Tossicologia PDF

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Tel. 055 2758305 E-mail: [email protected] Secondo piano, ala nord, stanza 35  Chiave di accesso tox25 Prove in itinere SFA/CTF 8/11/24, ore 14 Prove in itinere CTF 20/12/24, ore 14 aula di informatica cubo 30 settembre 2024 13:30 - 13:40: Introduzione e benvenuto 13:40 - 14:20: Presentazione di ClinOpsHub (fornisce servizi di supporto ad aziende farmaceutiche, ospedali e altre CRO, oltre a formazione specializzata nel campo della ricerca clinica) 14:20 - 15:00: Presentazione di PQE Group (società di consulenza certificata ISO9001 che offre soluzioni tecnologiche e un ampio portafoglio di servizi GxP a livello globale dedicati all'industria del Life Science  Τοξοσ, arco (molte popolazioni di cacciatori utilizzavano veleno sulla punta delle frecce) Papiro di Ebers (Egitto,1552 a.C.), prima descrizione sistematica di veleni come cicuta, aconito, oppio, piombo, rame e antimonio Teofrasto (studente di Aristotele, V secolo) elenco sistematico delle piante velenose; Dioscoride (I secolo) classificazione dei veleni animali, vegetali e minerali Paracelso (1493-1541) Dosis sola facit venenum. Si occupa di studiare gli effetti avversi delle sostanze sui sistemi viventi. Può essere: sperimentale (studio degli effetti tossici su animali o cellule, sui loro costituenti e dei meccanismi di azione dei tossici) epidemiologica (previsione e studio di effetti tossici su popolazioni umane) occupazionale (patologie indotte da esposizione a tossici nei posti di lavoro) forense (determinazione delle cause di morte) legislativa (valutazione del rischio tossicologico) Con il termine di farmaco si intende ogni molecola dotata di attività biologica, ossia in grado di sviluppare un’ azione su un organismo vivente. Ogni molecola biologicamente attiva può, in determinate patologie e a dosi appropriate, avere effetti terapeutici, mentre, in altri contesti, su altri soggetti o a dosi più elevate, la stessa molecola può diventare un agente tossico.  Quantità di sostanza assunta in un’unica volta L’esposizione ad una sostanza è caratterizzata da: Numero delle dosi Tempo totale di esposizione  Il grammo (g) è l’unità di misura standard, ma per la maggior parte delle esposizioni a sostanze tossiche si usa il milligrammo (mg). L’esposizione si quantifica in relazione al mezzo in cui si distribuisce il tossico: – mg/Kg di peso corporeo – mg/L di acqua – mg/Kg di terreno – mg/m3 di aria Altre unità di misura usate comunemente in tossicologia sono ppm e ppb 1 milligrammo/L= 1 ppm 1 microgrammo (µg)/L= 1 ppb  Dose per un adulto di Grado di tossicità Dose taglia media Non tossico >15 g/kg Circa 1 kg Leggermente tossico 5-15 g/kg 350 g-1 kg Moderatamente 0.5-5 g/kg 35-350 g tossico Molto tossico 50-500 mg/kg 3,5-35 g Estremamente tossico 5-50 mg/kg 350 mg-3,5 g Supertossico 6 kPa and non-surfactant solids Cat. 1: high FNs in general Not applicable to test chemicals that are not soluble or do not form stable suspension Statens Seruminstitut Rabbit Cornea (SIRC)  Common modes of chemical action in ocular toxicity EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT) Test system: non-keratinized multi-layered epithelium reconstructed from primary human epidermal keratinocytes Endpoints measured: cytotoxicity (MTT assay) Protocol: liquids exposed for 30 min followed by 2 h post- exposure incubation; solids exposed for 6 h followed by 18 h post-exposure incubation Status: validated and recommended for identifying UN GHS No Cat., but not Cat. 2 nor Cat. 1 Applicability and limitations: Applicable to all types of chemicals Intensely coloured chemicals addressed with HPLC/UPLC-spectrophotometry Test No. 439: In Vitro Skin Irritation This Test Guideline describes an in vitro procedure that may be used for the hazard identification of irritant chemicals (substances and mixtures) in accordance with the UN Globally Harmonized System of Classification and Labelling (GHS) Category 2. A) saline solution; B) HCl; C) compound 2; D) compound 1; E) compound 3; F) Vaseline oil Methods overview  Tossicità SUBACUTA Effetti collaterali insorgenti dopo l’assunzione di almeno 3 dosi della sostanza (contatti occasionali) ANIMALI ADOPERATI: ratti, topi, conigli, cani, scimmie DURATA DEI TEST : Tra 30 e 90 giorni, comunque non superiore al 10% della durata media della vita dell’animale. Es: 3 mesi per i roditori, 1 anno per cani e scimmie SCELTA DELLE DOSI: l’ideale sarebbe usare 3 dosi 1. una bassa a cui corrisponde tossicità pari a zero 2. una intermedia a cui corrisponde una tossicità lieve 3. una elevata a cui segue un 10 % di mortalità. Si evitano dosi a cui corrisponde una mortalità superiore. Le dosi vanno opportunamente distanziate in modo da avere una gradualità negli effetti tossici  Tossicità SUBACUTA VIE DI SOMMINISTRAZIONE: - Orale - Inalatoria - Dermica DETERMINAZIONI: - peso corporeo - consumo di cibo - comportamento e stato di salute dell’animale - parametri ematologici, biochimici ed urinari (emoglobina, emocromo tempo di protrombina, esame delle urine (pH, sedimento) - peso degli organi e valutazioni istopatologiche  Tossicità CRONICA Effetti collaterali insorgenti dopo somministrazioni ripetute della sostanza in esame DURATA: Gli studi di tossicità cronica hanno una durata dipendente dalle condizioni di applicazione/esposizione clinica del farmaco/sostanza tossica, in genere da 3 a 12 mesi SCELTA DELLE DOSI: 1. La dose