VL_4-5_komplkorr PDF - DNA-Präparation

Die Präparation der gesamten Zell-DNA  Zellwand Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Zellwand...

Die Präparation der gesamten Zell-DNA  Zellwand Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Zellwand Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen Entfernen Fällung von Auflösen Zell-Lyse der Proteine DNA der DNA Bakterielle Kultur TE Puffer, pH8.0 Lysozym Pulver 10% SDS 5M NaCl (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM) 5M CH3COOK Isopropanol 70% Ethanol Wasser Tischzentrifuge 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym Lysozym 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym Lysozym zerstört die Zellwand der Bakterien Zellwand Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym Lysozym zerstört die Zellwand der Bakterien Zellwand Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen TE-Puffer: Tris hält pH bei 8,0 und EDTA komplexiert zweiwertige Metallkationen, die für die Funktion vieler Nukleasen essenziell sind 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben SDS – anionisches Detergens; denaturiert Proteine und zerstört die Membran Zellmembran Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen Konzentrierte NaCl Lösung bewirkt Plasmolyse und unterstützt die Zell-Lyse 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben Konzentrierte CH3COOK Lösung wird für die Fällung der Proteine verwendet Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Fällung (Präzipitation) von Proteinen tritt auf, wenn Monomere oder kleine Komplexe von gelöstem Protein sich zu großen Aggregaten zusammenschließen Stark geladene Ionen hydratisieren und entziehen den Proteinen die Hydrathülle. Dies führt zur Aggregatbildung der Proteine durch hydrophobe Wechselwirkung die Proteine interagieren eher mit einander als mit dem Lösungsmittel (Wasser) 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min Beim Zentrifugieren sedimentieren Proteine und Zelltrümmer Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Alternativ-Methode 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Alternativ-Methode 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben  Phenol fällt Proteine  Phenol mit Wasser bildet ein zweiphasiges Gemisch  Proteine sammeln sich in der phenolischen Phase, während DNA und RNA in der wässrigen Lösung bleiben Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen  Alternativ-Methode 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min Durch Zentrifugation erreicht man gute Phasentrennung Chromosomale DNA Proteine Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol zugeben (1:1) In Gegenwart von Isopropanol und hohen Salzkonzentrationen fällt DNA aus Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol zugeben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA Andere Verunreinigungen 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol zugeben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol zugeben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) 11. Ethanol verwerfen 12. DNA trocknen bei 37 ⁰C 13. Auflösen in H2O Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben 4. 700 µL Phenol zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol zugeben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) 11. Ethanol verwerfen 12. DNA trocknen bei 37 ⁰C 13. Auflösen in H2O Chromosomale DNA Plasmid-DNA RNA RNA kann man während der DNA-Isolierung oder auch nachträglich durch Gabe der RNAse loswerden  1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium Zerstören der Zellwand 2. Resuspendieren der Zellen in 500 µL TE-Puffer + Lysozym Zell-Lyse 3. 120 µL 10% SDS Lösung und 50 µL 5M NaCl zugeben 4. 240 µL 5M CH3COOK zugeben / oder Phenol Fällung der Proteine 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand/wässrige Phase ins neue Röhrchen übertragen Fällung der DNA 7. Isopropanol zugeben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen Waschen der DNA 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) 11. Ethanol verwerfen 12. DNA trocknen bei 37 ⁰C Auflösen der DNA 13. Auflösen in H2O Entfernen Fällung von Auflösen Zell-Lyse der Proteine DNA der DNA Isolierung der Plasmid-DNA (aus E. coli) Während der Isolierung der Plasmid-DNA muss zwischen Plasmid und Chromosom unterschieden werden Wie????  