Biotecnología: Vectorización y Clonación
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Questions and Answers

¿Qué tipo de colonias se generan cuando se inserta un fragmento de ADN en el polylinker?

  • Colonias amarillas
  • Colonias blancas (correct)
  • Colonias verdes
  • Colonias rojas

Los bacteriófagos infectan solo células humanas.

False (B)

¿Cuál es uno de los fagos más utilizados como vector de clonación?

fago lambda (fago λ)

Los ________ artificiales de levaduras pueden transportar insertos mayores de 1 Mb.

<p>cromosomas</p> Signup and view all the answers

Asocia cada tipo de vector con su capacidad para transportar ADN:

<p>BAC = hasta 300 Kb YAC = mayores de 1 Mb Plásmido bacteriano = hasta 10 Kb Fago λ = hasta 20 Kb</p> Signup and view all the answers

¿Qué vectores pueden comportarse tanto como plásmidos como fagos?

<p>Vectores lanzadera (A)</p> Signup and view all the answers

Los vectores híbridos no pueden replicar ADN de cadena sencilla.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se necesita hacer para que un vector híbrido produzca ADN de cadena sencilla?

<p>Infectar la célula hospedadora con M13.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el primer paso en la recuperación del fragmento amplificado?

<p>Inserción del gen en el plásmido (B)</p> Signup and view all the answers

El ADNc puede ser utilizado para crear librerías de ADN a partir de ARNm de una población celular.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo principal del uso de pulsos eléctricos de alto voltaje en la transformación celular?

<p>Aumentar la permeabilidad de las membranas (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué permite obtener la clonación según el contenido?

<p>Cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.</p> Signup and view all the answers

La _______ se utiliza en el tratamiento del ataque al corazón.

<p>hormona de crecimiento humano</p> Signup and view all the answers

Las células transformadas siempre portan ADN extraño funcional.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones se puede clonar debido a las ventajas de la clonación?

<p>Genomas enteros de organismos (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué son los marcadores genéticos en un vector recombinante?

<p>Genes de resistencia a antibióticos y enzimas que producen reacciones coloreadas.</p> Signup and view all the answers

Relacione los tipos de investigación con sus aplicaciones:

<p>Investigación básica = Estudio de secuencias genéticas Investigación básica y aplicaciones diversas = Aplicaciones en biotecnología Clonación de ARN = Creación de librerías de ADNc</p> Signup and view all the answers

En la detección basada en vectores, las células sensibles a la ampicilina y tetraciclina son ____.

<p>no transformadas</p> Signup and view all the answers

Relaciona los tipos de células obtenidas tras la transformación con su descripción:

<p>Células no transformadas = Sensibles a antibióticos A y T Células transformadas con vector recombinante = Resistentes a A y sensibles a T Células transformadas con vector no recombinante = Resistentes a T y A Células transformadas por ADN no deseado = Contienen ADN no funcional</p> Signup and view all the answers

El plásmido es un tipo de ADN que se encuentra solo en células eucariotas.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de resistencia se observa en las células transformadas con el vector recombinante?

<p>Resistencia a ampicilina y sensibilidad a tetraciclina (C)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se requiere para limpiar desechos tóxicos utilizando bacterias?

<p>Modificación de bacterias mediante genes</p> Signup and view all the answers

El inserto de ADN extraño se coloca en el interior de un gen de resistencia funcional.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuáles son los dos antibióticos utilizados en la detección de células transformadas?

<p>Ampicilina y tetraciclina.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la función principal de las enzimas de restricción?

<p>Cortar ADN en sitios específicos (D)</p> Signup and view all the answers

Los extremos cohesivos generados por las enzimas de restricción son inertes y no reactivos.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué enzima se utiliza para sellar las uniones entre los fragmentos de restricción?

<p>ADN ligasa</p> Signup and view all the answers

Las enzimas de restricción generan fragmentos de __________.

