Biologie: Réticulum endoplasmique

• Le réticulum endoplasmique (RE) est une structure cellulaire essentielle, explorée dans la fiche de cours n°7, partie 1, pages 1 à 21.

Généralités sur le RE

• Il s'agit d'une cavité unique qui peut apparaître divisée en plusieurs cavités en microscopie électronique à transmission (MET) en raison de l'angle de coupe.
• Il se compose de replis membranaires sous forme de lamelles ou de tubules, visibles en ME.
• Les tubules jouent un rôle dans le métabolisme lipidique.
• Les lamelles sont impliquées dans la synthèse des protéines.
• Le RE est une expansion de la membrane externe de l'enveloppe nucléaire.
• Il y a la présence de ribosomes sur la membrane nucléaire externe et la membrane du RE.
• Il y a une continuité entre l'espace périnucléaire de l'enveloppe et la lumière du RE.
• La membrane du RE représente au moins 50% de la masse totale des membranes d'une cellule animale typique.

Fonctions du RE

• Il est responsable de la synthèse des protéines membranaires et transmembranaires, intégrant un système d'insertion des protéines dans la membrane.
• Pour les protéines sécrétées, il utilise un dispositif similaire pour traverser la membrane et se retrouver dans la lumière du RE.
• Il synthétise les phospholipides membranaires et les stéroïdes, comme le cholestérol et ses dérivés.
• Il élimine les molécules toxiques via le REL, où certains médicaments (xénobiotiques) sont métabolisés pour détruire leur composante toxique.
• Le calcium n'est pas libre dans le cytoplasme.
• Il est stocké dans le RE et les mitochondries, et est libéré via des pompes à calcium et des canaux ioniques pour la signalisation et la contraction musculaire.

Observation du RE par microscopie confocale à fluorescence

• L'ADN est coloré en bleu avec un agent intercalant comme le DAPI.
• L'actine est colorée en rouge par immunomarquage avec un anticorps anti-actine révélé par un fluorochrome comme la rhodamine.
• L'actine est organisée en faisceaux visibles au microscope optique.
• Le RE est coloré en vert par immunomarquage avec un anticorps anti-calréticuline, une protéine résidente spécifique du RE, révélé par un fluorochrome comme la fluorescéine.
• Le RE prend naissance à la surface de l'enveloppe nucléaire et s'étend dans le cytoplasme.

Types de RE

• Les deux formes de RE, lisse (REL) et rugueux (RER), sont continues ou en contact et toujours présentes dans la cellule.
• Le REL est constitué de réseaux de tubules anastomosés, sans ribosomes à sa surface, et est impliqué dans le métabolisme des lipides et la détoxification.
• Le REG est constitué de réseaux de saccules ou lamelles plus ou moins aplaties, couverts de ribosomes, d'où son aspect rugueux, et est impliqué dans la synthèse protéique.

Proportion variable du RE selon le type cellulaire

• Dans les cellules spécialisées dans la synthèse des protéines, le REG est abondant.
• Dans les cellules spécialisées dans le métabolisme lipidique, le REL est abondant.
• Les hépatocytes ont un tiers de REL et deux tiers de REG, reflétant leur rôle dans le métabolisme lipidique et protéique.
• Les plasmocytes, spécialisés dans la synthèse d'anticorps, ont un RE qui occupe tout le volume cellulaire avec des lamelles dilatées pour la maturation progressive des anticorps.

Place du RE dans la cellule

• Le RE est à l'origine de la quasi-totalité des membranes des cellules eucaryotes.
• Son asymétrie membranaire est conservée jusqu'à la membrane plasmique, via l'appareil de Golgi.
• La mi-couche externe du RE devient la face cytosolique de la membrane plasmique, et la mi-couche interne devient la face externe.
• Le renouvellement de la membrane se fait par trafic vésiculaire.
• Des vésicules bourgeonnent du RE vers l'appareil de Golgi, puis il y a un trafic vésiculaire au sein de l'appareil de Golgi, et enfin, les vésicules sont exportées vers la membrane plasmique et d'autres compartiments cellulaires comme les lysosomes.
• Il existe une étroite interconnexion entre le RE et l'appareil de Golgi.
• Dans les années 1960, l'observation des structures internes de la cellule par la MET permet de comprendre la structure précise du RE et sa liaison au Golgi.
• Albert Claude, Christian De Duve et George E. Palade ont reçu le Prix Nobel en 1974 pour la description de la structure et du fontionnement d'un organite.
• Georges Palade a mis en évidence la synthèse et la sécrétion des protéines par le RE.