Chromosom bei Bakterien kann kreisförmig oder linear sein Chromosomgröße bei Bakterien schwankt von 0,58Mb bei Mycoplasma genitalium bis 13 Mb bei Sorangium cellulosum Beim Zellaufschluss wird das Chromosom in Fragmente (40 kb) zerstückelt Alle Chromosom-Fragmente sind nach dem Zellaufschluss linear, unabhängig davon, ob das Chromosom linear oder kreisförmig war Plasmide sind meistens klein, kreisförmig und überspiralisiert Beim Zellaufschluss bleiben Plasmide intakt (kreisförmig und überspiralisiert) Die Unterschiede in Form der Plasmide und der chromosomalen Fragmente erlaubt gezielte Isolation der Plasmid-DNA Plasmide sind kreisförmig und überspiralisiert  Plasmidreinigung durch alkalische Denaturierung blaue Plasmid-Moleküle sollten als kreisförmig gezeigt werden Plasmidreinigung durch alkalische Denaturierung  Plasmidreinigung durch alkalische Denaturierung  Bei pH 12 denaturiert DNA; Wasserstoffbrücken können nicht mehr ausgebildet werden  Die Stränge der chromosomalen DNA trennen sich voneinander  Die Stränge der Plasmid-DNA bleiben wegen Überspiralisierung nebeneinander  Bei schneller Neutralisierung renaturiert Plasmid-DNA richtig. Wasserstoffbrücken entstehen zwischen den komplementären Strängen  Bei schneller Neutralisierung renaturiert chromosomale DNA nicht richtig. Wasserstoffbrücken entstehen zwischen Strängen, die nur partiell komplementär sind. Es entsteht eine verworrene Masse chromosomaler DNA, die beim Zentrifugieren sedimentiert Bakterielle Kultur Puffer I Puffer II Puffer III (Tris-HCl 25mM, 1% SDS, 0,2M NaOH (3M CH3COOK, EDTA 25mM, pH 8,0) 11,5%CH3COOH) Isopropanol 70% Ethanol Wasser Tischzentrifuge 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0)  Tris Puffer hält den pH bei 8,0  EDTA komplexiert zweiwertige Metallkationen, die für die Funktion vieler Nukleasen essenziell sind  EDTA schädigt die äußere Membran von E. coli  E. coli gehört zu den gramnegativen Bakterien  die gramnegativen Bakterien besitzen eine zusätzliche äußere Membran  im Gegensatz zu den grampositiven Bakterien ist die Zellwand bei den gramnegativen Bakterien dünn und locker 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben  SDS (anionisches Detergens) zerstört die Zellmembran und lysiert die Zellen  NaOH denaturiert DNA 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben  Kaliumacetat fällt die Proteine  Essigsäure neutralisiert NaOH und bewirkt Renaturierung der DNA 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min  Zelltrümmer, Proteine und chromosomale DNA sedimentieren 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol geben (1:1)  Plasmid-DNA fällt aus 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol geben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min  Plasmid-DNA sedimentiert 1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 6. Überstand ins neue Röhrchen übertragen 7. Isopropanol geben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) 11. Ethanol verwerfen 12. DNA trocknen bei 37 ⁰C 13. Auflösen in H2O  1. Abzentrifugieren der Zellen aus dem Medium Vorbereiten der Zellen 2. Resuspendieren der Zellen in 100 µL Puffer I (Tris-HCl 25mM, EDTA 25mM, pH 8,0) Zell-Lyse und 3. 200 µL Puffer II (1% SDS, 0,2M NaOH ) zugeben Denaturierung der DNA 4. 150 µL Puffer III (3M CH3COOK, 11,5%CH3COOH) zugeben Fällung der Proteine 5. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min und chrom. DNA 6. Überstand ins neue Röhrchen übertragen Fällung der Plasmid-DNA 7. Isopropanol geben (1:1) 8. Zentrifugieren 10 Min bei 13000 u/min 9. Überstand verwerfen Waschen der DNA 10. Pellet mit 70% Ethanol waschen (um Salze loszuwerden) 11. Ethanol verwerfen 12. DNA trocknen bei 37 ⁰C Auflösen der DNA 13. Auflösen in H2O Restriktionsstellen-Kartierung (Restriktionskartierung)  ein DNA-Fragment oder ein Plasmid kann durch den Verdau mit Restriktionsenzymen grob charakterisiert werden  Es werden solche Enzyme gewählt, die im jeweiligen DNA-Fragment vermutlich zwei- bis dreimal schneiden. Diese werden dann in Einfach- und Mehrfachspaltungen eingesetzt.  