maggiore è quella che dà segni di tossicità 2. La dose minore è da 2 a 10 volte superiore a quella giornaliera prevista per l’uso terapeutico, e ben tollerata 3. La dose intermedia corrisponde alla minima dose in grado di indurre il primo chiaro effetto tossico MDT (massima dose tollerabile): è la dose che in uno studio subcronico diminuisce di poco (10%) la velocità di crescita corporea, senza indurre mortalità, segni clinici di tossicità o lesioni patologiche (altri indicatori di tossicità: enzimi epatici, alterazioni del metabolismo) Lowest Observed Adverse Effect Level La LOAEL è la dose più bassa alla quale si osservano effetti tossici No Observed Adverse Effect Level La NOAEL è la dose più alta di una sostanza alla quale non si osserva alcun effetto tossico  Tossicità DELLA FUNZIONE RIPRODUTTIVA Si utilizzano due specie animali: ratti e conigli e si osservano eventuali modifiche della fertilità o procreazione anomala dovuta a danni sui gameti - Interferenze con le fasi di impianto del feto e del suo sviluppo - Effetti tossici sull’embrione - Effetti tossici sul feto Si valutano: modifiche della fisiologia materna con conseguenti effetti tossici secondari sull’embrione o sul feto effetti sulla crescita o sullo sviluppo dell’utero e della placenta interferenze con il parto effetti sullo sviluppo postnatale, sull’allattamento e sulla capacità di assumere il latte da parte dei neonati effetti tardivi sulla discendenza  TEST DI MUTAGENESI I test di mutagenesi per composti nuovi, prima dell’immissione sul mercato devono comprendere: Un test di mutazione genica sui batteri Un test di mutazione genica in un sistema eucariotico in presenza o meno di induttori del metabolismo Un test di aberrazioni cromosomiche in colture di cellule di mammifero Un test in vivo di danno genetico  TEST DI CANCEROGENESI Si registra l’incidenza di tumori e il periodo di latenza prima della loro manifestazione DURATA DEGLI STUDI Dai 18 ai 24 mesi in base alla specie animale ANIMALI UTILIZZATI Due specie animali : ratti e conigli. Almeno 100 animali divisi in due gruppi MODALITA’ CON CUI VENGONO CONDOTTI GLI STUDI Somministrazioni giornaliere del farmaco Via di somministrazione: la stessa utilizzata per l’uomo Documentazione dell’assorbimento del farmaco  LIMITI DEGLI STUDI PRECLINICI La valutazione della tossicità di un composto è lunga (2-5 anni) e costosa Si deve usare un gran numero di animali (problema etico) L’estrapolazione dei dati di tossicità dagli animali all’uomo è complessa Un effetto avverso che si presenta con bassa frequenza è difficilmente rilevabile.  Variabilità di alcuni parametri biologici tra specie diverse 4,5 4 3,5 3 uomo 2,5 ratto 2 topo 1,5 cane 1 scimmia 0,5 0 peso relativo flusso epatico flusso renale fegato Unità arbitrarie: Uomo =1  Differenza di contenuto di lipidi corporei tra due specie di mammiferi Lipidi 7% Lipidi 15-30 % ratto uomo  Esempi di effetti tossici sugli animali che hanno permesso la comprensione degli effetti tossici sull’uomo glicole etilenico: tossicità renale (1930 ca); la sostanza è tossica anche per ratti e cani MPTP: morbo di Parkinson giovanile (1960 ca); la sostanza è tossica anche per scimmie e ratti acido retinoico: alterazioni dello sviluppo del tubo neurale; la sostanza è tossica anche per ratto, cane, scimmia ciclosporina: nefropatia; la sostanza è tossica anche per ratto e cane ciclofosfammide: cistite emorragica; la sostanza è tossica anche per ratto e cane  Leggi che controllano la sicurezza dei composti chimici TOSCA (Toxic Substance IV Emendamento (1981) EU e Control Act, 1977, USA successive modificazioni Si applica a tutte le sostanze Specifica sanzioni Si applica alle nuove sostanze Controllato dalla EPA Non sono specificate sanzioni (Environmental Protection Controllato dagli Stati Membri Agency Registrazione prima di 45 d Le nuove sostanze devono essere registrate 90 d prima della specifica il tipo di controllo sulla commercializzazione base del volume di produzione non specifica il tipo di controlli di si precisano norme generali per tossicità l’etichettatura L’ etichettatura è proposta dalla EPA caso per caso  Le sostanze chimiche in Europa Il 18 settembre 1981 è stato istituito l’inventario europeo delle sostanze chimiche presenti in quel momento sul mercato: EINECS: European Inventory of Existing Commercial Chemical Substances Le sostanze immesse successivamente a quella data e notificate secondo quanto stabiliva la Direttiva 67/548/CEE sono state invece inserite nell’inventario ELINCS: European List of Notified Chemical Substances  Le sostanze chimiche in Europa Lo spartiacque è rappresentato quindi dal 18 Settembre 1981: 100106 sostanze immesse sul mercato prima di tale data (“sostanze esistenti” in EINECS) circa 3000 sostanze immesse dopo il 18 settembre 1981 (“nuove sostanze” in ELINCS) Le informazioni circa i pericoli per l’uomo e/o per l’ambiente sono assolutamente insufficienti  Le sostanze chimiche in Europa livello 0: produzione 1-10 T/anno specificazione di tossicità: tossicità acuta, orale e dermica, subcronica, mutagenicità specificazione di ecotossicità: tossicità per i pesci, dafnia, BOD, COD, biodegradabilità, degradazione chimica livello 1: produzione 10-100 T/anno specificazione di tossicità: studi di teratogenesi, fertilità, mutagenesi e cancerogenesi specificazione di ecotossicità: tossicità cronica per i pesci e gli uccelli, inibizione algale, tossicità per i