Biochemie Zell-Lyse und Proteinanalytik

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Welches Reagenz wird zur Zerstörung der Zellmembran eingesetzt?

SDS (correct)

NaCl

CH3COOK

Lysozym

Welche Funktion hat die NaCl-Lösung im Zellaufbereitungsprozess?

Stabilisierung der Zellmembran

Denaturierung der Proteine

Fällung der DNA

Plasmolyse und Unterstützung der Zell-Lyse (correct)

Was passiert während der Fällung von Proteinen?

Die Zellen werden undifferenziert

Proteine lösen sich vollständig auf

Monomere Protein aggregieren zu großen Komplexen (correct)

Proteine bilden kleine Aggregate

Was bewirkt die Zugabe von 240 µL 5M CH3COOK?

Es wird für die Fällung der Proteine verwendet Signup and view all the answers

Wie wirken sich stark geladene Ionen auf die Proteine aus?

Sie entziehen den Proteinen die Hydrathülle Signup and view all the answers

Welche Substanz wird NICHT zur Zell-Lyse verwendet?

Zucker Signup and view all the answers

Was ist die Hauptursache für die Aggregatbildung der Proteine?

Hydrophobe Wechselwirkungen Signup and view all the answers

Wie viel Lysozym wird zur Resuspension der Zellen hinzugefügt?

Nicht angegeben Signup and view all the answers

Welche Funktion hat EDTA im Puffer I?

Komplexierung von zweiwertigen Metallkationen Signup and view all the answers

Was bewirkt der Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH) in dem beschriebenen Prozess?

Er zerstört die Zellmembran und denaturiert die DNA Signup and view all the answers

Welche Rolle spielt die Essigsäure im Puffer III?

Neutralisierung von NaOH und Renaturierung der DNA Signup and view all the answers

Was erfolgt nach der Zugabe von Isopropanol?

Plasmid-DNA fällt aus Signup and view all the answers

Wie wirkt sich die Zugabe von 200 µL Puffer II auf die Zellen aus?

Es lysisiert die Zellen Signup and view all the answers

Was sedimentiert nach der Zentrifugation in Schritt 5?

Zelltrümmer, Proteine und chromosomale DNA Signup and view all the answers

Welches Element ist in der Zellwand von gramnegativen Bakterien spezifisch?

Äußere Membran Signup and view all the answers

Welche Aussage beschreibt die Wirkung von Tris im Puffer I?

Es stabilisiert den pH bei 8,0 Signup and view all the answers

Was geschieht mit den Proteinen während des Zentrifugierens bei 13000 u/min?

Sie sedimentieren zusammen mit den Zelltrümmern. Signup and view all the answers

Welches Reagenz wird verwendet, um die Proteine in der alternativen Methode zu fällen?

Phenol Signup and view all the answers

Was bleibt in der wässrigen Phase, wenn Phenol zugegeben wird?

Plasmid-DNA und RNA Signup and view all the answers

Wie viel Phenol wird in der alternativen Methode zugegeben?

700 µL Signup and view all the answers

Welches Material bleibt vermutlich bei der Zentrifugation nicht in der wässrigen Lösung?

Proteine Signup and view all the answers

Was passiert mit der Phasentrennung durch Zentrifugation?

Eine klare Phasentrennung wird erreicht. Signup and view all the answers

Was ist die Hauptfunktion von Lysozym in dieser Methode?

Aufbrechen der Zellwände Signup and view all the answers

Was ist die Rolle von 10% SDS in dem Verfahren?

Es denaturiert Proteine. Signup and view all the answers

Was passiert mit chromosomalen Fragmenten beim Zellaufschluss?

Sie werden in kleinere Fragmente zerlegt. Signup and view all the answers

Wie unterscheiden sich Plasmide von chromosomalen DNA-Fragmente bei der Denaturierung?

Plasmid-DNA bleibt dank Überspiralisierung intakt. Signup and view all the answers

Welche Aussage trifft auf die Kugelform von Chromosomen bei Bakterien zu?

Chromosomen können entweder kreisförmig oder linear sein. Signup and view all the answers

Was geschieht nach einer schnellen Neutralisierung der Plasmid-DNA?

Die Plasmid-DNA renaturiert korrekt und Wasserstoffbrücken entstehen. Signup and view all the answers

Warum können Plasmide gezielt isoliert werden?

Die Form der Plasmide und der chromosomalen Fragmente unterscheidet sich. Signup and view all the answers

Welcher Puffer wird zur Resuspension der Zellen verwendet?

Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0). Signup and view all the answers

Welche Eigenschaft haben die meisten Plasmide?