Die entstandenen DNA-Fragmente werden mittels Agarose Gel-Elektrophorese analysiert  Durch die Restriktionskartierung wird eine Restriktionskarte konstruiert, die die Positionen der Schnittstellen einzelner Restriktionsenzyme auf der DNA des Plasmids zeigt Klonieren vom Gen in das pUC19 Plasmid (XbaI/BamHI) Klonieren vom Gen in das pUC19 Plasmid (XbaI/BamHI) Ausgangsplasmid Das konstruierte Plasmid XbaI BamHI XbaI/ BamHI  Sanger Sequenzierung = Kettenabbruchmethode = Didesoxynukleotide DNA Sequenzierung  Sanger Sequenzierung ist ein enzymatisches, von Frederick Sanger und Charles A. Coulson entwickeltes Verfahren Sanger Sequenzierung ist eine PCR-basierte Methode Für die Sequenzierungsreaktion wird nur 1 Primer verwendet, daher wird in einem Ansatz nur ein DNA-Strang sequenziert Für die Reaktion werden gebraucht: Matrize (die zu sequenzierende DNA), ein Primer (bestimmt welcher Strang sequenziert wird), vier Desoxynukleotide (dNTP: dATP + dTTP + dCTP + dGTP), Didesoxynukleotide (ddATP + ddTTP + ddCTP + ddGTP) und die DNA Polymerase Didesoxynukleotide sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert Didesoxynukleotide sind für die Sanger Sequenzierung unentbehrlich 3'-OH Gruppe fehlt in Didesoxynukleotiden Einbau vom Didesoxynukleotid in DNA- Strang bewirkt den Kettenabbruch  Puffer Probe dNTPs Primer Polymerase ddATP ddTTP Wasser ddCTP ddGTP PCR  didesoxy-ATP unbekannte Sequenz PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte PCR-Produkte 7 bp 13 bp 14 bp 15 bp PCR-Produkte 8 bp 12 bp 15 bp PCR-Produkte 11 bp 15 bp PCR-Produkte 9 bp 10 bp 15 bp  Puffer Probe dNTPs Primer Polymerase ddATP ddTTP Wasser ddCTP ddGTP PCR  PCR ddATP ddTTP ddCTP ddGTP Vereinigung der PCR-Produkte denaturierende Gelelektrophorese  PCR-Produkte 7 bp 8 bp 13 bp 12 bp 14 bp 9 bp 11 bp 10 bp 15 bp PCR-Products Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese 7 bp 7 bp 13 bp 14 bp 8 bp 12 bp 11 bp 15 bp 9 bp 10 bp PCR-Products Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese 7 bp 7 bp 13 bp 8 bp 14 bp 8 bp 12 bp 11 bp 15 bp 9 bp 10 bp PCR-Products Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese 7 bp 7 bp 13 bp 8 bp 14 bp 9 bp 8 bp 10 bp 12 bp 11 bp 12 bp 11 bp 13 bp 15 bp 14 bp 9 bp 10 bp 15 bp PCR-Products Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese =A =T 7 bp =G =C 7 bp 13 bp 8 bp 14 bp 9 bp 8 bp 10 bp 12 bp 11 bp 12 bp 11 bp 13 bp 15 bp 14 bp 9 bp 10 bp 15 bp PCR-Products Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese =A =T 5' 7 bp =G =C 7 bp A 13 bp 8 bp T 14 bp 9 bp G 8 bp 10 bp G 12 bp 11 bp C 12 bp T 11 bp 13 bp A 15 bp 14 bp A 9 bp 10 bp 15 bp C 3'  Polyacrylamide Gel findet Anwendung für die Auftrennung der Sequenzierungsprodukte Hat kleinere Poren als das Agarose-Gel Polyacrylamide Gel weist bessere Auftrennung kleiner DNA Fragmente auf Ein Read beträgt üblicherweise 700 - 1000 bp  Das zu sequenzierende DNA-Fragment wird an seinem 3’-Ende mit einer komplementären einzelsträngigen DNA, einem sog. primer, hybridisiert.  Mit Hilfe der DNA-Polymerase wird an den primer ein DNA-Strang synthetisiert, der zu dem zu sequenzierenden DNA-Abschnitt komplementär ist. Hierzu werden die vier benötigten Basen als Desoxyribonucleosidtriphosphate (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) zugesetzt. Ein sequenzspezifischer Kettenabbruch wird dadurch erzwungen, dass der Sequenzierungsansatz in vier gleiche Teile aufgeteilt und in jeden Ansatz eine geringe Menge eines der vier 2’,3’-Didesoxyribonucleosidtriphosphate (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) gegeben wird.  