Biologie Cellulaire: Mitochondries et Spectrophotométrie

Introduction à la Biologie Moléculaire

• Le cours est sur la Biologie Moléculaire, donné par le Dr DAGNOGO Oléfongo.
• Le conférencier a un doctorat en Biologie Fonctionnelle et Moléculaire, et un diplôme de l'Université de Technologie de Compiègne.

ADN Mitochondrial chez l'Homme

• L'ADN mitochondrial est l'un des sujets du cours.

Généralités sur la Mitochondrie

• La théorie endosymbiotique explique l'origine des mitochondries à partir de bactéries procaryotes.
• Ces bactéries ont été internalisées par des cellules eucaryotes primitives.
• Au cours de l'évolution, un transfert de gènes vers le noyau s'est produit, et une relation symbiotique s'est développée.
• Il y a une conservation des gènes mitochondriaux.
• Il y a une importation de protéines.

Arguments en faveur de la théorie endosymbiotique

• Absence de noyau, mais présence de 2 à 10 molécules d'ADN circulaire.
• Homologie de séquence avec l'ADN de certaines bactéries.
• Parenté entre le ribosome mitochondrial et le ribosome bactérien. Sensibilité à certains antibiotiques (comme le chloramphénicol).
• Composition biochimique de la membrane interne : absence de cholestérol et présence de cardiolipine.

Fonctions mitochondriales

• Synthèse d'ATP.
• Production de ROS ou radicaux libres.
• Thermogénèse.
• Synthèse des hormones stéroïdes.
• Homéostasie calcique.
• Mort cellulaire programmée (apoptose).
• Autres fonctions : Production de précurseurs des acides aminés non essentiels, synthèse de phospholipides. Synthèse de l'hème (avec le cytosol).

Structure mitochondriale

• La mitochondrie possède une membrane externe et une membrane interne.
• L'espace intermembranaire est entre les deux membranes.
• La matrice se trouve à l'intérieur de la membrane interne.
• Présence de crêtes mitochondriales.
• Des compartiments sont présents.

Structure mitochondriale (4 compartiments)

• Membrane externe : Bicouche lipidique proche de la membrane plasmique, riche en protéines et porines (passage passif de petites molécules).
• Espace intermembranaire : Contient des protons pour la production d'ATP, ainsi que le cytochrome c (impliqué dans l'apoptose).
• Membrane interne : Bicouche lipidique différente de la membrane externe, riche en protéines et cardiolipines. Pliée en crêtes. Riche en transporteurs et en complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire).
• Matrice : Contient l'ADN mitochondrial (ADNmt), les composants nécessaires à la transcription et la traduction (ARNt, ARNm, mitoribosomes), et de nombreux complexes enzymatiques (β-oxydation des acides gras, cycle de Krebs).

Le réseau mitochondrial

• Le réseau mitochondrial est dynamique et composé de mitochondries interconnectées.
• Il y a des processus de fission et de fusion.
• Il existe des protéines impliquées dans la dynamique du réseau.

Fusion vs Fission

• Mitofusines (Mfn1 et Mfn2) : impliquées dans la fusion de la membrane externe (interaction en trasl).
• OPA1 : impliqué dans la fusion de la membrane interne (crêtes ++).
• Drp1 : impliqué dans la fission, une protéine cytosolique.
• hFis1 : recrute Drp1 aux sites de fission.

Production d'ATP: Les OXPHOS

• Le couplage entre les réactions d'oxydo-réduction de la chaîne respiratoire et la synthèse d'ATP est effectué par l'intermédiaire d'un gradient de protons.
• L'ATP est produit dans les réactions OXPHOS mitochondriales.

La chaîne respiratoire

• Ensemble de complexes protéiques responsables de la phosphorylation oxydative.
• Le transfert des électrons le long des complexes de la chaîne respiratoire permet le pompage des protons au travers de la membrane interne.
• La synthèse d'ATP est couplée au transfert des électrons par le gradient de protons.

Origine des substrats des OXPHOS

• Les cofacteurs réduits NADH et FADH2 sont produits par le catabolisme des glucides, des lipides et des protéines.
• Les endroits de production de ces cofacteurs varient.

Relation structure-fonction énergétique mitochondriale

• La mitochondrie a un rôle central dans le métabolisme énergétique cellulaire.
• Le réseau mitochondrial est dynamique, régulé par des processus de fusion et de fission.
• Les gènes mitochondriaux, comme OPA1, MFN2, GDAP1, sont importants pour le maintien des fonctions mitochondriales.

Génétique mitochondriale: L'ADN MITOCHONDRIAL

• Les mitochondries possèdent leur propre génome.
• Cet ADN est sous forme d'une petite molécule circulaire.
• Il ne contient pas de partie non codante.
• Il code pour 37 gènes, incluant 13 sous-unités de la chaîne respiratoire.
• Il y a des ARN transfert et ribosomaux.
• Chaque mitochondrie contient 2 à 10 copies d'ADNmt.
• Une cellule peut avoir 10² -10⁶ mitochondries et 1000 copies d'ADNmt.

