Biologie Cellulaire - Cultures et Validation
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Questions and Answers

Quel est l'objectif principal des méthodes de dissection et enzymatiques pour les cellules organisées en tissu ?

  • Culture des cellules
  • Analyse génétique
  • Stockage des cellules
  • Isolation des cellules (correct)
  • Les PBMC sont des cellules poly-nucléaires du sang périphérique.

    False (B)

    Quel est le pH du tampon PBS utilisé pour la dilution des cellules ?

    7,4

    Le test de viabilité des cellules peut être effectué avec le colorant ________.

    <p>Bleu de Trypan</p> Signup and view all the answers

    Associez les méthodes de culture aux conditions appropriées :

    <p>RPMI1640 = Méthodes de culture en suspension Microplaques = Support non traité par des molécules d'adhésion 37°C = Température de culture 5% CO2 = Condition d'oxygénation</p> Signup and view all the answers

    Quelle est la fréquence générale du renouvellement du milieu pour les cellules?

    <p>2-3 jours (B)</p> Signup and view all the answers

    Le pH neutre est défini comme étant entre 6.5 et 7.5.

    <p>False (B)</p> Signup and view all the answers

    Quels agents peuvent contaminer les cultures cellulaires?

    <p>Biologiques ou chimiques</p> Signup and view all the answers

    Un pH inférieur à ______ menace la viabilité des cellules.

    <p>6.5</p> Signup and view all the answers

    Associez les types de contaminants aux effets qu'ils peuvent avoir sur les cultures cellulaires:

    <p>Contaminants biologiques = Agissent sur la croissance Contaminants chimiques = Altèrent les caractéristiques Concentration élevée = Peut devenir toxique Types cellulaires sensibles = Réagissent plus fortement aux agents</p> Signup and view all the answers

    Quelle est la première étape de la validation d'une molécule thérapeutique?

    <p>Étude in vitro (D)</p> Signup and view all the answers

    Les cultures primaires sont immortelles et peuvent se diviser indéfiniment.

    <p>False (B)</p> Signup and view all the answers

    Qu'est-ce qu'une lignée cellulaire?

    <p>Un groupe de cellules stables provenant de la même cellule avec une capacité illimitée de se diviser.</p> Signup and view all the answers

    La ______________ représente le transfert de cellules d’un flacon de culture à un ou plusieurs autres.

    <p>repiquage</p> Signup and view all the answers

    Associez les étapes de production des biomolécules à leur description:

    <p>Upstream = Culture cellulaire Downstream = Purification et récupération des biomolécules Formulation = Préparation finale avant l’utilisation Essai clinique = Tests sur des sujets humains</p> Signup and view all the answers

    Quel exemple de biomolécule peut être produit grâce aux biotechnologies?

    <p>Anticorps monoclonaux (C)</p> Signup and view all the answers

    Les essais cliniques se déroulent en plusieurs phases.

    <p>True (A)</p> Signup and view all the answers

    Quel est le rôle de la FDA dans le processus de validation des molécules thérapeutiques?

    <p>Validation et approbation des médicaments pour la commercialisation.</p> Signup and view all the answers

    Quel est le pH optimal pour le milieu de culture cellulaire?

    <p>7,2 - 7,4 (A)</p> Signup and view all the answers

    Le CO2 présent dans l'incubateur aide uniquement à la prolifération des cellules.

    <p>False (B)</p> Signup and view all the answers

    Quel indicateur de pH est utilisé dans le milieu de culture pour contrôler les variations de pH?

    <p>Rouge de phénol</p> Signup and view all the answers

    Dans le système d'incubation, l'atmosphère est constituée de 95% d'air et de ______% de CO2.

    <p>5</p> Signup and view all the answers

    Associez les additifs aux besoins qu'ils satisfont dans la culture cellulaire:

    <p>Sérum = Facteurs de croissance et hormones O2 = Prise en charge du métabolisme cellulaire CO2 = Régulation du pH Vapeur d'eau = Prévention de l'évaporation</p> Signup and view all the answers

    Quelles sont les conséquences d'une modification du pH du milieu de culture?