Wird dieses Didesoxynucleotid anstelle des normalen Desoxynucleotids in die wachsende Polynucleotidkette eingebaut, so wird das Kettenwachstum beendet, da keine freie 3’-OH- Gruppe für die Polymerisierung mehr vorhanden ist.  Ist die Menge an Didesoxyribonucleosidtriphosphaten gering, wird es nicht an jeder möglichen Stelle innerhalb der Sequenz sondern statistisch eingebaut und es entsteht ein Gemisch unterschiedlich langer Ketten, welche auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch ihrer Länge nach aufgetrennt werden.  Zur Detektion können Primer verwendet werden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Benutzt man für jedes der vier Nucleotide einen Primer mit jeweils einem anderen Fluoreszenzfarbstoff, können die vier Ansätze in einer einzigen Spur des Sequenziergels aufgetrennt werden.  Das klonierte Gen Sequenzierungsprimer Ein Read beträgt üblicherweise nur 700 - 1000 bp Große Fragmente müssen von mehreren Primern sequenziert werden Protein Exprimierung in E. coli  Rekombinante Proteine werden oft in E. coli produziert Das zu exprimierende Gen wird in einen speziellen Vektor kloniert (z.B. pET28a) Der Vektor enthält sehr starken T7 Promotor, von dem das Gen transkribiert wird und RBS für die Initiation der Translation Das zu exprimierende Gen wird ohne den eigenen Promotor und RBS (nur das offene Leseraster) in den Vektor kloniert und unter Kontrolle des T7 Promotors gesetzt pET-Vektoren bieten eine Möglichkeit das gewünschte Protein mit einem His-Tag (6 Histidin-Reste) entweder C-terminal oder N-terminal zu fusionieren Fusionierung mit His-Tag erlaubt es, das exprimierte Protein mit Hilfe von Affinitätschromatographie aufzureinigen Um das gewünschte Protein exprimieren zu können, muss das konstruierte pET-Plasmid in einen geeigneten E. coli-Stamm (BL21 DE3) transformiert werden, der das Gen für die T7 Polymerase exprimiert In üblichen Klonierungsstämmen, die keine T7 Polymerase haben, ist der T7 Promotor nicht aktiv  Schematischer Aufbau vom pET-Vektor pET-Vektor - T7 Promotor - Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen - lac Operator - His-Tag - RBS N-terminale Markierung Startcodon Stopcodon 6 x His Protein Sequenz C-terminale Markierung Startcodon Stopcodon Protein Sequenz 6 x His  Rekombinante Proteine, die in E. coli produziert werden, können toxisch für E. coli sein Um die Toxizität für E. coli in Grenzen zu halten, wird die Gen-Expression nur dann induziert, wenn E. coli bestimmte optische Dichte erreicht hat (OD600 = 0,6) Bis zur Induktion bleibt das zu exprimierende Gen inaktiv und weist kaum Toxizität für E. coli auf Regulation vom lac-Operon Diauxie – ein zweiphasiges Wachstum von Mikroorganismen in Gegenwart von zwei verschiedenen Energiequellen Ein Operon ist eine Funktionseinheit der DNA von Prokaryoten und manchen Eukaryoten, bestehend aus Promotor, Operator und mehreren Genen, die für Proteine mit typischerweise verwandten Funktionen codieren. DNA RBS Gen1 RBS Gen2 RBS Gen3 Polycistronische mRNA RBS Gen1 RBS Gen2 RBS Gen3 Protein 1 Protein 2 Protein 3  Regulation vom lac-Operon  Lac-Operon reguliert bei Bakterien die Expression von drei Genen, deren Genprodukte die Nutzung von Lactose als Kohlenstoffquelle ermöglichen. Die Genexpression führt zur Bildung der β-Galactosidase (lacZ), der Permease (lacY) und einer Transacetylase (lacA). Der Promotor, der an der Expression dieser drei Proteine beteiligt ist, wird von zwei Regulatoren kontrolliert, dem Aktivatorprotein CAP (catabolic activator protein) und dem Repressor LacI. lacI  Aktivator CAP  Dieses Protein bindet an eine Region, die dem Promotor vorgeschaltet ist.  Die Anlagerung löst eine effizientere Rekrutierung der Polymerase aus, es kommt zur Aktivierung der Transkription.  Der Aktivator wird über die Menge an cyclischem AMP (cAMP) kontrolliert, das durch seine Anlagerung an CAP eine Strukturänderung bewirkt, woraufhin CAP aktiviert wird.  Die Konzentration von cAMP in der Zelle ist umgekehrt proportional zur Glucosekonzentration.  Unter Glucosemangel kommt es demnach zur Aktivierung des Operons.  