Biochemie Zell-Lyse und Proteinanalytik

SDS, ein anionisches Detergens, wird verwendet, um Proteine zu denaturieren und Zellmembranen zu zerstören.

Eine konzentrierte NaCl-Lösung bewirkt Plasmolyse, wodurch die Zellwand geschwächt wird und die Lyse der Zelle unterstützt wird.

Lysozym ist ein Enzym, das die Zellwand von Bakterien abbaut, wodurch die Zelle leichter durchlässig für andere Reagenzien wird.

TE-Puffer ist eine Lösung aus Tris-HCl und EDTA. Er stabilisiert die DNA und schützt sie vor Abbau.

Die Zugabe von konzentrierter CH3COOK-Lösung führt zur Ausfällung der Proteine, die zuvor durch SDS denaturiert wurden.

Proteinfällung tritt auf, wenn gelöste Proteine sich zu großen Aggregaten zusammenschließen und aus der Lösung ausfallen.

Die Proteinfällung wird durch die Zugabe von stark geladenen Ionen, wie z.B. Kaliumacetat (CH3COOK), erreicht. Diese Ionen entziehen den Proteinen ihre Hydrathülle, wodurch sie sich leichter aggregieren.

Nach der Fällung der Proteine werden die restlichen Bestandteile (DNA, RNA, Zelltrümmer) durch Zentrifugation getrennt.

Ein Puffersystem, das den pH-Wert auf 8,0 hält, um die Stabilität der DNA und die Aktivität von Enzymen zu gewährleisten.

EDTA ist ein Chelator, der zweiwertige Metallionen bindet, die für die Funktion vieler Nukleasen essenziell sind. Dadurch wird die Aktivität von Nukleasen gehemmt und die DNA vor Abbau geschützt.

Ein anionisches Detergens, das die Zellmembran zerstört und die Zellen lysiert.

NaOH denaturiert die DNA, wodurch die Doppelhelixstruktur aufgebrochen wird und die DNA zugänglicher für die folgenden Schritte wird.

Kaliumacetat fällt die Proteine aus, die während der Lyse freigesetzt werden. Diese Proteine werden durch Zentrifugation entfernt und behindern somit nicht die weitere Isolierung der Plasmid-DNA.

Essigsäure neutralisiert die starke Base NaOH und bewirkt die Renaturierung der DNA. Das bedeutet, dass die DNA ihre ursprüngliche Doppelhelixstruktur wiedererlangt.

Die Zelltrümmer, Proteine und chromosomale DNA werden durch Zentrifugation abgetrennt, während die Plasmid-DNA im Überstand verbleibt.

Isopropanol wird verwendet, um die Plasmid-DNA aus der Lösung auszufällen. Die DNA wird dann durch Zentrifugation pelletiert, wodurch sie sich vom Rest der Lösung trennen lässt.

Im Vergleich zum bakteriellen Chromosom ist Plasmid-DNA kleiner, kreisförmig und überspiralisiert. Diese Eigenschaften erleichtern die gezielte Isolation der Plasmid-DNA.

Bei der alkalischen Denaturierung wird die DNA durch die hohe pH-Wert-Lösung (pH 12) in ihre Einzelstränge zerlegt. Die chromosomale DNA wird irreversibel denaturiert, während die Plasmid-DNA aufgrund ihrer Überspiralisierung ihre Struktur behält.

Der Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) dient dazu, die Zellen zu resuspendieren und den pH-Wert zu stabilisieren.

SDS (Sodiumdodecylsulfat) ist ein Detergens, welches die Zellmembran auflöst und Proteine denaturiert.

NaOH (Natriumhydroxid) ist eine starke Base, die den pH-Wert auf 12 erhöht und die DNA denaturiert.

CH3COOK (Kaliumacetat) sorgt für eine schnelle Neutralisierung des pH-Wertes und ermöglicht die Renaturierung der Plasmid-DNA. Gleichzeitig fällt die chromosomale DNA aus der Lösung.

Isopropanol wird verwendet, um die Plasmid-DNA aus der Lösung zu präzipitieren.

70% Ethanol wird verwendet, um die Plasmid-DNA zu waschen und zu reinigen.

Der Aktivator des lac-Operons, der an cAMP bindet und dadurch aktiviert wird. Er fördert die Transkription des Operons.

Ein Zyklisches Nukleotid, das als second messenger dient. Seine Konzentration ist umgekehrt proportional zur Glukosekonzentration in der Zelle.

Das lac-Operon wird aktiviert, wenn die Zelle wenig Glucose und viel Lactose hat.

Ein Repressor-Protein, das an den Operator des lac-Operons bindet und so die Transkription der Gene verhindert.

Eine Isomerform von Lactose, die als Induktor des lac-Operons wirkt und die Bindung des LacI-Repressors an den Operator verhindert.

Ein Gen, das für das Enzym β-Galactosidase kodiert, welches Lactose in Glucose und Galactose spaltet.

Ein Gen, das für den Lactose-Permease kodiert, ein Transportprotein, das Lactose in die Zelle transportiert.