<p>restricción</p> Signup and view all the answers

Match the following processes with their correct definitions:

<p>Corte de ADN = Acción realizada por las enzimas de restricción en sitios específicos. Extremos cohesivos = Fragmentos con una forma que permite unirse a otros fragmentos de ADN. ADN recombinante = ADN formado a partir de fragmentos de ADN de diferentes fuentes. ADN ligasa = Enzima que une fragmentos de ADN.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la función principal de la enzima de restricción en el ADN?

<p>Cortar el ADN en secuencias específicas (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se obtiene tras la multiplicación de células que contienen ADN recombinante?

<p>Copias del ADN y del fragmento introducido (A)</p> Signup and view all the answers

La ADN ligasa es responsable de la separación de fragmentos de ADN.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Las enzimas de restricción solo realizan un corte en el ADN.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué es un sitio de restricción en el ADN?

<p>Es una secuencia específica de nucleótidos donde una enzima de restricción corta el ADN.</p> Signup and view all the answers

¿Qué se requiere para aplicar técnicas de clonación molecular adecuadas?

<p>Cantidad suficiente de ácidos nucleicos</p> Signup and view all the answers

El proceso de clonación molecular comienza con la inserción de un fragmento de ADN de interés en un _____ .

<p>vector</p> Signup and view all the answers

Empareja las siguientes etapas del proceso de clonación molecular:

<p>Inserción de fragmento de ADN = Uso de tecnología de ADN recombinante Introducción del vector = Colocación en célula hospedadora Selección de células = Identificación de células con ADN recombinante Multiplicación de células = Aumento de la cantidad de células que portan ADN</p> Signup and view all the answers

¿Qué se obtiene tras el proceso de unión de fragmentos de ADN con ADN ligasa?

<p>ADN recombinante (C)</p> Signup and view all the answers

La secuencia GAATTC es un ejemplo de un sitio de restricción altísimamente específico.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la finalidad de introducir el vector en una célula viva?

<p>Permitir que la célula reproduce y multiplique el ADN recombinante.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la bacteria más utilizada en clonación?

<p>E. coli (D)</p> Signup and view all the answers

Las células vegetales no se usan en experimentos de clonación.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de plásmido se utiliza en la clonación de plantas?

<p>Plásmido Ti</p> Signup and view all the answers

La bacteria E. coli se utiliza comúnmente como _____ para el clonaje de plásmidos.

<p>hospedadora</p> Signup and view all the answers

Asocia los siguientes tipos de células con su descripción:

<p>Células vegetales = Utilizadas para obtener organismos transgénicos Células animales = Usadas en experimentos de inserción de genes extraños Levaduras = Eucariotas unicelulares que crecen en medios de cultivo E. coli = Bacteria más usada en clonación</p> Signup and view all the answers

¿Qué característica debe tener una cepa bacteriana para favorecer la estabilidad de los vectores?

<p>Carecer de exonucleasas (D)</p> Signup and view all the answers

La elección de la célula hospedadora es independiente del vector de clonación empleado.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Menciona dos especies de células que pueden usarse como hospedadoras en clonación.

<p>Bacillus subtilis y E. coli</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son proteínas que cortan el ADN en secuencias específicas llamadas sitios de restricción.

Sitios de restricción

Los sitios de restricción son secuencias específicas de ADN donde las enzimas de restricción cortan.

Extremos cohesivos

Los extremos cohesivos son fragmentos de ADN que tienen secuencias que sobresalen, lo que les permite unirse fácilmente a otros fragmentos con secuencias complementarias.

ADN ligasa

La ADN ligasa es una enzima que junta fragmentos de ADN uniendo sus extremos.

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Clonación molecular

La clonación molecular es una técnica que permite obtener copias de un fragmento específico de ADN.

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ADN recombinante

El ADN recombinante es una molécula de ADN que se ha creado combinando fragmentos de ADN de diferentes fuentes.

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Tecnología del ADN recombinante

La tecnología del ADN recombinante es un conjunto de técnicas que permiten manipular el ADN y crear moléculas recombinantes.

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Clonación de ácidos nucleicos

La clonación de ácidos nucleicos es una técnica que permite obtener copias idénticas de una molécula de ADN.