Dieser Mechanismus nutzt bevorzugt Glucose, da andere Kohlenstoffquellen weniger ergiebig sind.  LacI-Repressor  Dieses Protein reagiert sehr sensitiv auf die im Bakterium vorhandene Lactosemenge.  Allolactose interagiert direkt mit dem LacI-Protein und bewirkt die Stabilisierung seiner inaktiven Konformation.  Unter Lactosemangel nimmt LacI eine tetramere Konformation ein und bindet an die DNA, wo es die Transkription des Operons verhindert.  Dieser Mechanismus vermeidet eine unnütze Bildung der Enzyme bei Lactosemangel. lacZ lacY lacA Lactose LacY LacZ Nebenreaktion von LacZ LacZ Hauptreaktion von LacZ Anwesenheit von Lactose und Glucose Anwesenheit von Glucose und Abwesenheit von Lactose Anwesenheit von Lactose, Abwesenheit von Glucose   T7 Pol – Gen für T7 Polymerase  aus dem Phagen T7 lacUV5  besonders „aktive“ Polymerase T7 Pol  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von T7 Polymerase erreicht 260 Nukleotide pro Sekunde  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von E. coli RNA- Polymerase erreicht etwa 40 Nukleotide pro Sekunde  T7 Polymerase ist sehr promotorspezifisch; erkennt nur ihren eigenen Promotor  lacUV5 – mutierte Version vom lac-Promotor  enthält zwei geänderte Basenpaare  braucht kein Cap-Protein für Aktivität  lac-Operator ( ) ist unbeschädigt lacI  wird vom LacI-Repressor gehemmt  lacI – Gen für LacI-Repressor   T7 Pol – Gen für T7 Polymerase  aus dem Phagen T7 lacUV5  besonders „aktive“ Polymerase T7 Pol  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von T7 Polymerase erreicht 260 Nukleotide pro Sekunde  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von E. coli RNA- Polymerase erreicht etwa 40 Nukleotide pro Sekunde  T7 Polymerase ist sehr promotorspezifisch; erkennt nur ihren eigenen Promotor  lacUV5 – mutierte Version vom lac-Promotor  enthält zwei geänderte Basenpaare  braucht kein Cap-Protein für Aktivität  lac-Operator ( ) ist unbeschädigt lacI  wird vom LacI-Repressor gehemmt  lacI – Gen für LacI-Repressor  Keine Lactose im Medium  T7 Pol – Gen für T7 Polymerase  aus dem Phagen T7 lacUV5  besonders „aktive“ Polymerase T7 Pol  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von T7 Polymerase erreicht 260 Nukleotide pro Sekunde  Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von E. coli RNA- Polymerase erreicht etwa 40 Nukleotide pro Sekunde  T7 Polymerase ist sehr promotorspezifisch; erkennt nur ihren eigenen Promotor  lacUV5 – mutierte Version vom lac-Promotor  enthält zwei geänderte Basenpaare  braucht kein Cap-Protein für Aktivität  lac-Operator ( ) ist unbeschädigt lacI  wird vom LacI-Repressor gehemmt  lacI – Gen für LacI-Repressor  Keine Lactose im Medium lacUV5 T7 Pol T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  Keine Lactose im Medium lacUV5 T7 Pol T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  Keine Lactose im Medium  Das Ziel-Gen ist inaktiv lacUV5  Das potenziell toxische Protein T7 Pol wird nicht produziert T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  Keine Lactose im Medium  Das Ziel-Gen ist inaktiv lacUV5  Das potenziell toxische Protein T7 Pol wird nicht produziert T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI   Die Zellen werden bis zu einem relativ hohen OD Wert vermehrt (OD600 = 0,6)  Dann wird die Protein-Expression induziert durch IPTG-Gabe  Nach einer kurzen Zeit werden die Zellen geerntet und das Protein extrahiert Keine Lactose im Medium  Das Ziel-Gen ist inaktiv lacUV5  Das potenziell toxische Protein T7 Pol wird nicht produziert T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI   Die Zellen werden bis zu einem relativ hohen OD Wert vermehrt (OD600 = 0,6)  Dann wird die Protein-Expression induziert durch IPTG -Gabe  Nach einer kurzen Zeit werden die Zellen geerntet und das Protein extrahiert Was ist IPTG???  