lombrichi, accumulo, degradazione, assorbimento e desorbimento livello 2: produzione > 100 T/anno specificazione di tossicità: tossicità cronica in non roditori e tossicocinetica, cancerogenesi e teratologia (su non roditori) specificazione di ecotossicità: tossicità cronica per i pesci e gli uccelli, inibizione algale, tossicità per i lombrichi, accumulo, degradazione, assorbimento e desorbimento Chemical Oxygen Demand: quantità di ossigeno necessaria per oxi composti organici ed inorganici presenti Biochemical Oxygen Demand: misura indiretta del contenuto di materia organica biodegradabile presente (mg di O2/L consumati in 5 giorni)  Le sostanze chimiche in Europa Le prove di tossicità previste dalla EU sono in genere molto severe e includono parametri per la valutazione della ecotossicità. Ad esempio includono studi sui lombrichi che hanno una sensibilità alle sostanze tossiche diversa dai mammiferi. Le leggi europee si applicano solo alle nuove sostanze chimiche ed a quelle in commercio che presentino dei profili di tossicità ancora incerti.  Le sostanze chimiche in Europa Dopo un percorso iniziato nel 1999 con una proposta di una strategia comunitaria per la gestione e il controllo del rischio delle sostanze chimiche e con la pubblicazione del Libro bianco del 2001, viene pubblicato: REGOLAMENTO (CE) n. 1907/2006 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 18 dicembre 2006 concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce una Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE  REACH Le nuove norme europee prevedono per ogni nuova sostanza chimica una certificazione della tossicità da parte delle industrie proponenti (REACH, Registration, Evaluation and Approval of CHemicals) E’ una sorta di autocertificazione delle aziende che si impegnano a controllare la tossicità dei loro prodotti.  Struttura del sistema REACH 1.Registrazione di tutte le sostanze che superano la soglia di 1 ton/anno sulla base delle informazioni prodotte dall’industria 2.Valutazione delle sostanze: l’Agenzia verifica i dati per decidere se richiedere ulteriori test o per evitare test non necessari. Verrà valutato il rispetto delle procedure di registrazione. 3.Autorizzazione di sostanze ad alto rischio, CMR di categoria 1 e 2 e POPs che verrà rilasciata a condizione di un adeguato contenimento del rischio. 4.Restrizioni: verrà mantenuto e sviluppato il sistema delle restrizioni attualmente vigente (Direttiva 76/769) 5.Creazione dell’Agenzia chimica Europea incaricata di gestire il flusso di dati. CMR: Sostanze o preparati classificati come POPs: “Persistant Organic Pollutants”- cancerogeni, mutageni o tossici per la sostanze organiche difficilmente riproduzione di cat. 1 o 2 (1A-1B). degradabili  Le sostanze chimiche in Europa REACH Azzeramento tra sostanze esistenti e nuove Registration Evaluation Ribaltamento dell’onere della prova Authorization of CHemicals Flusso in ogni senso delle informazioni Accesso al pubblico delle informazioni Armonizzazione delle norme  Le sostanze chimiche in Europa REACH Costi riversati sulle imprese 1. dovuti alla raccolta dati o a nuove sperimentazioni 2. dovuti alla ricerca di prodotti o di processi alternativi 3. dovuti alla necessità di risorse umane qualificate per poter gestire le nuove richieste normative Sostanze 4. probabile sparizione di molte sostanze perché troppo pericolose perché economicamente svantaggiose perché prodotte o importate “clandestinamente” 5. Maggiore conoscenza della effettiva pericolosità e quindi uso più consapevole lungo tutta la filiera Agenzia europea delle sostanze chimiche https://echa.europa.eu/regulations/reach/understanding-reach Agenzia europea delle sostanze chimiche 1. Trials Clinici (da to try, provare) 2. Studi epidemiologici  Le Sperimentazioni cliniche vengono in genere effettuate nelle strutture ospedaliere/universitarie pubbliche o private autorizzate. L'azienda o l'istituzione che finanzia lo studio è detta sponsor. Gli sponsor degli studi clinici sono quasi sempre le industrie farmaceutiche, interessate a sviluppare nuovi farmaci in vista della loro commercializzazione. Per questo investono somme ingenti, dato che gli studi clinici sono sempre lunghi e costosi. Uno studio è detto multicentrico quando coinvolge più istituti o centri di ricerca. La sperimentazione clinica è posta sotto il controllo delle autorità sanitarie pubbliche (Istituto Superiore di Sanità, Ministero della Salute, Comitati Etici regionali, Comitati Etici locali) ed è regolamentata da leggi precise. Per quanto riguarda i paesi dell'UE, dal 1995 esiste una struttura centralizzata (EMA) che ha lo scopo di coordinare e armonizzare le procedure in tutti i paesi dell'Unione Europea. Negli Stati Uniti l'autorità competente è la FDA (Food And Drug Administration). Necessaria una richiesta di autorizzazione alla sperimentazione clinica. Deve contenere: 1. Informazioni sulla composizione e sull’origine del farmaco 2. Informazioni sulla fabbricazione 3. Tutti i dati relativi alla sperimentazione sugli animali 4. Disegni e protocolli clinici 5. Nomi e CV dei medici che condurranno la sperimentazione clinica  Iter lungo e costoso, le cui norme sono descritte e stabilite dalla legge, in modo che siano garantiti i requisiti di eticità e minimizzati i rischi per i pazienti. Protocollo sperimentale condotto secondo gli standard della “Buona Pratica Clinica” (GCP = Good Clinical Practice) emanati dalla “International Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use”, su incarico di Stati Uniti, Europa e Giappone. In Italia la normativa europea è stata recepita con il DM 15 Luglio 1997 e successive modifiche; tale decreto definisce la GCP nel modo seguente: la Buona Pratica Clinica è uno standard internazionale di etica e qualità scientifica per progettare, condurre, registrare e relazionare gli studi clinici che coinvolgono esseri umani.  