L'ADN MITOCHONDRIAL

• L'ADNmt est d'héritage maternelle.
• Il a une mutation 10-20 fois plus élevée que l'ADN nucléaire.
• Les mutations ponctuelles de l'ADNmt sont transmises par voie maternelle.
• Les délétions sont des cas sporadiques.
• Le concept de l'hétéroplasmie est important : l'expression des mutations dépend du taux d'hétéroplasmie.

Concept d'hétéroplasmie

• Coexistence de molécules normales et mutées au sein d'une même cellule, tissu ou individu.
• La proportion d'ADN muté varie selon les mitochondries et les tissus.
• L'effet seuil détermine le phénotype.
• Modification du phénotype lorsque le taux d'ADN muté dépasse une valeur critique, qui varie selon les tissus.

Double origine des protéines mitochondriales

• 20% des protéines mitochondriales sont codées par l'ADN mitochondrial.
• Le reste (80%) est codé par l'ADN nucléaire et importées dans la mitochondrie.

Origine des pathologies mitochondriales

• Une mutation de l'ADN mitochondrial peut affecter une sous-unité d'un complexe des OXPHOS.
• Les mutations peuvent concerner les gènes ARNt ou ARNr.
• Une mutation d'un gène nucléaire peut affecter une protéine dirigée vers les mitochondries. Elles affectent les complexes OXPHOS, les protéines d'assemblage, la machinerie de réplication (ADN pol y), etc.

Origine des pathologies mitochondriales

• Une altération du fonctionnement mitochondrial est causée par un dysfonctionnement cellulaire.
• L'accumulation de fer mitochondrial et la génération de ROS peuvent en être les facteurs.

Les maladies mitochondriales

• Maladies multisystémiques avec une expression tissulaire spécifique.
• Elles peuvent être héréditaires mendéliennes ou sporadiques.

Le diagnostic des maladies mitochondriales

• L'exploration métabolique in vivo est un premier dépistage des déficits de la chaîne respiratoire.
• L'exploration biochimique étudie les protéines de la chaîne respiratoire ou de facteurs de contrôle du système OXPHOS.
• Le diagnostic moléculaire nécessite l'étude des deux génomes.

Exploration in vivo: Le cycle redox

• Un déficit enzymatique modifie les équilibres d'oxydoréduction.
• L'accumulation d'équivalents réduits (NADH, FADH) est observée.
• L'acétoacétate est transformé en 3-hydroxybutyrate dans la mitochondrie.
• Le rapport 3-hydroxybutyrate/acétoacétate est augmenté.
• Transformation du pyruvate en lactate dans le cytoplasme.
• Le rapport lactate/pyruvate est important.

Exploration in biochimique

• L'activité de la chaîne respiratoire est mesurée via la polarographie (mesure de consommation d'oxygène par des fractions mitochondriales enrichies).
• La spectrophotométrie permet de mesurer l'activité des complexes de la chaîne respiratoire avec des donneurs ou accepteurs d'électrons spécifiques.

Etudes spectrophotométriques

• Homogénats de différents tissus (muscle, cœur, foie, cellules) sont utilisés pour analyser les complexes de la chaîne respiratoire.

Polarographie

• Mesure directe de la consommation d'oxygène.
• Variation du flux d'oxygène correspond aux différentes étapes de la chaîne respiratoire.
• Importance du rapport ATP/O.

Diagnostic moléculaire

• Extraction de l'ADNmt des muscles, sang, fibroblastes.
• Recherche de délétions, déplétions génétiques, et mutations ponctuelles.
• Techniques utilisées: Southern blot et PCR (longue ou quantitative).
• Séquençage, SSCP, DGGE, DHPLC, etc.

Diagnostic moléculaire

• Screening complet de l'ADNmt est effectué via différentes méthodes (Surveyor) pour identifier les mutations hétéroplasmiques.
• La puce de reséquençage Affymetrix (GeneChip Mitochondrial Resequencing 2.0 Array) permet d'identifier les mutations homoplasmiques.

Clinique et examens paracliniques

• Analyse comprenant prélèvement sanguin, biopsies tissulaires, examens biologiques (lactate, dérivés du cycle de Krebs), IRM cérébrale, etc.
• Biopsies tissulaires (muscle, foie, rein) pour étudier le tissu affecté
• Histologie est effectuée pour visualiser le tissu.
• Analyse moléculaire permettant de rechercher différentes délétions ou mutations du génome mitochondrial ou nucléaire. 

Diagnostic et exploration

• Méthodes d'exploration (spectrphotométrie et polarographie) pour dépister les dysfonctionnements mitochondriaux et analyser les complexes de la chaîne respiratoire.
• Exploration biochimique permettant de mesurer les activités des complexes de la chaîne respiratoire, ce qui aide à localiser le défaut.
• Les déficits de différents complexes de la chaîne respiratoire sont identifiés via des analyses spectrophotométriques

Ce quiz explore les caractéristiques des mitochondries, leur rôle dans la cellule et les techniques utilisées pour analyser leur fonction. Il met également l'accent sur l'utilisation de la spectrophotométrie et de la polarographie pour diagnostiquer les maladies mitochondriales. Testez vos connaissances sur ces sujets fascinants de la biologie cellulaire !