Das Ziel-Gen ist inaktiv lacUV5  Das potenziell toxische Protein T7 Pol wird nicht produziert T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI lacZ lacY lacA Lactose LacY LacZ Nebenreaktion von LacZ LacZ Hauptreaktion von LacZ  IPTG – Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid  künstlicher Induktor des Lactose-Operons in Escherichia coli  IPTG bindet an den LacI-Repressor IPTG  Im Gegensatz zur Allolactose wird IPTG nicht verstoffwechselt  Nach der Gabe bleibt die Konzentration von IPTG während eines Versuchs konstant  Die IPTG-Aufnahme von E. coli ist LacY-unabhängig Allolactose  IPTG lacUV5 T7 Pol T7 Prom RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol T7 Prom IPTG RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol T7 Prom IPTG RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol T7 Prom IPTG RBS His Gen lac-Operator pET-Vektor mit dem klonierten Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol T7 Prom IPTG RBS His Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol mRNA T7 Prom IPTG T7 Pol RBS His Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol mRNA T7 Prom IPTG T7 Pol T7 Pol RBS His Gen lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol mRNA T7 Prom IPTG T7 Pol T7 Pol RBS His Gen mRNA lacI  IPTG lacUV5 T7 Pol mRNA T7 Prom IPTG T7 Pol T7 Pol RBS His Gen mRNA lacI Prot Prot Prot  Die Proteinausbeute kann Werte bis zu 50% vom Gesamtprotein erreichen Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot Prot  SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese  SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Methode zur Trennung von Proteinen Das ionische Detergens Natriumlaurylsulfat (Sodium dodecyl sulfate SDS) denaturiert Proteine, wobei das Dodecylsulfat-Anion in einem annähernd stöchiometrischen Verhältnis ans Protein bindet (1,4 g SDS pro g Protein) Bei konstantem Ladungs-Massenverhältnis bestimmt die Molekülgröße die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel die Laufdistanz verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Molekülmasse Durch Vergleich mit einem Standardgemisch von Proteinen bekannter Molekülmasse kann die Molekülmasse eines Proteins ermittelt werden  Utensilien Bestandteile vom Gel: Wasser 10% SDS 30% Acrylamide Probenpuffer 0,5M TrisHCl (pH6.8) (Ladepuffer, Laemmli Puffer) 1,5M TrisHCl (pH8.8) Bestandteile: Tris, SDS, β- 10% Ammoniumperoxodisulfat Mercaptoethanol Probe Glycerol, Bromphenolblau, Tetramethylethylendiamin Wasser  Ansetzen vom PA-Gel  Polyacrylamid Gel besteht normalerweise aus zwei Schichten: Sammelgel (Stacking Gel) und Trenngel (Separation- oder Running Gel)  Das Sammelgel dient dazu, die Proteinbanden schmaler und schärfer zu machen (Stapelungseffekt)  Das Trenngel dient zur Trennung von Proteinen anhand ihrer Molekülgröße Ansetzen vom PA-Gel Das Gel muss in den Spalt Zusammensetzung vom 12% Trenngel Zusammensetzung vom Sammelgel Wasser – 1,67 mL Wasser – 1,47 mL 10% SDS – 50 µL 10% SDS – 30 µL 30% Acrylamide – 2 mL 30% Acrylamide – 0,35 mL 1,5M TrisHCl (pH8,8) – 1,25 mL 0,5M TrisHCl (pH6,8) – 0,63 mL 10% Ammoniumperoxodisulfat – 30 µL 10% Ammoniumperoxodisulfat – 12,5 µL Tetramethylethylendiamin – 6,5 µL Tetramethylethylendiamin – 10 µL  Vorbereiten von Proben Probenpuffer 2X Probe: (Ladepuffer, Laemmli Puffer) Zellen, Bestandteile: Tris, SDS, β- Lysat, Mercaptoethanol Proteinlösung, Glycerol, Bromphenolblau, usw. Wasser Heizblock (10 Min bei 95⁰C) Probenpuffer 2X (Ladepuffer, Laemmli Puffer) Bestandteile:  Tris – Puffer-Reagenz  SDS – Detergenz, lysiert die Zellen, denaturiert die Proteine  β-Mercaptoethanol - reduziert in Proteinen die Disulfidbrücken zu freien Thiolen  Glycerol – sorgt für hohe Dichte  Bromphenolblau – zur Markierung der Laufmittelfront  Wasser – Lösemittel β-Mercaptoethanol - reduziert in Proteinen die Disulfidbrücken β-Mercaptoethanol  Das ionische Detergens Natriumlaurylsulfat (SDS) denaturiert Proteine, wobei das Dodecylsulfat-Anion in einem annähernd stöchiometrischen Verhältnis ans Protein bindet Stapelungseffekt bei SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird oft in einem Tris-Glycin Puffer durchgeführt Tris-Glycin Puffer: Tris – 3 g Glycin – 14,4 g 10% SDS – 10 mL Wasser – auf 1 