Caractéristiques générales de la membrane du RE

• Elles varient selon le type cellulaire.
• Elles suivent le modèle de Singer et Nicholson, avec deux couches de lipides membranaires.
• La membrane du RE est plus fine (6 nm) et plus fluide que la membrane plasmique, avec peu de cholestérol et beaucoup de phospholipides insaturés.
• La glycosylation des protéines se fait sur la face luminale du RE, qui correspond à la mi-couche interne.
• L'orientation des enzymes dépend de leur fonction: le site catalytique est soit vers la face luminale, soit vers la face cytosolique, selon la localisation du substrat.
• Les enzymes de la détoxification du cytoplasme, comme le CytP450, se situent sur la face cytosolique, tandis que les enzymes de la glycosylation se situent sur la face luminale.
• L'oligosaccharyl-transférase est une enzyme impliquée dans la glycosylation des protéines.
• Elle contient des protéines chaperons.
• Elle implique des enzymes dans la synthèse des phospholipides et des stéroïdes et dans la détoxification via le CytP450 spécifique du RE.
• Les phospholipides ont des chaînes insaturées.
• Taux faible de cholestérol.
• Il y a une absence de sphingomyéline et de glycolipides.

Adressages de l'adresse des protéines

• Les protéines sont complètement synthétisées par des ribosomes libres et ensuite adressées à leur destination, comme le noyau (ribosomes, facteurs de transcription), la mitochondrie ou le peroxysome.
• Les protéines sont adressées au RE pendant leur synthèse.

Signaux d'adressage

• Il existe de nombreux signaux pour chaque organite, comme la mitochondrie et le peroxysome.
• Les protéines destinées au RE possèdent un peptide signal (PS), une dénomination spécifique de l'adressage au RE.
• Le peptide signal est constitué de 15 à 30 acides aminés hydrophobes formant une hélice alpha.

Mise en évidence du peptide signal par l'expérience de Blöbel

• Des expériences sont menées sur des broyats de plasmocytes produisant des immunoglobulines (Ig).
• On étudie la traduction d'une chaîne légère d'Ig in vitro à 37°C en présence ou en absence de fraction microsomale de REG.
• L'analyse par électrophorèse montre que la taille de la protéine est supérieure en l'absence du microsome de REG.
• Il y a présence d'un peptide supplémentaire, qui correspond au peptide signal clivé après l'adressage au RE.

Transfert co-traductionnel

• La reconnaissance du peptide signal se fait par un domaine hydrophobe de la SRP.
• Un changement conformationnel de la SRP bloque la traduction.
• Le complexe SRP/ribosome est rapproché de la membrane du RE où se trouve le récepteur à la SRP.
• Cette étape est conservée dans les trois domaines du vivant.
• L'interaction entre la SRP et son récepteur ancre le complexe ribosome/SRP sur la membrane du RE.
• Il y a un détachement et un recyclage de la SRP.
• Le ribosome interagit avec le translocon, un canal de translocation.
• Le peptide signal se fixe/interagit avec la membrane du RE au niveau du translocon.
• La synthèse de la protéine reprend à travers le translocon.
• Le ribosome part, la signal peptidase clive le peptide signal, le translocon se désorganise, la protéine est libérée dans la lumière du RE, et le peptide signal est dégradé par la Peptidase du Peptide Signal (SPP).