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Extremos pegajosos

Extremos de un fragmento de ADN que se genera después de la acción de una enzima de restricción. Estos extremos son complementarios al sitio de restricción original. Esto permite la unión de diferentes fragmentos de ADN que han sido cortados con la misma enzima de restricción.

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Vector

Un fragmento de ADN que se utiliza como vehículo para introducir un gen o fragmento de ADN de interés en una célula hospedadora. Los vectores normalmente son plásmidos, virus o cromosomas que pueden replicarse de forma independiente de la célula hospedadora.

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Célula hospedadora

Célula que alberga un vector con el gen de interés.

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Selección y multiplicación de células

Proceso de seleccionar y multiplicar células que contienen el ADN recombinante. Las células que contienen el ADN recombinante son luego aisladas con métodos de selección.

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Inactivación del gen por inserción de ADN en el polylinker

Un gen clonado en un vector se inactiva cuando se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, lo que provoca la producción de colonias bacterianas blancas.

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Colonias azules: plásmidos no recombinantes

Si las colonias bacterianas crecen con un color azul, significa que los plásmidos no contienen ADN recombinante.

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Bacteriófagos o Fagos

Los bacteriófagos, también conocidos como fagos, son virus que infectan bacterias.

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Ciclo lisogénico de los fagos

Algunos fagos pueden insertar temporalmente su material genético en el cromosoma bacteriano mediante recombinación, un proceso llamado ciclo lisogénico. El fago lambda (λ) es un ejemplo de estos fagos.

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Vectores de clonación basados en bacteriófagos

Los vectores de clonación creados a partir del fago λ son capaces de transportar insertos de ADN de hasta 20 Kb.

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Fagémidos: vectores híbridos

Los fagémidos son vectores híbridos que combinan características de plásmidos bacterianos y fagos M13. Se reproducen como plásmidos, pero también pueden producir ADN monocatenario, útil para secuenciación y producción de sondas.

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Vectores de alta capacidad (BAC y YAC)

Los vectores de clonación de alta capacidad, como los BAC y YAC, permiten clonar fragmentos de ADN de gran tamaño (hasta 300 Kb para BAC y más de 1 Mb para YAC).

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Vectores lanzadera o transbordadores

Los vectores lanzadera o transbordadores contienen orígenes de replicación para dos hospedadores diferentes, permitiendo su replicación en ambos sistemas.

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Vector de Clonación

Un vector de clonación es utilizado para transportar un fragmento de ADN (inserto) entre dos células hospedadoras. En la primera célula, el inserto es amplificado. En la segunda célula, el gen amplificado se expresa.

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Inserción del gen

El proceso de clonación implica la inserción de un fragmento de ADN (inserto) dentro de un vector de clonación.

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Bacteria Recombinante

Una bacteria recombinante es una bacteria que contiene un vector de clonación con un inserto. Este vector puede ser un plásmido o un fago.

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Elección de la célula hospedadora

La elección de la célula hospedadora depende del vector de clonación utilizado y del objetivo del experimento.

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Células Hospedadoras Bacterianas

Las células más utilizadas como células hospedadoras para la clonación de vectores de clonación son las bacterias E. coli y Bacillus subtilis. Estas células son fáciles de cultivar y manipular, y crecen rápidamente.

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Levaduras como células hospedadoras

Las levaduras son organismos eucariotas unicelulares que se utilizan como hospedadoras para la clonación de vectores YAC.

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Células Vegetales y Animales como células hospedadoras

Las células vegetales y animales se utilizan como células hospedadoras para la clonación de genes extraños en estudios de organismos transgénicos.

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Plásmido en clonación génica

Un plásmido es un pequeño fragmento de ADN circular que se encuentra en algunas bacterias. Se utiliza como vector en la clonación génica, es decir, como vehículo para insertar un gen de interés en una célula huésped.

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Introducción del ADN recombinante

La introducción del ADN recombinante en una célula huésped es un paso crucial en la clonación génica. Permite que la célula huésped produzca la proteína codificada por el gen de interés.