Analogamente alle norme di Buona Pratica di Laboratorio (Good Laboratory Practice) e di Buona Pratica di Fabbricazione (Good Manufacturing Practice), rivolte rispettivamente ai saggi tossicologici (GLP) ed alla produzione dei farmaci (GMP), le norme di GCP, fissando le responsabilità delle parti coinvolte, tendono al raggiungimento dei seguenti principali obiettivi: 1. il benessere e la sicurezza dei soggetti arruolati; 2. l’ integrità e trasparenza, e quindi l'attendibilità dei dati; 3. la possibilità di una loro verifica indipendente; 4. la protezione dei soggetti e la confidenzialità delle informazioni mediche raccolte su di essi.  I Comitati Etici sono organismi indipendenti costituiti secondo criteri di multidisciplinarità (nucleo di esperti e altri componenti). Valutano in senso etico e metodologico la sperimentazione clinica, hanno la responsabilità di garantire la tutela dei diritti, della sicurezza e del benessere dei soggetti in sperimentazione e di fornire pubblica garanzia di tale tutela, esprimendo, ad esempio, un parere sul protocollo di sperimentazione, sulle idoneità degli sperimentatori, sulla adeguatezza delle strutture e sui metodi e documenti che verranno impiegati per informare i soggetti e per ottenere il consenso informato. tre clinici un esperto in materia giuridica/assicurativa o un medico di medicina generale un medico legale un pediatra un rappresentante dell’area delle professioni un biostatistico sanitarie interessata alla sperimentazione un farmacologo un rappresentante di associazioni a tutela dei un farmacista pazienti il direttore sanitario/direttore un esperto in dispositivi medici scientifico ……… un esperto di bioetica Comitati Etici a valenza nazionale (CEN): Comitato etico nazionale per le sperimentazioni cliniche in ambito pediatrico, presso l’AIFA Comitato etico nazionale per le sperimentazioni cliniche relative a terapie avanzate presso l’AIFA Comitato etico nazionale per le sperimentazioni cliniche degli enti pubblici di ricerca e altri enti pubblici a carattere nazionale, presso l’ISS  Il consenso informato è così definito: ”La decisione di un soggetto candidato ad essere incluso in una sperimentazione, scritta, datata e firmata, presa spontaneamente, dopo esaustiva informazione circa la natura, il significato, le conseguenze ed i rischi della sperimentazione e dopo aver ricevuto la relativa documentazione appropriata. Attualmente la normativa di riferimento internazionale è espressa dalla dichiarazione di Helsinki, adottata dalla World Medical Association nel 1964 e poi aggiornata; l'ultima versione è del 2000. RICERCA CLINICA ED ETICITÀ Requisiti di uno studio etico Valore scientifico e sociale Validità scientifica (disegno e metodologia rigorosa ed appropriata) Giustizia nella selezione dei soggetti Rapporto favorevole tra rischi e benefici Revisione indipendente Consenso informato Rispetto dei soggetti Serve a valutare: Tollerabilità nell’uomo Dati di farmacocinetica Schema di dosaggio da impiegare nella fase II SOGGETTI: da 20 a 80 volontari sani, in età non avanzata, in cui si è documentata l’assenza di malattie e predisposizioni, di sesso preferibilmente maschile. (o pazienti in caso di farmaci ad alta tossicità*) DURATA: 1-2 anni. * Non vengono condotte sul volontario sano le sperimentazioni di nuovi antitumorali, di antivirali, di sostanze che abbiano un alto potenziale immunosoppressore. Le prove vengono condotte in pazienti, che danno comunque il loro pieno consenso, che non rispondono ai trattamenti a disposizione. Serve a valutare: efficacia e tollerabilità nei pazienti individuazione del rapporto dose/effetto SOGGETTI: 200-600 pazienti, selezionati tra quelli affetti dalla patologia per il trattamento della quale si richiede la registrazione del farmaco. DURATA: 1-2 anni durante i quali si deve identificare il range di dosi attive, la posologia ottimale e la conferma dei dati farmacocinetici in popolazioni speciali (pazienti) Acquisizione di dati di efficacia e tollerabilità su un ampio campione Verifica del significato clinico delle interazioni farmacologiche prevedibili Definizione finale del rapporto dose/effetto SOGGETTI: 1000-3000 pazienti (studi multicentrici). I criteri di inclusione sono meno restrittivi e sono presenti anche popolazioni speciali (anziani, bambini, soggetti con insufficienza renale o epatica) Durata: 3-4 anni. Generalmente le condizioni degli studi dovrebbero essere il piu` possibile vicine alle normali condizioni d’uso.  