Protéine transmembranaire Singlepass

• Elle possède un peptide d'Initiation de transfert (PIT), clivé par la signal peptidase, et un peptide de Terminaison de Transfert (PTT), non clivé, faisant partie intégrante de la protéine transmembranaire.
• Ces peptides sont formés de 15 à 30 acides aminés hydrophobes organisés en hélices a.
• La synthèse se fait vers la lumière du RE jusqu'à la rencontre du PTT, qui a une affinité importante pour le translocon.
• Le PTT devient la portion transmembranaire, le peptide signal est clivé, le ribosome se décroche, et la synthèse de la protéine se termine dans le cytoplasme.

Protéine transmembranaire Singlepass avec peptide interne

• Certaines protéines transmembranaires ont un peptide signal qui joue le rôle de PIT et de PTT, n'est pas clivé et fait partie de la protéine.
• Ce peptide influe sur la topologie de la protéine, le domaine N-term peut être dans le cytosol et le domaine C-term dans la lumière du RE, ou inversement.
• La séquence signal détermine l'orientation de la protéine en fonction de la charge des acides aminés en bordure du domaine transmembranaire : charges + dirigées vers le cytosol, charges - dirigées vers la lumière du RE.

Protéines transmembranaires Multipass

• Elles contiennent plusieurs domaines transmembranaires reliés entre eux par des boucles.
• Les domaines transmembranaires contiennent une majorité d'acides aminés hydrophobes organisés en hélice a.
• Une succession de peptides d'initiation (PIT) et de terminaison de transfert (PTT) est présente dans la séquence de la protéine.
• La protéine est adressée au RE grâce à un peptide d'initiation de transfert.
• Le ribosome se fixe sur le translocon, et la protéine est synthétisée vers la lumière du RE.
• Une séquence de terminaison de transfert est immobilisée au niveau du translocon.
• Le ribosome se décroche et la synthèse continue dans le cytosol.
• Un nouveau peptide d'initiation de transfert permet de reprendre les étapes.précédentes.
• Il existe des logiciels (bio-informatiques) permettant d'identifier les parties hydrophobes et hydrophiles pour prédire si une protéine est transmembranaire.

Détournement des fonctions du RE par des virus

• Synthèse d'une seule protéine de 3000 acides aminés : protéine précurseur.
• La protéine précurseur va être découpée en une dizaine de protéines : structurales (fabriquent l'enveloppe du virus) et non structurales (servent à la réplication et à la traduction de l'ARN virale).
• Découpage grâce à des protéases virales mais également par des peptidases de la cellule (signal peptidase et SPP).
• Coupure de cette grande protéine au voisinage du RE.
• Bourgeonnement de nouvelles particules virales au travers de la membrane du RE.
• Transit vers l'appareil de Golgi puis l'extérieur par trafic vésiculaire.

Contrôle de qualité des protéines

• N-Glycosylation.
• La N-glycosylation favorise le repliement des protéines et permet leur solubilisation, évitant ainsi leur agrégation.

Repliement Corrects des protéines

• Rôle des protéines chaperons résidentes du RE.
• Passage d'une conformation inactive linéaire à une conformation active repliée.

N-Glycosylation

• 50% des protéines cellulaires sont glycosylées.
• N-glycosylation: débute dans le RE et se termine dans le Golgi.
• Transfert de la chaîne sucrée sur l'azote (N) de l'asparagine (Asn).
• o-glycosylation: dans le cytoplasme et dans le Golgi.
• Transfert de la chaîne sucrée sur un oxygène de la sérine ou de la thréonine.
• Fraction "core" = 14 sucres : 2-N-acétylglucosamines, 9 mannoses, 3 glucoses.
• Couplage de la fraction "core" avec un lipide particulier, le dolichol.
• Reconnaissance de motifs par l'oligosaccharyl-transférase : Asn-X-Thr ou Asn-X-Ser avec X = n'importe quel acide aminé.
• Transfert de la fraction core sur l'atome d'azote dans la partie luminale de la chaîne latérale de l'asparagine.