    <p>Blocage métabolique et toxicité cellulaire (C)</p> Signup and view all the answers

    La température du milieu de culture doit être ajustée pour correspondre à celle de l'hôte d'origine.

    <p>True (A)</p> Signup and view all the answers

    Le _______ est responsable de la dégradation des sucres, conduisant à l'acidification du milieu de culture.

    <p>prolifération des cellules</p> Signup and view all the answers

    Quel procédé est utilisé pour détacher les cellules de leur support?

    <p>Grattage mécanique (D)</p> Signup and view all the answers

    Les cellules adhérentes dans un système Transwell ne peuvent pas développer de polarité.

    <p>False (B)</p> Signup and view all the answers

    Quel type de cellules est utilisé pour le test de perméabilité cellulaire dans un Transwell?

    <p>Cellules HUVEC</p> Signup and view all the answers

    Les ______ sont des récipients avec des supports perméables à base de membrane dans un système Transwell.

    <p>inserts Transwell</p> Signup and view all the answers

    Associez les méthodes de culture aux descriptions appropriées:

    <p>In vitro = Lignées cellulaires Ex vivo = Cellules primaires In situ = Culture des explants In vivo-like = 3D</p> Signup and view all the answers

    Quel test permet de déterminer la toxicité des molécules pour les cellules endothéliales?

    <p>Test de perméabilité (A)</p> Signup and view all the answers

    Les cellules dendritiques tolérogènes et TCD8+ peuvent être étudiées grâce à la co-culture.

    <p>True (A)</p> Signup and view all the answers

    Le chimiotactisme implique l'interaction ______ qui permet aux cellules de migrer.

    <p>cellulaire</p> Signup and view all the answers

    À quelle température se réalise la cryoconservation pour une durée prolongée?

    <p>-180 °C (A)</p> Signup and view all the answers

    Le glycérol est plus efficace que le DMSO comme cryoprotecteur.

    <p>False (B)</p> Signup and view all the answers

    Qui a découvert l'effet cryoprotecteur du glycérol?

    <p>Polge, Smith et Parkes</p> Signup and view all the answers

    Les cellules sont conservées à des températures allant de ________ °C à ________ °C.

    <p>-180, -196</p> Signup and view all the answers

    Quel est le rôle des cryoprotecteurs?

    <p>Protéger l'eau contre la cristallisation (B)</p> Signup and view all the answers

    La déshydratation peut affecter la viabilité lors de la cryoconservation.

    <p>True (A)</p> Signup and view all the answers

    Associez les cryoprotecteurs avec leur année de découverte :

    <p>Glycérol = 1949 DMSO = 1959</p> Signup and view all the answers

    Quel est le mécanisme d'action du DMSO?

    <p>Protéger contre la cristallisation de l'eau intra et extracellulaire.</p> Signup and view all the answers

    Flashcards

    Méthodes d'isolement des cellules

    L'isolement de cellules en tissu se fait par deux méthodes : la dissection et la méthode enzymatique.

    PBMC

    Les PBMC (cellules mononuclées du sang périphérique) sont un type de cellules sanguines souvent utilisées en recherche.

    Séparation sur gradient de densité (Ficoll)

    Une technique de purification de cellules sanguines qui sépare les cellules en fonction de leur densité.

    Test de viabilité cellulaire (bleu de Trypan)

    Le bleu de Trypan est un colorant qui ne peut pénétrer que dans les cellules dont la membrane est endommagée. C'est donc un indicateur de viabilité cellulaire.

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    Culture cellulaire en suspension

    La culture cellulaire en suspension est une méthode qui permet aux cellules de se multiplier en suspension dans un milieu liquide.