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Selección y multiplicación

La selección y multiplicación de las células que portan el ADN recombinante es crucial para garantizar que solo las células que contienen el gen de interés se multipliquen.

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Expresión del gen de interés

La expresión del gen de interés permite la producción de la proteína codificada por el gen. Este es el objetivo final de la clonación génica.

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Ventajas de la clonación: Gran cantidad de ADN

La clonación génica ofrece la capacidad de obtener cantidades ilimitadas de una secuencia específica de ADN. Este es un beneficio significativo para la investigación y las aplicaciones.

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Ventajas de la clonación: Clonación de grandes secuencias

La clonación génica facilita la clonación de secuencias de ADN de gran tamaño, lo que es un desafío con otras técnicas como la PCR.

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Ventajas de la clonación: Bibliotecas genómicas

La clonación génica permite clonar el genoma completo de un organismo, dividiéndolo en segmentos. Estos fragmentos se pueden utilizar para crear bibliotecas genómicas.

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Ventajas de la clonación: Bibliotecas de ADNc

La clonación de ADNc permite la creación de bibliotecas de ADNc, que contienen copias de todos los ARNm presentes en una célula. Esto permite el estudio del transcriptoma, es decir, el conjunto de genes que se están expresando.

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Electroporación

Un método de transformación bacteriana que utiliza pulsos eléctricos de alto voltaje para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, permitiendo la entrada de vectores recombinantes.

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Biolística

Un método de transformación bacteriana que utiliza proyectiles de metal recubiertos con ADN para introducir el ADN en las células.

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Células no transformadas

Las células que no han incorporado ADN extraño.

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Células transformadas con vector recombinante específico

Las células que han incorporado el vector recombinante específico.

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Marcadores genéticos

Genes como resistencia a antibióticos, enzimas que producen reacciones coloreadas o proteínas fluorescentes que permiten identificar y seleccionar los clones recombinantes.

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Detección basada en dos genes de resistencia a antibióticos

Un método de detección de clones recombinantes basado en dos genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina).

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Inserción de ADN extraño en el gen de resistencia

Un método de detección de clones recombinantes basado en la interrupción del gen de resistencia por la inserción de ADN extraño.

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Células transformadas con vector no recombinante

Células que han incorporado un vector no recombinante o alguna molécula de ADN no deseada.

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Study Notes

Clonación molecular

  • Es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o ADNc, basado en la tecnología del ADN recombinante.
  • Requiere un análisis estructural y funcional de ácidos nucleicos (AN) con suficiente cantidad.
  • Implica la aplicación de técnicas de biología molecular.
  • La PCR se usa para la amplificación.
  • La clonación molecular no es lo mismo que la clonación animal.

Enzimas de restricción (endonucleasas de restricción)

  • Son enzimas bacterianas que cortan moléculas de ADN en secuencias específicas llamadas sitios de restricción.
  • Generalmente producen múltiples cortes.
  • Las enzimas de restricción más útiles cortan el ADN generando extremos cohesivos, que son muy reactivos.
  • ADN ligasa es una enzima que sella las uniones entre los fragmentos de restricción

Proceso de clonación molecular

  • Se inserta un fragmento de ADN de interés en un vector.
  • Se introduce el vector en una célula hospedadora.
  • Se seleccionan y multiplican las células que portan el ADN recombinante.
  • Se recupera el fragmento amplificado

Vectores de clonación

  • Son moléculas de ADN que pueden replicarse de manera autónoma en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN extraño sin perder su capacidad de replicación autónoma.
  • Actúan como vehículos de clonación, transportando los fragmentos que se quieren clonar al interior de la célula hospedadora.
  • Características de los vectores:
    • Tienen un origen de replicación (ORI).
    • Tienen un sitio múltiple de clonación o polylinker.
    • Tienen un marcador de selección (ej., genes de resistencia a antibióticos).
    • Algunos contienen un promotor que permite la transcripción del inserto. Algunos ejemplos son plásmidos, fagos, cósmidos, fagemidos, cromosomas artificiales

