthèse d’une protéine est déterminé par une séquence d’acides aminées dans son côté N-terminal.
• Les protéines sécrétées contiennent une séquence signal vers le côté N-terminal du polypeptide.
• Le polypeptide se déplace vers l’espace cisternal du RE co-traductionnellement par un canal bordé de protéines aqueuses.
• Le mécanisme de translocation impose que toutes les protéines du trafic protéique contiennent des codes d'adressage qui déterminent leurs destinations (Hypothèse du Signal).
• Les étapes initiales de la synthèse protéique se produisent lorsque le ribosome est dans le cytosol, non lié au RE.
• Une séquence d'acides aminés dite séquence signal dans la protéine nouvellement formée conduit le ribosome jusqu'au RE.

Translocation Co-traductionnelle des Protéines à Travers la Membrane du RE

• La translocation de la protéine à travers la membrane du RE peut se dérouler pendant la synthèse par le ribosome (translocation co-traductionnelle) ou après l'achèvement de la traduction (translocation post-traductionnelle).

Utilisation de Systèmes Exempts de Cellules pour Révéler le Mécanisme Co-traductionnelle dans le RE

• Les protéines solubles importées vers le RE sont synthétisées sous forme de précurseurs avec une extension N-terminale dite séquence signal.
• Cette séquence signal est clivée durant la translocation à travers la membrane du RE par une peptidase localisée.
• La forme mature dans la lumière du RE présente un poids moléculaire inférieur à la forme du précurseur.

Mécanisme Général de la Translocation Co-traductionnelle

• L'extension N-terminale constituant la séquence signal apparait en dehors du ribosome.
• Elle interagit avec une ribonucléoprotéine cytoplasmique (SRP - Signal Recognition Particle).
• Cette interaction bloque (ou ralentit) la synthèse protéique et permet l'adressage de l'ensemble vers le réticulum endoplasmique.
• Les ribosomes sont fixés à la membrane par interaction avec le complexe Sec61p et le récepteur SRP.
• Une Interaction SRP-séquence signal se produit; cette dernière est alors prise en charge par la machinerie de translocation.
• L'arrêt de la synthèse protéique est levée. La protéine en synthèse traverse la membrane par l'intermédiaire du translocan.
• La synthèse et la translocation s'effectuent généralement simultanément alors que le ribosome est fixé sur la membrane.
• La séquence signal est clivée par une peptidase localisée dans la membrane du RE.
• La protéine mature est relâchée dans la lumière du RE.
• Dans tous les organismes, la translocation des protéines à travers la membrane est assurée par des séquences signal hydrophobiques, interéchangeables.
• Les séquences signal procaryotiques peuvent fonctionner chez les eucaryotes et vice versa.
• Les séquences signal des protéines sécrétées sont clivées, tandis que celles des protéines membranaires restent pour servir d'ancrages permanents.

SRP et son Récepteur Membranaire

• SRP (Signal Recognition Particle) est une nucléoprotéine indispensable pour l'importation des protéines dans le RE.
• SRP se fixe sur la séquence signal (résidus 60 à 70) dès qu'elle apparaît hors du ribosome (40 résidus sont dans le ribosome) et bloque la synthèse ultérieure.
• SRP dirige l'ensemble protéine/ribosome/ARNm vers la membrane du RE et permet la reprise de synthèse.
• Le récepteur membranaire de SRP (SR) est constitué de deux sous-unités SRα (69 kDa) et SRβ (30 kDa), ancrées à la membrane.
• SRP = ARN (7S) + 6 chaines polypeptidiques (SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68 300 nucléotides)
• Cycle GTP-GDP du récepteur du SRP: SRP lie GDP, perd GDP et se fixe sur la séquence signal, ce qui arrête la traduction. GTP se fixe à SRP et son récepteur et entraine la dissociation du complexe SRP/SR. La séquence signal interagit avec le complexe sec61. L'hydrolyse de GTP conduit à la forme GDP-SRP, qui se détache de la membrane.

La Machinerie de Translocation

• La liaison du ribosome traductionnel avec la membrane du RE et le détachement de la séquence signal du SRP54 permettent la translocation en cours.
• Les protéines traversent la membrane vers la lumière du RE par un complexe protéique ou canal.
• Le canal de translocation est mis en évidence par:
  • Expérience électrophysiologique.
  • Résultats d'extinction de la fluorescence.
  • Expériences utilisant des protéoliposomes reconstitués à partir de protéines membranaires et lipides: le complexe Sec61.
• Le complexe Sec61 forme des structures en forme d'anneaux, contenant trois ou quatre copies de Sec61p.
• L'oligomérisation du complexe Sec61 est induite par des interactions avec d'autres partenaires( le translocon est formé d'un seul complexe Sec61)
• Deux étapes de la translocation: d'abord le complexe RCN est faible, puis se lie fortement durant l'élongation.

Importance de la Membrane et Lumière du RE

• La membrane et la lumière du RE sont très importantes pour la translocation des protéines
• Le polypeptide naissant entre dans la citerne, il est modifié par les enzymes intégrales de la membrane (clivage de la séquence signal sur le N-terminal par une peptidase signal associée à Sec61)
• Les protéines sont glycosylées in vivo par les oligosaccharyltransférases dans la lumière.
• Les protéines sont en conformations via les protéines chaperonnes (stabilisation via PDI protéine disulfure isomérase)
• Il existe différent type d'insertion: insertion directe et insertion en boolce de la séquence signal

Importation Post-traductionnelle dans le RE

• L'adressage de la protéine à la membrane s'effectue en absence de SRP et récepteur SRP mais suit celle de la translocation co-traductionnelle.
• Les protéines importées dans le réticulum sont constituées seulement de 60 à 70 résidus, séquence signal comprise.
• Il est matériellement impossible que ces protéines soient importées en vivo de manière co-traductionnelle.
• La synthèse de ces protéines est terminée et elles sont relâchées du ribosome avant que SRP ait pu se fixer sur la séquence signal.
• Ces protéines sont importées à l'aide d'ATP.

Translocation post-traductionnelle: Sec A (seulement dans les bactéries, moteur protéique et ATPases) et Bip (Binding protein)(se fixe sur la chaîne en émergence). Bip déposent les molécules sur la chaîne émergente et la tirent.