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    Culture cellulaire

    Une technique qui étudie les phénomènes physiologiques et les mécanismes biochimiques sans expérimentations sur des organismes vivants.

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    Primoculture

    Une culture de cellules provenant directement d'un organisme vivant, sans modification génétique.

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    Repiquage

    Transfert de cellules d'un flacon de culture à un ou plusieurs autres.

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    Culture secondaire

    Une culture de cellules qui provient d'un repiquage de la primoculture.

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    Lignée cellulaire

    Un groupe de cellules stables provenant de la même cellule, avec une capacité de division illimitée.

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    Cellule cancéreuse

    Une lignée cellulaire dérivant d'une cellule cancéreuse.

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    Cellule transformée

    Une cellule qui est rendue cancéreuse par une mutation génétique.

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    Une cellule qui est rendue cancéreuse par une mutation génétique.

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    Quelles sont les méthodes de détachement cellulaire ?

    Le détachement des cellules de leur support et leur séparation les unes des autres peut être effectué par grattage mécanique ou action enzymatique (trypsine et collagénase).

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    Qu'est-ce qu'un système Transwell ?

    Un système de culture cellulaire qui utilise des inserts Transwell avec des membranes perméables pour permettre aux cellules adhérentes de développer une polarité et d'exprimer des fonctions spécifiques comme le transport.

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    Qu'est-ce qu'un test de chimiotactisme ?

    Un test qui mesure la capacité des cellules à migrer vers un chimioattractant à travers une membrane poreuse dans un système Transwell.

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    Qu'est-ce qu'un test de perméabilité cellulaire des cellules endothéliales ?

    Un test qui évalue la capacité des cellules endothéliales à former des jonctions serrées et à réguler la perméabilité vasculaire en mesurant la diffusion d'un traceur à travers une monocouche de cellules HUVEC.

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    Qu'est-ce qu'une co-culture cellulaire ?

    Une méthode de culture cellulaire qui implique la croissance de deux types de cellules différents en présence l'un de l'autre pour étudier leurs interactions et leurs effets mutuels.

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    Quelles sont les lignes cellulaires ?

    L'utilisation de cellules provenant de sources humaines ou animales qui sont cultivées dans un environnement artificiel.

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    Qu'est-ce que la culture cellulaire 3D ?

    Les cultures cellulaires trois dimensions (3D) imitent l'environnement tridimensionnel des cellules dans l'organisme, en utilisant des matrices extracellulaires, des échafaudages et des protéines.

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    Que sont les cellules primaires et les cultures d'explants ?

    Des cellules primaires sont des cellules extraites directement d'un organisme vivant, tandis que les cultures d'explants impliquent la culture de tissus ou d'organes entiers.

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    Fréquence du changement de milieu

    La fréquence du changement de milieu dans les cultures cellulaires dépend des cellules, mais généralement, elle se fait 2-3 jours. Le renouvellement est crucial même en dehors des phases de prolifération pour éliminer les produits métaboliques nocifs.

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    pH et viabilité cellulaire

    Le pH est un paramètre physico-chimique crucial pour la survie des cellules. Les cellules vivantes nécessitent un pH neutre. Un pH inférieur à 6.5 compromet leur viabilité.

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    Contrôle de la confluence

    L'état de confluence fait référence à la densité des cellules dans un milieu de culture. Il est recommandé de vérifier l’état de confluence tous les deux jours afin de s'assurer que les cellules ne sont pas trop nombreuses et ne se concurrencent pas pour les ressources.

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    Contaminations en culture cellulaire

    Les contaminations, biologiques ou chimiques, peuvent nuire gravement aux cultures cellulaires. Elles altèrent la croissance, les fonctions cellulaires et la fiabilité des résultats.

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    Importance du contrôle de la qualité des cultures cellulaires

    Les cultures cellulaires sont des outils précieux en recherche, mais leur qualité est essentielle pour des résultats fiables. Le contrôle rigoureux des contaminants, du pH et de la confluence est crucial pour garantir la fiabilité des expérimentations.