Liter auffüllen (pH 8,3) Zusammensetzung vom 12% Trenngel Zusammensetzung vom Sammelgel Wasser – 1,67 mL Wasser – 1,47 mL 10% SDS – 50 µL 10% SDS – 30 µL 30% Acrylamide – 2 mL 30% Acrylamide – 0,35 mL 1,5M TrisHCl (pH8,8) – 1,25 mL 0,5M TrisHCl (pH6,8) – 0,63 mL 10% Ammoniumperoxodisulfat – 30 µL 10% Ammoniumperoxodisulfat – 12,5 µL Tetramethylethylendiamin – 6,5 µL Tetramethylethylendiamin – 10 µL  – – – – – Kathode + + + + + + + + + + + + + + + Glycin G G G G G G G G G G G G G G G – – – – – – – – – – – – – – – Sammelgel (pH 6,8) P P P P P – P – P – P – P – P – – – – – P P P P P – – – – – Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl – – – – – – – – – – – – Trenngel (pH 8,8) 2 + + + + + + Anode  – – – – – Kathode Glycin Sammelgel (pH 6,8) P P P P P P P P P P P P P P P – – – – – – – – – – – – – – – G G G G G G G G G G G G G G G – – – – – – – – – – – – – – – Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl – – – – – – – – – – – – Trenngel (pH 8,8) 2 + + + + + + Anode  – – – – – Kathode Glycin Sammelgel (pH 6,8) P P P P P P P P P P P P P P P – – – – – – – – – – – – – – – P P P P P P P P P P P P P P P – – – – – – – – – – – – – – – Trenngel (pH 8,8) 2 G G G G G G G G G G G G G G G – – – – – – – – – – – – – – – Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl – – – – – – – – – – – – + + + + + + Anode  Die Proteine wandern zuerst in ein Sammelgel mit neutralem pH, in dem sie konzentriert werden und anschließend in ein Trenngel mit basischem pH, in dem die eigentliche Auftrennung erfolgt.  Sammel- und Trenngel unterscheiden sich durch unterschiedliche Porengröße, Ionenstärke und pH-Werte (pH6,8 bzw. pH8,8).  Als Elektrolyt wird häufig ein SDS-haltiges TRIS-Glycin-Chlorid-Puffersystem eingesetzt.  Glycin bildet bei neutralem pH-Wert überwiegend die zwitterionische Form aus, bei hohen pH-Werten verlieren die Glycinkationen positive Ladungen und werden vorwiegend anionisch.  Im Sammelgel wandern die kleineren, negativ geladenen Chloridionen vor den Proteinen (engl. leading ions ‚führende Ionen‘) und die etwas größeren, negativ und teilweise positiv geladenen Glycinat-Ionen nach (engl. trailing ions ‚folgende Ionen‘), während im vergleichsweise basischen Trenngel beide Ionen vor den Proteinen wandern.  Der pH-Gradient zwischen Sammel- und Trenngelpuffer führt zu einem Stapelungseffekt an der Grenze des Sammelgels zum Trenngel, da das Glycinat beim ansteigenden pH- Wert teilweise seine bremsende positive Ladung verliert und dann als zuvor folgendes Ion die Proteine beim Wandern überholt und zum führenden Ion wird, wodurch die nach einer Färbung sichtbaren Banden der verschiedenen Proteine schmaler und schärfer werden (Stapelungseffekt). Färben vom Gel Coomassie Färbelösung:  0,4g Coomassie-Brillantblau R250  200 mL 40% (v/v) Methanol in Wasser  Rühren bis komplett aufgelöst ist  200 mL 20% (v/v) Essigsäure in Wasser  Endkonzentrationen: 0,1% (w/v) Coomassie- Brillantblau R250, 20% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure Entfärbelösung:  500 mL Methanol  300 mL Wasser  100 mL Essigsäure  Mit Wasser auf 1000mL auffüllen  Coomassie Färbung eignet sich für die Detektion der Banden mit 0,2 μg Protein und mehr  Für die kleineren Proteinkonzentrationen muss Silberfärbung verwendet werden Western Blot  Der Western-Blot ist eine Technik zum immunologischen Nachweis von Proteinen  Die Proteine müssen zuerst in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt werden  Im zweiten Schritt werden die Proteine aus dem Gel heraus auf die Oberfläche einer Membran (aus Nitrocellulose oder Nylon) übertragen  Diesen Vorgang nennt man Blotten (blot = Abklatsch)  Die Übertragung der Proteine erfolgt durch ein senkrecht zur Geloberfläche angelegtes elektrisches Feld  Die Blots können anschließend mit Antikörpern getränkt werden, die an ihre spezifischen Antigene (Proteine) binden  Diese Reaktion wird über einen zweiten Antikörper enzymimmunologisch (s. o.) sichtbar gemacht, wodurch die Stelle der Antigen-Antikörper-Antikörper-Reaktion angefärbt