Repliement (Folding) des protéines et protéines chaperons

• Amputation de deux glucoses sur le bloc oligosaccharidique : interaction avec les chaperonnes
• Retrait de 2 résidus glucose du bloc oligosaccharidique par une glucosidase.
• Le motif modifié de N-glycosylation constitue le signal.
• Reconnaissance par la protéine chaperonne de la molécule de glucose restante.
• Permet le repliement de la protéine.
• Libération après perte du glucose par une glucosidase.
• Soit repliement correct : exportation.
• Soit repliement incorrect : nouveau cycle par la glucosyltransférase.
• 2 protéines chaperons = calréticuline et calnexine.
• Protéines résidentes, calcium-dépendantes. Calnexine est transmembranaire
• Calréticuline est soluble.
• Autres protéines chaperons : ERp57, PDI, BIP, HSP47.en fonction des types de repliement.

Mauvais Repliement : Réponse UPR

• La Réponse UPR est la réaction induite en situation ou de nombreuses protéines sont mal repliées ce qui forme des agrégats qui sont toxiques au sein du RE.
• Le réponse UPR est très conservée au cours de l'évolution, ce qui implique qu'elle aurait apparue pour la première fois chez la levure.
• La plupart des réponses UPR sont considérées comme physiologiques mais elles peuvent devenir pathologiques dans de nombreuses situations, comme l’infection par un virus.
• Inhibition de la traduction :destruction de nombreux facteurs de transcriptionsDiminution de l’apport de nouvelles protéines vers le RE.
• Augmentation spécifique de la synthèse de protéines chaperons grâce à la synthèse d’une grande quantité de factures de transcription spécifique Augmentation des capacités de repliement des protéines.
• Induction de la voie ERAD (ER-associated degradation) Augmentation des capacités de dégradation des protéines par le protéasome.Elle va induire l’apoptose de la cellule en cas d’être dépassée.
• Induction expérimentale de la voie UPR: -Tunicamycine: inhibition de la N glycosylation. ; Dithiotreitol: rupture des ponts disulfures: Brefeldin un blocage du transport vésiculaire du RE vers le Golgi entrainant une accumulation des protéines dans le RE ; Inactivation expérimentale d’un gène codant pour une protéine chaperon.

Signalisation UPR et Calcium

• Concentration physiologique Calcium du RE = 2 à 5 mM Cytoplasme.
• Le transport entre le RE et Cytoplasme.
• Calcium important dans réponse UPR:
• Calcium reste stocké lorsque la réponse UPR est controlée. LORSQUE DÉBORDEMENT DE UPR importante libération calcium dans cytoplasme.
• Autophagie= renouvellement des constituents cellulaires.
• Induction de l'énergie fournie par l’ATP pour réponse UPR.
• Renouvellement des phospholipides de la membrane mitochondriale.

Voie ERAD

• Les protéines restantes trop longtemps dans le RE subissent l’action de mannosidases:retrait de résidus mannose générant un motif incomplet de N-glycosylation = signal pour les protéines chaperons.
• Transfert vers les canaux de rétro-translocation, et donc vers le cytoplasme de la cellule. Une fois la protéine dans le cytoplasme, l’unique intervention de la glucosidase permet la perte de tous les sucres.
• Polyubiquitinylation de la protéine et adressage au protéasome pour la dégradation.

Trafic vésiculaire RE-GOLGI

• Constitutive: exemple de renouvellement permanent de la membrane plasmique. Constitutive et contrôlée par un stimuli.
• Antérograde: sens naturel d es protéines : RE Golgi Lysosomes ou Membrane Plasmique; Rétrograde: RE Golgi.
• Point communs entre tous transports: Présence de manteaux, ce sont des transports sélectifs.
• Transports vésiculaires dépend des microtubules et protéines motrices associées.

Trafic vésiculaire RE-Appereil de Golgi

• COPII: exportante ou antérograde vers Golgi depuis lumière RE pour proteines; COPI export proteines luminales du RE vers RE ; Clathrine permet une sécrétion constitutive vers de la membrane plasmique. ou l’ adrassage de la proteine à des compartements du dégrédiation.