Sie sind klein, kreisförmig und überspiralisiert. Signup and view all the answers

Was ist das typische Ergebnis einer langsamen Neutralisierung der chromosomalen DNA?

Es entsteht eine verworrene Masse, die sedimentiert. Signup and view all the answers

Wie wird der Aktivator des lac-Operons aktiviert?

Durch Anlagerung von cAMP an CAP Signup and view all the answers

Welche Aussage über LacI-Repressor ist korrekt?

Allolactose stabilisiert die inaktive Form von LacI Signup and view all the answers

Was geschieht bei Lactosemangel?

LacI bindet an die DNA und verhindert Transkription Signup and view all the answers

Welche der folgenden Informationen ist typisch für T7 Polymerase?

Sie erkennt nur ihren eigenen Promotor Signup and view all the answers

Was passiert, wenn sowohl Glucose als auch Lactose vorhanden sind?

Die cAMP-Konzentration ist niedrig Signup and view all the answers

Welche Aussage trifft auf lacUV5 zu?

Es ist eine mutierte Version des lac-Promotors Signup and view all the answers

Was beschreibt die Beziehung zwischen cAMP und Glucose im Stoffwechsel?

Die cAMP-Konzentration ist umgekehrt proportional zur Glucosekonzentration Signup and view all the answers

Wie beeinflusst Lactose den LacI-Repressor?

Lactose stabilisiert die inaktive Konformation von LacI Signup and view all the answers

Welche Rolle spielt SDS in der SDS-PAGE?

SDS denaturiert Proteine und bindet an sie. Signup and view all the answers

Welcher Bestandteil sorgt für eine hohe Dichte im Probenpuffer?

Glycerol Signup and view all the answers

Was ist die Funktion von β-Mercaptoethanol im Probenpuffer?

Es reduziert Disulfidbrücken zu freien Thiolen. Signup and view all the answers

Welches pH hat das Trenngel in der SDS-PAGE?

pH 8,8 Signup and view all the answers

Was wird benötigt, um 1 Liter Tris-Glycin Puffer herzustellen?

3 g Tris, 14,4 g Glycin, 10 mL 10% SDS, Wasser Signup and view all the answers

Wie viel 10% Ammoniumperoxodisulfat ist für das Trenngel erforderlich?

30 µL Signup and view all the answers

In welchem Puffer wird die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese oft durchgeführt?

Tris-Glycin Puffer Signup and view all the answers

Welche Funktion hat der Glycin-Anteil im Sammelgel?

Er konzentriert die Proteine. Signup and view all the answers

Wie viel Wasser ist im 12% Trenngel enthalten?

1,67 mL Signup and view all the answers

Was geschieht, nachdem die Proteine in das Sammelgel eingewandert sind?

Die Proteine konzentrieren sich und wandern dann in das Trenngel. Signup and view all the answers

Study Notes

Zell-DNA Präparation

Die Präparation der gesamten Zell-DNA beinhaltet Schritte zur Isolierung der DNA aus Zellen.
Zellbestandteile wie chromosomale DNA, Plasmid-DNA, Proteine und RNA sind in den Zellen enthalten.
Verunreinigungen durch Zellwand und -membran müssen entfernt werden.
Die Schritte zur Zell-DNA Präparation beinhalten Zell-Lyse, Entfernung von Proteinen, Fällung der DNA und deren Auflösung.
Die benötigten Reagenzien (z.B. TE-Puffer, Lysozym, SDS, NaCl, CH3COOK, Ethanol) unterstützen die verschiedenen Phasen der Präparation.
Die Präparation von Zellwänden beinhaltet die Entfernung von Zellwänden mit Lysozym um die DNA freizusetzen und zu isolieren.
TE-Puffer (Tris-HCl, EDTA) spielt eine wichtige Rolle im Prozess der DNA-Isolierung, indem es den pH auf 8,0 hält und zweiwertige Metallkationen bindet. Diese Ionen sind für viele Nukleasen essenziell, und deren Bindung verhindert deren Aktivität und schützt die DNA.
SDS ist ein anionisches Detergens, das Proteine denaturiert und die Zellmembran zerstört.
Konzentrierte NaCl-Lösung bewirkt Plasmolyse und unterstützt die Zell-Lyse.
5M CH3COOK wird für die Protein-Fällung verwendet.
Isopropanol oder Ethanol wird verwendet, um die DNA aus der Lösung zu fällen.
Das Zentrifugieren bei 13000 u/min ermöglicht die Sedimentation von Proteinen und Zelltrümmern, sodass die gereinigte DNA im Überstand bleibt und isoliert werden kann.
Eine alternative Methode zur RNA- und Protein-Freisetzung ist die Verwendung von Phenol.
Verfahren und Reagenzien zur Protein-Fällung erlauben die Isolierung von DNA.
Eine Reinigungsschritte mit Ethanol kann das Ausfällen und Reinigen der DNA erleichtern.
Die DNA kann über das Waschen mit Ethanol gereinigt werden, um verbliebenen Salze zu entfernen.
Die DNA wird durch Erhitzen auf 37° C getrocknet, bevor sie in H2O aufgelöst wird.