oder fluoreszenzmarkiert wird  Western-Blots sind wegen der Verwendung von Antikörpern hochspezifisch, sehr empfindlich und relativ einfach herzustellen, daher ist Western-Blotting im Routinebetrieb eine häufig genutzte Methode zur Identifizierung von bekannten Proteinen HRP – Meerrettichperoxidase Luminol Leuchtkäfer und Luciferase Membran nach dem Blotten Proteinbanden sind unsichtbar Membran nach dem Blotten Proteinbanden sind unsichtbar Membran nach der Behandlung mit Antikörpern Belichtung des Films Röntgenfilm nach der Entwicklung  Southern Blot = DNA-DNA Hybridisierung  Southern Blot  eine 1975 von Edwin M. Southern entwickelte molekularbiologische Untersuchungsmethode für DNA.  Sie ermöglicht den Nachweis einer Gensequenz in einem komplexen DNA-Gemisch  Ziel des Southern Blots ist es, DNA-Fragmente, die zuvor mittels Gelelektrophorese entsprechend ihrer Länge getrennt wurden, auf einer Membran zu fixieren, um später durch Hybridisierung mit markierten Sonden einzelne DNA-Fragmente spezifisch nachweisen zu können.  Experimentelles Vorgehen bei der Herstellung und Entwicklung eines Southern-Blot Die zu untersuchende DNA wird mit Restriktionsendonukleasen verdaut Die nach erfolgter Elektrophorese im Agarosegel befindliche DNA wird mit Natronlauge denaturiert.  Experimentelles Vorgehen bei der Herstellung und Entwicklung eines Southern-Blot Anschließend wird das Gel mit einer Nitrozellulosemembran bedeckt. Darüber werden mehrere Filterpapiere geschichtet, die die Pufferflüssigkeit über Kapillarkräfte von unten nach oben ansaugen. Mit dem Puffer wird auch die DNA aus dem Agarosegel zur Nitrozellulosemembran befördert und hier fest gebunden. Auf diese Weise entsteht ein exakter Abklatsch (blot) des Agarosegels auf der Nitrozellulose. Die einzelsträngige DNA ist auf der Nitrozellulose fest fixiert und lässt sich auch durch Waschen mit verschiedenen Puffern nicht mehr ablösen.  Anschließend wird das Gel mit einer Nitrozellulosemembran bedeckt. Darüber werden mehrere Filterpapiere geschichtet, die die Pufferflüssigkeit über Kapillarkräfte von unten nach oben ansaugen. Mit dem Puffer wird auch die DNA aus dem Agarosegel zur Nitrozellulosemembran befördert und hier fest gebunden. Auf diese Weise entsteht ein exakter Abklatsch (blot) des Agarosegels auf der Nitrozellulose. Die einzelsträngige DNA ist auf der Nitrozellulose fest fixiert und lässt sich auch durch Waschen mit verschiedenen Puffern nicht mehr ablösen.  Zum Auffinden einer spezifischen Sequenz der zu untersuchenden DNA wird die Nitrozellulose in einer Lösung inkubiert, die als Sonde eine markierte einzelsträngige DNA (oder RNA) mit der komplementären Sequenz zur gesuchten DNA enthält. Wenn die für die Hybridisierung notwendige Renaturierungstemperatur mehrere Stunden eingehalten wird, kann die markierte Sonde an die gesuchten Sequenzen auf der Nitrozellulose binden und lässt sich dann anhand ihrer spezifischen Markierung leicht nachweisen.  Zum Auffinden einer spezifischen Sequenz der zu untersuchenden DNA wird die Nitrozellulose in einer Lösung inkubiert, die als Sonde eine markierte einzelsträngige DNA (oder RNA) mit der komplementären Sequenz zur gesuchten DNA enthält. Wenn die für die Hybridisierung notwendige Renaturierungstemperatur mehrere Stunden eingehalten wird, kann die markierte Sonde an die gesuchten Sequenzen auf der Nitrozellulose binden und lässt sich dann anhand ihrer spezifischen Markierung leicht nachweisen. Northern blot  eine in 1977 von James Alwine, James Kemp und George R. Stark entwickelte molekularbiologische Untersuchungsmethode für RNA  Sie ermöglicht den Nachweis eines Transkriptes in einem komplexen RNA-Gemisch  Ziel des Northern Blots ist es, RNA-Transkripte, die zuvor mittels Gelelektrophorese entsprechend ihrer Länge getrennt wurden, auf einer Membran zu fixieren, um später durch Hybridisierung mit markierten Sonden einzelne RNA-Transkripte spezifisch nachweisen zu können  Die Bezeichnung Northern Blot wurde als eine Allusion an Southern Blot eingeführt