L'effetto placebo Il paziente percepisce un reale miglioramento della propria patologia (per esempio una riduzione della percezione del dolore). Perché si usa il placebo? L’utilizzo del placebo è un cardine della È la differenza tra l’effetto terapeutico sperimentazione clinica clinicamente misurabile e quello imputabile all’azione farmacologica della cura (effetto Gli effetti del placebo sono sottratti dagli effetti del specifico o farmacodinamico nel caso del trattamento attivo per identificare il vero effetto del trattamento farmaco). La differenza tra gli effetti del placebo e quelli del L’effetto placebo rappresenta trattamento deve essere sia clinicamente che l’effetto del contesto psicosociale statisticamente significativa! positivo (o negativo) che accompagna una terapia  CONTROLLO E RANDOMIZZAZIONE assegnazione casuale dei pazienti al gruppo sperimentale o di controllo assicura che tutti i fattori prognostici - noti e sconosciuti - si distribuiscano omogeneamente nei due gruppi  METODOLOGIA IN CIECO La cecità: non sapere….per non essere influenzati! La risposta dei partecipanti durante il follow up potrebbe essere condizionata dalla consapevolezza del tipo di trattamento ricevuto. Per eliminare questo bias si utilizza la metodologia in singolo cieco affinché i partecipanti non sappiano cosa hanno assunto. Se anche i medici che conducono lo studio non sono a conoscenza delle terapie somministrate ai diversi partecipanti (al fine di eliminare le influenze del loro giudizio soggettivo) lo studio è definito in doppio cieco.  Studio controllato confronto con placebo o con un farmaco standard Randomizzazione. I partecipanti sono allocati in modo casuale a uno degli interventi, ciò aumenta la probabilità che i due gruppi siano simili, in partenza, e che eventuali differenze negli esiti dipendano solamente dal tipo di intervento assegnato. La generazione delle liste di randomizzazione deve avvenire attraverso un processo realmente casuale Studio aperto o in cieco Si nasconde al paziente, allo sperimentatore (medico) o ad entrambi (doppio cieco) la conoscenza del trattamento allocato. Durante la sperimentazione clinica, si registrano anche tutti gli effetti avversi, sia quelli di lieve entità che quelli gravi, in tutti i gruppi sperimentali e si valuta se la loro frequenza varia tra i gruppi  Limiti delle sperimentazioni pre-marketing Ridotto numero di pazienti ( xantina + H2O2 (reazione catalizzata dalla xantina ossidasi) Catena respiratoria: anche la normale respirazione cellulare porta alla formazione di ROS (i radicali danneggiano la membrana ed il DNA mitocondriale che non ha sistemi di riparazione efficienti). Sistema immunitario: i granulociti neutrofili ed i macrofagi usano ROS per inattivare i batteri fagocitati. I macrofagi possono anche liberare un importante neuroregolatore, il nitrossido, NO. L’ 8-idrossi-2-deossiguanosina è una delle lesioni più abbondanti prodotte dai radicali liberi dell’ossigeno ed è perciò utilizzata per la valutazione diretta del danno come marcatore dello stress ossidativo 1. Possiede elevata stabilità 2. E’ abbondante nelle matrici biologiche extracellulari facilmente accessibili 3. Possiede un documentato potenziale mutageno determinando errori di accoppiamento fra le basi, transversioni GC→AT e quindi errori di lettura  BER (Base Excision Repair) OGG 1 (8-oxoG DNA glicosilasi/AP liasi)  Rimozione della base danneggiata  Incisione del risultante sito abasico  Processamento dei terminali prodotti, con la sintesi del nucleotide/i mancanti e il ripristino dell’integrità della catena fosfodiesterica del DNA da parte di una DNA ligasi  Nel 1909, Francis Peyton Rous scoprì che il virus, poi chiamato virus del sarcoma di Rous era in grado di causare tumori del tessuto connettivo nei polli. I virus oncogeni sono implicati in circa il 12% di tutti i tumori umani. Attualmente, sono stati identificati sette oncovirus umani riconosciuti, che includono il virus di Epstein-Barr (EBV), il virus del Papilloma Umano (HPV), i virus dell‘epatite B e C (HBV e HCV), il virus della leucemia umana a cellule T di tipo 1 (HTLV-1) che è l’unico a RNA, l’ herpes virus umano-8 (HHV-8) e il virus del sarcoma di Kaposi. I virus oncogeni possono causare tumori perché i loro geni possono integrarsi nel genoma dell’ospite, alterandone la struttura e stimolando la proliferazione cellulare, aumentando anche il rischio di mutazioni secondarie Un altro meccanismo della cancerogenesi virale, ma anche di quella provocata da altri microrganismi oncogeni quali il batterio Helicobacter pylori e i vermi Opistorchis viverrini e Clonorchis sinensis, è la stimolazione dell’infiammazione durante la quale vengono prodotti agenti genotossici come I ROS Servono a rivelare se una sostanza è in grado di provocare mutazioni. Il DNA è uguale in tutte le forme di vita per cui è possibile saggiare l’effetto su organismi più semplici dei mammiferi. L’attività mutagena è correlata a quella teratogena e cancerogena; circa la metà dei carcinogeni noti (positivi al test di cancerogenesi) sono anche mutageni.  Tempo Organismo Sistema di rilevamento necessario Mutazioni geniche Batteri < 5 giorni Riparazione di danni al DNA Mutazioni geniche Lieviti < 10 giorni Aberrazioni cromosomiche Mutazioni geniche (somatiche e Drosofila germinali) < 30 giorni Aberrazioni cromosomiche Mutazioni geniche (somatiche e germinali) Cellule di Aberrazioni cromosomiche < 30 giorni mammifero Riparazione del danno al DNA Scambi tra cromatidi fratelli Mutazioni geniche (somatiche e Roditori germinali) < 700 giorni Aberrazioni cromosomiche  Utilizza ceppi mutanti di Salmonella typhimurium, che hanno perso la capacità di sopravvivere in assenza di istidina (his-). Una sostanza mutagena può produrre una retromutazione  i batteri riacquistano la capacità di sopravvivere e di crescere in un mezzo privo di istidina. Ai batteri viene aggiunto in coltura sia l’agente chimico da testare sia la frazione microsomiale epatica (S9) ottenuta dal fegato di un ratto indotto, questo perché la maggior parte dei cancerogeni sono indiretti Batteri  Batteri Esecuzione: Batteri His- + sostanza da testare (+ S9) Incubazione (1 ora) Si trasferiscono i batteri in un medium privo di istidina Incubazione (1-2 giorni) Si contano le colonie Ogni colonia si sviluppa da un singolo batterio retromutato (his+). Il numero di colonie è una misura della potenza mutagena. Occorre avere un campione di controllo perché la retromutazione può avvenire anche spontaneamente  differenza tra il numero di colonie in presenza della sostanza e nel campione di controllo (senza la sostanza). Attività mutagena della aflatossina B1 valutata con il test di Ames  Il metodo richiede l’uso di mosche femmine CLB, portatrici di un cromosoma X, contenete un allele recessivo letale L ed un allele dominante marcatore B (occhio stretto); l'altro cromosoma X è normale. I maschi vengono trattati con la sostanza da testare e poi incrociati con le femmine CLB. 1. Le progenie maschili che ricevono il cromosoma X CLB muoiono, 2. le mosche di sesso femminile CLB vengono identificate grazie al fenotipo occhio stretto e incrociate a maschi normali. Drosophila melanogaster  Drosophila melanogaster Nella generazione successiva il 50% dei maschi morirà. L’ altro 50% dei maschi riceverà l’altro cromosoma X materno e presenterà vari fenotipi legati alla mutazione indotta.  Misurano il danno al DNA che si manifesta come danno delle struttura del cromosoma: rotture, riarrangiamenti, delezioni, duplicazioni, inversioni. Questo tipo di danno è coinvolto nella cancerogenesi e nello sviluppo di anomalie fetali e malattie congenite. Gli agenti che causano danno cromosomico sono detti clastogeni. I test per l’aberrazione cromosomica classici si basano sulla rivelazione del danno mediante analisi citogenetica, effettuata al microscopio ottico, dei cromosomi in metafase. Una tecnica più recente e sensibile è la CGH (Comparative Genomic Hybridisation)  Si utilizzano linee cellulari di mammifero. La più utilizzata è la CHO (Chinese Hamster Ovary), che fornisce cellule con un cariotipo ben definito e stabile. Le cellule vengono trattate durante la fase S del ciclo cellulare; le aberrazioni sono osservate alla prima divisione cellulare.  Test del micronucleo In vivo - Topi esposti alla sostanza in esame: sacrificio e prelievo del midollo osseo, preparazione dei vetrini, analisi e conteggio al microscopio dei micronuclei In vitro Strisci di sangue umano e linfociti isolati Tessuti fetali micronuclei, frammenti di Fibroblasti umani cromosoma  indice di danno Cellule epiteliali umane esfoliate cromosomiale. Cellule epatiche Cellule in meiosi Metodo per identificare e quantizzare delezioni e amplificazioni (DNA copy number variations). DNA integro DNA test  Sister chromatid exchange (SCE) Si esegue su linfociti umani isolati da sangue periferico o su cellule CHO Saggio in cui si determina lo scambio di segmenti tra i due cromatidi di un cromosoma, evidenziabile con una colorazione differenziale dei due cromatidi Studio di genotossicità in lavoratori addetti alla pavimentazione stradale (Burgaz S. et al., 1998) Sister chromatid exchange (SCE) Test richiesti per certificare l’attività mutagena di una sostanza, in paesi diversi Environmental Protection Agency Note: these lists may be subject to changes as REACH annexes are updated or new methodologies become available. Sistema di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche , armonizzato a livello internazionale. Disponibile dal 2003, viene aggiornato ogni due anni. IL GHS armonizza: 1. i criteri per la classificazione utilizzata per identificare i rischi chimici; 2. gli elementi di comunicazione del pericolo (inclusi i requisiti per l'etichettatura e schede di sicurezza). Per decenni in Europa, il sistema di classificazione, etichettatura e imballaggio delle sostanze chimiche si è basata su due direttive: 1. Direttiva 67/548/CEE del 1967, concernente la classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose, compresi gli emendamenti successivi 2. Direttiva 1999/45/CE relativa alla classificazione, imballaggio ed etichettatura dei preparati pericolosi  EU classification of carcinogenic, mutagenic and repro-toxic (CMR) substances Hazard categories Criteria known to have CMR potential for humans, based Cat. 1 A largely on human evidence presumed to have CMR potential for humans, based Cat. 1 B largely on experimental animal data Cat. 2 suspected to have CMR potential for humans evidence of adverse effects in the offspring due to transfer in the milk and/or on the quality of the milk effects on or via lactation and/or the substance is present in potentially toxic levels in breast milk CLP (Classification, Labelling and Packaging) R46: Può provocare alterazioni genetiche ereditarie R68: Può provocare effetti irreversibili H340 Può provocare alterazioni genetiche H341 Sospettato di provocare alterazioni genetiche  La riproduzione è un processo delicato, che può essere facilmente alterato dall’ esposizione a sostanze tossiche. La materia è regolata dalla direttiva CEE 75/318 (per i farmaci) e da linee guida di organizzazioni nazionali (EPA) ed internazionali (OECD). Il problema segnalato negli ultimi anni è la riduzione della fertilità maschile, dato contestato da alcuni che ritengono che il fenomeno sia dovuto a variazioni dello stile di vita e al maggiore accesso alle strutture sanitarie che consente a persone con problemi riproduttivi di rivolgersi al medico più di quanto non facessero in passato.  