Alternativ-Methode

Eine alternative Methode zur Zell-DNA Präparation beinhaltet die Verwendung von Phenol.
Phenol fällt Proteine aus der DNA-Lösung.
Proteine sammeln sich in der phenolischen Phase, während DNA und RNA in der wässrigen Phase verbleiben.
Die Zentrifugation ermöglicht die Trennung der beiden Phasen, wodurch die DNA gereinigt werden kann.

Plasmid-DNA Isolierung

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfordert präzise Schritte zur Trennung von Plasmiden vom chromosomalen Material.
Die chromosomale DNA ist im Vergleich zu Plasmiden größer und wird durch Alkalische Denaturierung aufgespalten.
Die alkalische Denaturierung von DNA bei pH 12,0 bis 12,5 trennt die DNA-Stränge.

Restriktionsstellen-Kartierung

In der Restriktionsstellen-Kartierung werden DNA-Fragmente nach Verdau mit Restriktionsenzymen charakterisiert.
Die spezifische Enzymauswahl ist entscheidend, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die eine eindeutige Identifikation des Plasmids ermöglichen.
Agarose Gelelektrophorese wird für die Analyse der Fragmente nach ihrer Größe und Position verwendet.
Die Analyse der Fragmente erlaubt ein Verständnis der Position der Restriktionsstellen auf dem Plasmid.

Sanger Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung ist ein enzymatisches Verfahren zur DNA-Sequenzierung.
Die Methode basiert auf der Verwendung von ddNTPs (Didesoxynukleotide), die die DNA-Replikation an bestimmten Stellen unterbrechen.

Protein Exprimierung in E. coli

Rekombinante Proteine können in E. coli exprimiert werden.
Die Expression wird oft durch die Verwendung eines pET Plasmids initiiert.
Der T7 Promotor ist ein starker Promotor im Vektor.
IPTG wird verwendet, um die Expression zu induzieren.
Die Proteinausbeute kann bis zu 50% des Gesamtproteins erreichen

SDS-PAGE

SDS-PAGE ist eine Methode zur Trennung von Proteinen basierend auf ihrer Molekülmasse.
SDS-PAGE ist wichtig, um Proteine zu untersuchen, zu reinigen und zu quantifizieren.
SDS denaturiert Proteine und verleiht ihnen eine negative Ladung.
Die Auftrennung der Proteine erfolgt im Polyacrylamid Gel.

Western Blot

Der Western Blot ist eine Technik zur immunologischen Detektion von Proteinen in einem komplexen Proteingemisch.
Proteine werden zuerst durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Membran (Nitrocellulose oder Nylon) übertragen.
Die Membran wird mit Antikörpern inkubiert, die gegen das Zielprotein gerichtet sind.
Die Antikörper können spezifisch gebunden werden und mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden (z.B. durch eine chemische Reaktion oder durch ein optisches Signal).

Southern Blot

Southern Blot ist eine Methode zur Hybridisierung von DNA-Fragmenten.
DNA-Fragmente werden nach der Gelelektrophorese auf eine Membran (Nitrocellulose) übertragen und mit einer markierten Sonde hybridisiert.

Northern Blot

Northern Blot ist eine Methode zur Hybridisierung von RNA-Fragmenten.
Unterscheiden sich vom Southern Blot - da RNA verwendet wird.
RNA-Fragmente werden nach der Gelelektrophorese auf eine Membran (Nitrocellulose) übertragen und mit einer markierten Sonde hybridisiert. Die Sonde ist für die komplementäre RNA-Sequenz spezifisch.

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Description

Dieses Quiz testet Ihr Wissen über die Zell-Lyse sowie die damit verbundenen biochemischen Prozesse und Reagenzien. Fragen befassen sich mit Reagenzien, Funktionen von Lösungen und den Mechanismen der Proteinaggregation. Bereiten Sie sich vor, Ihre Kenntnisse in der Biochemie zu überprüfen.