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    Cryoconservation

    La cryoconservation est un procédé qui permet de conserver des cellules ou des tissus à très basse température, entre -180°C et -196°C, afin de suspendre toute activité biologique et de prévenir leur détérioration.

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    Azote liquide en cryoconservation

    L'azote liquide, à une température de -196°C, permet la conservation à long terme des cellules et des tissus.

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    Cryoprotecteurs

    Les cryoprotecteurs sont des substances chimiques qui protègent les cellules des dommages causés par la congélation. Ils réduisent la formation de glace dans les cellules et maintiennent leur viabilité.

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    Glycérol

    Le glycérol est un cryoprotecteur qui pénètre dans les cellules et protège contre la formation de glace intra et extracellulaire. Cependant, son pouvoir pénétrant est faible et lent.

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    DMSO

    Le DMSO (diméthylsulfoxyde) est un cryoprotecteur plus efficace que le glycérol. Il pénètre rapidement dans les cellules et offre une meilleure protection contre la formation de glace.

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    Congélation progressive

    La congélation progressive est une technique qui consiste à refroidir les cellules progressivement pour réduire la formation de cristaux de glace et les dommages cellulaires.

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    Décongélation

    La décongélation, étape inverse de la congélation, consiste à réchauffer les cellules à une vitesse contrôlée pour éviter les dommages causés par le changement rapide de température.

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    Viabilité cellulaire

    La viabilité cellulaire, également appelée survie cellulaire, correspond à la capacité des cellules à survivre après un traitement, comme la congélation et la décongélation.

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    Quel est le pH optimal pour les cellules en culture ?

    Le pH optimal pour la plupart des cellules en culture est similaire à celui du sang humain, soit entre 7,2 et 7,4. Cependant, le pH optimal peut varier en fonction du type de cellule.

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    Comment est-ce que l'on mesure le pH dans le milieu de culture ?

    Le rouge de phénol est un indicateur de pH qui change de couleur en fonction de l'acidité du milieu de culture. Il devient jaune en milieu acide, rouge orangée en milieu neutre et violet en milieu alcalin.

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    Pourquoi le milieu de culture devient-il jaune avec le temps ?

    La prolifération cellulaire conduit à l'acidification du milieu de culture car les cellules dégradent les sucres. Le milieu devient jaune et doit être renouvelé pour permettre la prolifération des cellules.

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    Quel est le rôle du CO2 dans le milieu de culture ?

    Le CO2 joue un rôle essentiel dans la régulation du pH du milieu de culture. Il maintient l'équilibre du bicarbonate (HCO3-) qui agit comme un tampon.

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    Quelle est la température optimale pour les cellules en culture ?

    La température optimale pour la plupart des cellules en culture est de 37°C, la même que la température corporelle humaine.

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    Quel est le rôle du sérum dans le milieu de culture ?

    Le sérum est un composant essentiel du milieu de culture car il contient des facteurs de croissance, des hormones, des protéines de transport et des molécules d'adhésion nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules.

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    Quels sont les types de protéines de transport présentes dans le sérum ?

    Le sérum fournit des protéines de transport comme l'albumine et la transferrine qui aident à transporter des éléments nutritifs et des hormones vers les cellules.

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    Comment est composé l'environnement gazeux du milieu de culture ?

    L'environnement gazeux du milieu de culture doit être contrôlé pour maintenir des conditions optimales pour la croissance des cellules. L'atmosphère d'incubation est généralement composée d'air (95%) et de CO2 (5%).