Eine mutierte Version des lac-Promotors, die keine Bindung an CAP benötigt.

Zentrifugieren ist eine Technik, die verwendet wird, um Materialien mit unterschiedlichen Dichten zu trennen. Durch schnelles Drehen um eine zentrale Achse werden dichtere Materialien stärker nach außen gedrückt, während leichtere Materialien in der Nähe der Rotationsachse verbleiben. Im Zusammenhang mit der DNA-Isolierung wird Zentrifugieren eingesetzt, um Zellen, Zelltrümmer und Proteine von der DNA zu entfernen.

Im ersten Schritt der DNA-Isolierung werden die Zellen aus dem Wachstumsmedium abgetrennt. Dies geschieht durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit. Durch die Kraft der Zentrifugation sedimentieren die Zellen am Boden des Röhrchens, während das umgebende Medium abgegossen werden kann.

TE-Puffer ist eine Lösung, die verwendet wird, um die DNA zu stabilisieren und zu schützen. Lysozym ist ein Enzym, das die Zellwand von Bakterien auflöst, um den Zugang zur DNA zu ermöglichen. Der erste Schritt der DNA-Isolierung beinhaltet das Resuspendieren der Zellen in TE-Puffer mit Lysozym.

SDS (Natriumdodecylsulfat) ist ein Detergens, das Zellmembranen auflöst und Proteine denaturiert. NaCl (Natriumchlorid) ist ein Salz, das die DNA stabilisiert. Diese beiden Stoffe werden hinzugefügt, um die DNA aus der Zelle freizusetzen und zu reinigen.

CH3COOK (Kaliumacetat) ist ein Salz, das verwendet wird, um Proteine und andere Verunreinigungen auszufällen. Durch die Zugabe von Kaliumacetat wird die DNA im Überstand angereichert, während die unerwünschten Bestandteile sedimentieren.

Phenol ist ein organisches Lösungsmittel, das Proteine ausfällt und eine Trennung zwischen der wässrigen Phase (mit DNA) und der phenolischen Phase (mit Proteinen) ermöglicht.

Durch das Zentrifugieren nach der Phenolbehandlung bildet sich eine klare Phasentrennung. Die wässrige Phase, die die DNA enthält, befindet sich oben, während die phenolische Phase, die die Proteine enthält, unten sitzt. Diese Trennung ermöglicht eine effiziente DNA-Reinigung.

Die DNA-Isolierung basiert auf dem Prinzip, dass verschiedene Zellkomponenten unterschiedliche Dichten haben. Durch den Einsatz von Zentrifugation, Salzlösungen und Stoffen wie Phenol lassen sich die unerwünschten Bestandteile entfernen und die DNA in reiner Form gewinnen.

Ein Puffer, der in der SDS-PAGE verwendet wird, um den pH-Wert während der Elektrophorese zu stabilisieren. Er besteht aus Tris, Glycin und SDS.

Eine Detergenz, die in der SDS-PAGE verwendet wird, um Proteine zu denaturieren und ihnen eine negative Ladung zu verleihen. Das SDS-Anion bindet in einem annähernd stöchiometrischen Verhältnis an das Protein, wodurch alle Proteine die gleiche Ladungsdichte pro Molekülmasse erhalten.

Ein Reduktionsmittel, das in der SDS-PAGE verwendet wird, um Disulfidbrücken in Proteinen zu brechen. Dies führt zur Denaturierung von Proteinen und ermöglicht eine genauere Auftrennung nach Molekülmasse.

Ein Verfahren, das verwendet wird, um Proteine basierend auf ihrer Größe (Molekülmasse) zu trennen. Die Proteine werden in einem Polyacrylamidgel durch ein elektrisches Feld gezogen, wobei kleinere Proteine schneller wandern als größere Proteine.

Eine Schicht im SDS-PAGE-Gel, in der die Proteine konzentriert werden, bevor sie in das Trenngel wandern. Das Sammelgel hat einen niedrigeren pH-Wert als der Trenngel, wodurch die Proteine zunächst in einer Zone konzentriert werden.

Eine Schicht im SDS-PAGE-Gel, in der die Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Der Trenngel hat einen höheren pH-Wert als das Sammelgel, wodurch die Proteine durch das Gel wandern und nach ihrer Größe aufgetrennt werden.

Ein Effekt, der während der SDS-PAGE auftritt. Die Proteine wandern zunächst in eine Zone des Sammelgels, in der sie konzentriert werden. Diese Konzentration verbessert die anschließende Auftrennung im Trenngel.

Ein Bestandteil des SDS-PAGE-Puffers. Es sorgt für eine hohe Dichte der Probe und erleichtert die Beschichtung des Gels.

Ein Farbstoff, der in der SDS-PAGE verwendet wird, um die Laufmittelfront im Gel zu markieren. Dadurch kann der Fortschritt der Elektrophorese verfolgt werden.

Ein Bestandteil des SDS-PAGE-Puffers. Sein Ziel ist es, die Zellen und Proteine zu lysieren.