Studi condotti in varie parti del mondo indicano che esiste un trend negativo nella concentrazione di spermi umani per eiaculato. La riduzione della conta degli spermi è accompagnata ad un aumento di cancro testicolare ed è possibile che i due fenomeni siano correlati, perché gli oligospermici sono a maggior rischio di cancro testicolare dei normospermici; alcuni autori hanno avanzato l’ipotesi che questi effetti possano essere dovuti agli estrogeni ambientali.  Consistono nel trattamento di animali di ambi i sessi con dosi scalari di una sostanza, prima e dopo l’accoppiamento. In caso di inibizione della fertilità, per chiarire se gli effetti sono sul maschio o sulla femmina, l’esperimento viene ripetuto trattando in maniera differenziale i due sessi. Gli effetti di un tossico riproduttivo possono esercitarsi sui gameti maschili, femminili o sul feto.  Le alterazioni più comuni della funzione testicolare sono caratterizzate da diminuzione di peso, alterazioni morfologiche dei testicoli, o riduzione del numero e della vitalità degli spermatozoi, spesso come conseguenza o in associazione a alterazioni ormonali. Gli spermatozoi sono protetti funzionalmente, dalla selezione “dei migliori” e dagli alti livelli di antiossidanti nel liquido seminale  Per quanto riguarda le cellule uovo, esse sono protette dallo strato di cellule circostanti (la granulosa), che hanno funzione di metabolizzare ed in alcuni casi, detossicare gli xenobiotici Una donna nasce con circa un milione di cellule uovo, ma solo circa 500 arrivano a maturazione e possono essere fecondate. Gli ovuli sono in condizioni relativamente protette in quanto sono cellule quiescenti, inoltre gli oociti danneggiati vanno incontro ad apoptosi Fattori di protezione spermatici Fattori di protezione degli oociti Semplicità della struttura Mancanza di mitosi citoplasmatica Riduzione dei processi metabolici Alto livello spermatico di Filtrazione e metabolizzazione antiossidanti dei tossici da parte delle cellule Numero elevato di spermi prodotti della granulosa Apoptosi delle cellule danneggiate Apoptosi controllata Selezione delle cellule mobili  Pb Pesticidi e erbicidi (DDT, DDE, Dieldrin, Toxafene, Triazina) Cloruro di vinile Acrilamide Esano Ftalati  Oppiacei Estrogeni Antidepressivi Amiodarone (calcio antagonista) Acido valproico (antiepilettico)  Formaldeide Pb Metilmercurio Ftalati PCB-diossine policlorurate Stirene Erbicidi Toluene Cloruro di vinile  Steroidi Antineoplastici Anoressizzanti Agonisti degli oppioidi Anestetici generali Alcol e sessualità maschile Fetal Alcohol Syndrome (FAS) Impotenza, sterilità IQ della prole 1 mg/m3 ) aberrazioni cromosomiche leucemia mieloide acuta (LMA) anemia aplastica BENZINAI (Jacobsen, 1993) LMA RR= 3.6 (1.7-6.6)  Particolato Miscela di particelle di varie dimensioni che, quando le dimensioni sono >20 μm sedimenta altrimenti rimane sospeso in aria anche per lunghi periodi. Derivano da fonti naturali o antropiche. Il particolato può essere emesso direttamente da una sorgente (ad es. motori diesel) o formarsi in atmosfera per aggregazioni di particelle diverse (sabbia del deserto, ceneri di combustione), con adesione alle particelle stesse di composti organici più o meno volatili. Ogni combustione produce inevitabilmente particolato e nel periodo invernale il particolato è più elevato per la maggiore circolazione delle auto e per il riscaldamento domestico. Il particolato è il vettore meccanico di una serie di sostanze con effetti tossicologici importanti (IPA, Pb, Va, Mn, Zn, Ni). A seconda delle dimensioni delle particelle, il particolato si ferma a diverse altezze dell’albero respiratorio. …effetti >3 μ: vie aeree superiori fino a 200 μg/m3 aumento delle malattie respiratorie 3-1 μ: bronchi e bronchioli >500 μg/m3 aumento mortalità (Londra, 1953) 15 anni).  Estrogeni ambientali L’atrazina induce l’aromatasi, provocando alterazioni della fertilità negli agricoltori che la usano. L’ LD50 nel ratto è 1,8-3 g/kg, non è teratogena nè mutagena, la cancerogenicità è controversa*. L’aromatasi è l’enzima che trasforma gli androgeni in estrogeni. Nei paesi dove non è stata bandita, come gli USA, la quantità usata per ettaro è molto alta anche se le concentrazioni ambientali non devono superare per legge i 3 ppb. *Classificazione IARC 3 (Not classifiable as to its carcinogenicity to humans)  Distribuzione dell’atrazina negli Stati Uniti grigio28,7 kg/km2  Effetti dell’atrazina sulle gonadi maschili di rana pipiens Testicolo con inclusi ovarici Percentuale di gonadi anomale nei siti 1-8  Si definisce migrazione, il trasferimento di massa che avviene all'interfaccia imballaggio-alimento. I fattori che possono influenzare la migrazione possono essere suddivisi in 4 classi: 1.proprietà della sostanza migrante (migrazione spontanea di sostanze volatili o monomeri, migrazione per contatto di sostanze diffusive, migrazione per contatto di sostanze poco diffusive) 2.proprietà dell'alimento a contatto con l’imballaggio (contenuto di CO2, affinità per il migrante) 3. proprietà del materiale d'imballaggio (superficie) 4.condizioni d'uso dell'imballaggio stesso (tempo e temperatura)  Varia in funzione delle caratteristiche dell’alimento e delle condizioni di conservazione (es. acqua imbottigliata in contenitori di PET, conservata a varie temperature) Bach et al., 2013  Il 60% dei campioni analizzati ha mostrato attività estrogenica, misurata come attività estrogenica equivalente (EEQ) a quella del 17 b-estradiolo e di aumentare la capacità riproduttiva di molluschi (Wagner et al., 2011)  La prova che essa sia in gran parte associata all'imballaggio plastico è che l’attività è maggiore nel PET e nel tetrapak piuttosto che nel vetro.  