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    Study Notes

    Introduction et Définitions

    • En biologie, la culture cellulaire est un ensemble de techniques pour faire croître des cellules en dehors de leur organisme d'origine.
    • La culture de cellules animales permet l'observation des cellules vivantes dans des conditions favorables.
    • Une culture cellulaire est un système expérimental simple par rapport à un animal entier et fournit un système qui peut être étudié dans des conditions contrôlées.
    • La culture cellulaire est un outil majeur en sciences de la vie.
    • La culture de cellules animales fait partie de la culture de tissu, qui est constituée des cultures d'organes, de tissus et de cellules.
    • La culture d'organes implique le maintien d'organes en dehors de l'organisme.
    • La culture de tissu implique le maintien de tissus en dehors de l'organisme pour conserver leurs fonctions spécifiques.
    • La culture cellulaire implique le maintien de cellules non organisées en tissu, capables de se diviser et exprimer des métabolismes et fonctions spécifiques in vitro.

    Applications

    • La culture cellulaire est utilisée dans la biologie cellulaire pour étudier la différenciation, le vieillissement cellulaire, l'inflammation et les mécanismes du cancer.
    • En santé, elle est employée pour diagnostiquer des maladies, tester des molécules thérapeutiques pharmacologiquement actives sur des cellules.
    • La culture cellulaire est utilisée en biotechnologie pour la production des biomolécules à usage thérapeutique. (ex: insuline, interférons, cytokines, anticorps monoclonaux, vaccins).

    Méthodes d'Obtention et Purification

    • Deux types de cellules sont distingués : les cellules circulantes et les cellules en cohésion/adhérentes.
    • Les cellules circulantes (ex: PBMC, monocytes, lymphocytes) sont obtenues par les techniques habituelles de prélèvement suivi de centrifugation/gradient de densité (Ficoll d=1,077).
    • Les cellules organisées en tissu (ex: cellules dendritiques, macrophages, hépatocytes, épithéliales) sont obtenues soit par dissection soit par des méthodes enzymatiques.
    • L'exemple 1 des PBMC (cellules mononuclées du sang périphérique) implique:
      • Prélèvement sanguin/anticoagulant
      • Décantation à +4°C
      • Récupération du plasma
      • Dilution du culot
      • Utilisation d'un tampon PBS, (Phosphate Buffer Saline), pH 7,4.
      • Verser le sang dilué sur le Ficoll d=1,077
      • Centrifugation
    • Prélever l'anneau de PBMC et procéder à un lavage par PBS-NH Cl /4 centrifugation et suspension du culot cellulaire dans un volume minimum de RPMI-1640.

    Méthodes de Culture

    • Les flacons de culture (boites Falcon/Flasks) sont des boites stériles en polystyrène qui ne présentent pas de toxicité pour les cellules et permettent l'observation au microscope optique.
    • Les flacons/boites peuvent être à bouchon fermé (système clos), ou ventilés (semi-clos) ; ces derniers sont mieux adaptés à la culture cellulaire.
    • Les tubes à échantillons (Falcon), les grattoirs, les boites de Pétri, les plaques multipuits (microplaques) à 6, 12, 48 et 96 puits, les agitateur pour spinner, les centrifugeuses, les réfrigérateurs/congélateurs, les microscopes à phase inversée, les cellules Malassez, le système de filtration (sous vide), et les filtres pour seringues sont des équipements importants en culture cellulaire.
    • Les flacons spinner, les cryotubes et les microtubules sont utilisés pour la culture cellulaire.
    • L'appareil et les équipements en culture cellulaire nécessitent des conditions de stérilité absolues, car toute contamination microbienne entraine la lyse cellulaire.
    • Des hottes à flux laminaire sont utilisées pour créer une zone de manipulation stérile.

    Méthodes d'entretien des cellules en culture

    • Le changement du milieu de culture: le milieu doit être changé toutes les 2 à 3 jours. Un indicateur de pH (rouge de phénol) est utilisé pour suivre les variations de pH.
    • Le repiquage: les cellules adhérentes sont repiquées dans de nouveaux contenants après la formation d'une nappe confluente. Le détachement des cellules de leur support et la séparation des cellules impliqueront un grattage mécanique ou une action enzymatique (Trypsine).
    • Le système Transwell: utilise un récipient avec un support de membrane perméable qui permet aux cellules adhérentes de développer une polarité et d'acquérir des fonctions spéciales comme le transport.