Tipos de vectores

  • Plásmidos: Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación. Pueden transportar insertos pequeños (3.5-5 kb) y tener 20 copias por célula. Ejemplos: pBR322, pUC18
  • Fagos: Son virus que infectan bacterias. Algunos tipos insertan temporalmente su material genético en el cromosoma bacteriano. Ejemplo: Fago lambda (λ).
  • Cósmidos: Vectores híbridos de ADN recombinante de fago λ y plásmidos. Permiten empaquetar insertos de mayor tamaño (hasta 50 kb).
  • Fagémidos: Vectores híbridos de plásmido y fago M13. Pueden replicar ADN de cadena simple y doble. Usados para producir sondas monocatenarias.
  • Cromosomas artificiales: Vectores de gran tamaño para transportar fragmentos grandes de ADN. Los más comunes son BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano) y YAC (Cromosoma Artificial de Levadura).

Células hospedadoras

  • Son células en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación.
    • Bacterianas: E. coli es la más utilizada.
    • Eucariotas: Levaduras, células vegetales, células animales (de insectos o mamíferos). Uso en experimentos de clonación para insertarlos en genes extraños.
  • Agrobacterium tumefaciens: bacteria del suelo, causa tumores o "agallas" en plantas, usada en la clonación de vegetales.

Técnicas de introducción del vector

  • Transformación bacteriana: Captación e internalización de moléculas de ADN desnudas por parte de la bacteria. Se busca que sean "competentes" para este proceso.
  • Transfección: Similar a la transformación pero en células eucariotas (principalmente animales). Se utiliza agentes químicos para introducir los vectores recombinantes. Agentes: fosfato de calcio, liposomas.
  • Transducción: Introducción de material genético extraño a una célula por la acción de un virus. El vector recombinante se empaqueta en el interior de la cápside del virus.
  • Electroporación: Se aplican pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células y vectores para aumentar la permeabilidad de las membranas y permitir el paso de los vectores al interior de las células.
  • Biolística: Se utilizan microesferas de metal (oro o tungsteno) cubiertas de ADN para impactar células y que se incorpore el ADN extraño.

Selección e identificación de clones

  • Se utilizan marcadores:
  • Genes de resistencia a antibióticos: detección de células que contienen el vector.
  • Proteínas fluorescentes: identificación de células que contienen el vector mediante luz UV.
  • Genes letales: selección de células que contienen el vector.
  • Estrategia cromogénica: se emplean bacterias lactosas negativas y vectores con genes de resistencia y LacZ. Las colonias con el vector recombinante aparecen en color azul, mientras que las que no tienen el inserto son blancas.

Bibliotecas de ADN

  • Son colecciones de vectores recombinantes clonados.
  • Tipos:
  • Genómicas: Contienen el genoma completo.
  • Cromosómicas: Parte de un cromosoma específico.
  • ADNc: Recopilación de genes transcritos en un tipo de célula en un momento específico, no contiene intrones, promotores o secuencias reguladoras.
  • Métodos de análisis de bibliotecas: identificar el clon o clones (hibridación, inmunológica), método del paseo cromosómico (en base a solapamiento) y secuenciación para descifrar la secuencia del ADN insertado.

Aplicaciones de la clonación molecular

  • Investigación básica: Estudios filogenéticos, diversidad genética, expresión génica.
  • Investigación aplicada:
    • Producción industrial de proteínas recombinantes (ej., insulina, hormona del crecimiento, factor VIII, vacunas).
    • Biorremediación: Creación de microorganismos para degradar productos tóxicos (ej., petróleo).
    • Producción de cultivos transgénicos (plantas y animales).
    • Terapia génica: Transferir genes normales a células somáticas para corregir enfermedades genéticas.

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Description

Este cuestionario profundiza en los conceptos clave relacionados con la vectorización en biotecnología. Se abordan temas como los tipos de vectores, el uso de ADNc y la transformación celular. Ideal para quienes estudian biología molecular o biotecnología.

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