Si stima che l’ esposizione alimentare giornaliera sia di 27,5-34,0 ng EEQ/d per gli adulti e di 1,46 ng EEQ/d per i neonati (Bher et al., 2011).  Sostanze particolarmente tossiche per l’apparato riproduttore maschile sono gli ftalati, prodotti in tutto il mondo e contaminanti delle plastiche; gli ftalati che sono quantitativamente uno dei principali prodotti industriali moderni. Particolarmente tossico sull’apparato riproduttivo è il dietilesilftalato (DEHP), componente importante di alcune plastiche, utilizzato anche nell’industria dell’abbigliamento per trattare e rendere anti-grinza le stoffe. Gli ftalati sono deboli agonisti dei recettori estrogenici, a cui si legano in concentrazione 100-1000 volte più alta rispetto agli agonisti fisiologici (estradiolo). Settori di utilizzo delle plastica in Italia (dati Farmindustria) 50 40 30 20 10 0  Il DEHP è classificato dall'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) come possibile cancerogeno per l'uomo (classificato come 2B). Il suo principale prodotto di degradazione, il MEHP (monoetilesilftalato) è risultato positivo a diversi test di mutagenesi.  Sono più presenti negli alimenti ricchi di grassi come latte fresco e derivati, carni e uova.  L'EFSA ha stabilito le dosi giornaliere tollerabili (TDI) per alcuni ftalati ed ha stimato che l’esposizione dell’uomo attraverso la dieta rientra nei valori di TDI. Based on the current literature on DEHP testicular toxicity, the Panel allocated a TDI of 0.05 mg/kg bw, based on a NOAEL of 5 mg/kg bw/day, and making use of an uncertainty factor of 100.  Tra i migranti più noti, la cui presenza è molto diffusa essendo utilizzato nella produzione di materie plastiche in policarbonato, resine epossidiche e altri materiali polimerici.  La principale via di esposizione è la dieta ma non è l’unica (carta termica).  Autorizzato tranne che nei biberon in policarbonato (dal gennaio 2011)  Nel gennaio 2014, l'EFSA ha individuato probabili effetti avversi sul fegato, reni e ghiandola mammaria, raccomandando una dose giornaliera tollerabile (DGT) di 5 μg/kg/die, 10 volte più bassa rispetto alla precedente  Secondo l’EFSA, il BPA rappresenta un basso rischio per la salute dei consumatori in quanto l’esposizione alla sostanza chimica è ben al di sotto della DGT provvisoria.  Il limite di migrazione imposto è attualmente di 0,6 mg/kg di alimento  Brede e colleghi (2003) hanno analizzato biberon in policarbonato, nuovi e usati, venduti in Norvegia, riscontrando concentrazioni di bisfenoli migrati di 0,23 µg/L nei biberon nuovi, 8,4 µg/L in biberon lavati in lavastoviglie 51 volte e 6,7 µg/ L in biberon lavati allo stesso modo, 169 volte.  Cao e Corriveau (2008) ha trovato bisfenoli nei biberon venduti in Canada, in concentrazioni da 228 a 521 µg/kg, dopo averli scaldati 70°C per 6 giorni.  Maragou e collaboratori (2008) hanno trovato concentrazioni di bisfenoli migrati da 2,4 a 14,3 µg/kg in 31 biberon in policarbonato venduti in Grecia.  Fortunatamente, la concentrazione di bisfenoli e ftalati non superano il limite di 0,6 mg di BPA/kg. Studio su cibi vegetali in scatola e su biberon e recipienti per microonde, sottoposti a sterilizzazione per le lattine (121°C per 15 min) o riscaldamento al microonde per gli altri (Gonzalez-Castro et al., 2010)  I risultati hanno mostrato la presenza di interferenti endocrini in tutti i campioni analizzati, soprattutto di acido ftalico ma a concentrazioni sotto i limiti imposti dall'Unione Europea. Thomson e Grounds (2005) hanno trovato valori compresi tra 10–29 µg/kg di BPA in 80 differenti campioni di cibo in scatola venduto in Nuova Zelanda. Valori tra i 29,9 e gli 80 µg/kg di BPA sono stati trovati in campioni di vegetali in scatola provenienti dal Brasile, Spagna, Francia, Turchia e USA (Brotons et al., 1995). Kang e collaboratori (2003) hanno trovato livelli più bassi, intorno ai 5 µ/kg sempre nel cibo in scatola, più bassi anche di quelli riportati da Yonekubo e collaboratori (2008) in 38 alimenti in scatola acquistati in Giappone.  Livelli urinari di BPA Tkalec et al., 2020 Significant association of fatty foods, such as butter (p = 0.014), sunflower oil (p = 0.095) and pastry (0.080) with BPA. BPA levels were negatively correlated with consuming more polar food items such as tea (p = 0.0098), milk (p = 0.020) and vitamin drink (p = 0.0024). Key Points Question Is exposure to bisphenol A, a ubiquitous chemical of concern, associated with long-term risk of mortality? Findings In a cohort study of 3883 adults in the United States, participants with higher urinary bisphenol A levels were at higher risk for death during approximately 10 years of observation. The adjusted hazard ratio comparing the highest vs lowest tertile of urinary bisphenol A levels was 49% higher for all-cause mortality and was 46% higher, albeit not statistically significant, for cardiovascular disease mortality. Meaning The findings in this study suggest that a higher level of bisphenol A exposure is associated with an increased risk of long-term all-cause mortality.