    Méthodes de co-culture

    • Cette méthode est utilisée pour étudier des interactions entre deux types de cellules distincts, comme par exemple les cellules dendritiques tolérogènes et TCD8+.

    Types de cultures cellulaires

    • In vitro : lignées cellulaires
    • Ex vivo : cellules primaires
    • In situ : culture des explants
    • In vivo-like : 3D

    Culture cellulaire 3D

    • Les cellules normales du corps humain vivent dans un environnement à trois dimensions, entourées par des cellules, des membranes, des couches fibreuses et des protéines.
    • Les matrices extracellulaires jouent un rôle crucial dans la morphologie et la fonctionnalité in vivo.

    Systèmes microfluidiques/Microfluidic device : Organ-on-chip

    • La combinaison de la culture 3D et de la technologie microfluidique permet l'étude de l'efficacité de la thérapie cellulaire adoptive T/cancer en utilisant les tissus d'un patient.

    Les besoins nutritifs des cellules en culture

    • Les besoins des cellules en culture sont similaires aux besoins trouvés in vivo.

    • Le milieu de culture doit fournir des nutriments, maintenir un pH et une osmolarité constants.

    • Les milieux de culture peuvent être empiriques (classiques) ou définis.

    • Le milieu empirique contient des sels minéraux, des métaux, du glucose, des acides aminés, des vitamines et des tampons.

    • Le milieu défini quant à lui a une composition quantifiée et précise pour supporter la culture d'un seul type de cellule.

    • Un milieu de culture est composé d'un milieu de base et d'additifs.

    • Le milieu de base contient: les sels minéraux, les métaux, les molécules énergétiques (sucres : Glucose, galactose, mannose, fructose, acides cétoniques, Acides aminés ), les vitamines, et des tampons.

    • les additifs sont le sérum, les facteurs de croissance, les antibiotiques).

    • Le sérum contient des hormones, des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion, des protéines de transport, etc.

    • Les facteurs de croissance sont des molécules polypeptidiques qui participent à la prolifération cellulaire, à la différenciation et la survie.

      • Les facteurs de croissance importants sont: l'EGF, l'IGF, le NGF,le PDGF, le FGF, le TGF.

    Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires

    • Le maintien fonctionnel des cultures cellulaires nécessite la préservation des fonctions spécifiques des cellules tout en assurant leur prolifération.
    • Le contrôle des contaminations (biologiques et chimiques) est essentiel pour la qualité des résultats de recherche. Les contaminations peuvent altérer les fonctions cellulaires et impacter les résultats.
    • Les contaminations chimiques sont causées par: Endotoxines, ions métalliques, traces de détergents chimiques, résidus de germicides/pesticides, impuretés du CO2.
    • Les contaminations biologiques sont causées par: Levures, moisissures, bactéries, mycoplasmes, virus.
    • Contrôle des mycoplasmes: La détection se fait via des méthodes directes ou indirectes(ex: coloration de l'ADN).

    La conservation des cellules en culture

    • La cryoconservation est un procédé qui permet de préserver les cellules et leurs fonctions pendant de nombreuses années.
    • Les cryoprotecteurs (ex: DMSO, glycérol) sont utilisés pour protéger les cellules contre la formation de glace.
    • La congélation et la décongélation doivent être progressives.
    • Un test de viabilité est effectué systématiquement après la décongélation.

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    Description

    Testez vos connaissances sur les méthodes de culture cellulaire et la validation des molécules thérapeutiques. Ce quiz couvre des sujets tels que les conditions de culture, le pH des tampons et les agents contaminant. Préparez-vous à répondre à des questions pratiques sur la biologie cellulaire et la viabilité cellulaire.

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