Tema 1: Anatomia del Genòmic PDF

Tema 1: Anatomia del genoma TEMA 1: ANATOMIA DEL GENOMA INTRODUCCIÓ DEL DNA o En la majoria del éssers vius, les molècules de DNA (desoxiribonucleic acid) contenen la informació genètica. o Per exemple, E. coli té només 1 cromosoma o El DNA conserva i tra...

Tema 1: Anatomia del genoma TEMA 1: ANATOMIA DEL GENOMA INTRODUCCIÓ DEL DNA o En la majoria del éssers vius, les molècules de DNA (desoxiribonucleic acid) contenen la informació genètica. o Per exemple, E. coli té només 1 cromosoma o El DNA conserva i transmet la informació biològica que caracteritza a un individu i a una espècie. o Les molècules de DNA d’un organisme s’organitzen en forma de cromosomes, i en conjunt constitueixen el seu genoma. o El genoma humà està format per 23 parells de cromosomes. o Durant el procés de replicació es replica tot el genoma per complert. Tot i que els gens dels cromosomes no tenen perquè actuar tots, només s’expressaran aquells que siguin necessaris. o Un gen (o unitat funcional del genoma) és un fragment del genoma que conté la informació necessària per produir una molècula d’RNA o una cadena polipeptídica funcional. Els organismes eucariotes tenim 2 tipus de DNA: o En el nucli cel·lular trobem el genoma nuclear (lineal), el qual s’hereta d’ambdós progenitors. o En els mitocondris trobem el genoma mitocondrial (circular), el qual prové exclusivament de la mare. El genoma d’un individu es pot replicar. Mitjançant el procés de transcripció podem obtenir còpies de RNA, les quals formen el transcriptoma. Quan es replica el genoma ho fa de manera completa, mentre que quan es transcriu només es transcriuen fragments! Les còpies de RNA es sotmeten a un procés de traducció i es sintetitzen totes les proteïnes corresponents al RNA. El conjunt s’anomena proteoma (conjunt de proteïnes que s’expressen a partir del genoma d’una cèl·lula en un moment i unes condicions determinades). 12 Tema 1: Anatomia del genoma FLUX DE LA INFORMACIÓ GENÈTICA o Entre altres funcions, l’RNA (ribonucleic acid), concretament l’RNA missatger (mRNA), participa en el flux de la informació genètica com a molècula codificadora intermediària entre el DNA I la proteïna. o En el procés de traducció (síntesi de cadenes polipeptídiques a partir d’mRNA) participem, entre d’altres, ribosomes (formats per proteïnes i RNA ribosomal, rRNA) i RNA de transferència (tRNA). FLUX DE LA INFORMACIÓ GENÈTICA EN EUCARIOTES En eucariotes, el DNA és una molècula de doble cadena situada al nucli. Aquest, a partir del procés de transcripció, pot formar un pre-mRNA mitjançant ribonucleòsids trifosfat (NTPs) i enzims, el qual conté exons i introns. Seguidament, el pre-mRNA és processat al nucli (s’eliminen els introns i s’uneixen els exons) per transformar-se en mRNA. En l’extrem 5’ s’afegeix guanina, i en l’altre una cua de poli-A. Un cop processat el mRNA ja pot sortir del nucli. Al citoplasma es du a terme la traducció del mRNA, procés en que els ribosomes, conjuntament amb el tRNA, aminoàcids, factors de traducció... expressen el mRNA en forma de proteïnes. El nuclèol s’encarrega de la síntesi de les unitats ribosomals, les quals surten cap al citoplasma una vegada ha estat acabada la seva síntesi. D’altra banda, el DNA es podrà replicar sempre que tinguem dNTPs (desoxinucleòsids trifosfat, són precursors utilitzats en reaccions de polimerització. La replicació completa del DNA té lloc al nucli. Els virus poden inserta-se al nostre genoma. DNA COM A MATERIAL GENÈTIC Nombre i tipus de proteïnes codificades pels genomes d’alguns eucariotes. 13 Tema 1: Anatomia del genoma EVIDÈNCIA DEL DNA COM A PORTADOR D’INFORMACIÓ GENÈTICA Griffith Avery-MaCLeod- McCarty El 1928, el bacteriòleg Griffith va dur a terme una sèrie d’experiments amb ratolins i bacteris Streptococcus pneumoniae. Ell no intentava identificar el material genètic, sinó que volia desenvolupar una vacuna contra la pneumònia. En els seus experiments, Griffith va utilitzar dues soques de bacteris relacionats, conegudes amb el nom de R i S. o Soca R: En ser cultivats en una placa de petri, els bacteris R formaven colònies, les quals tenien aspecte rugós i no eren virulentes (en ser injectades en un ratolí no causaven la malaltia). o Soca S: Els bacteris S formaven colònies rodones i llises. L’aspecte llis era degut a un embolcall de sucres que produïen els mateixos bacteris, el qual els hi conferia protecció en front al sistema immunitari dels ratolins. Per aquesta raó, aquests bacteris eren virulents (els ratolins injectats amb soques S vives desenvolupaven la pneumònia i morien). Com a part dels experiments, Griffith va introduir bacteris S morts per altes temperatures en ratolins i, com era d’esperar, aquests no causaven la malaltia. No obstant això, els experiments van patir un gir inesperat quan els innocus bacteris R es van combinar amb els inofensius bacteris S morts i es van injectar en un ratolí. Aquest no únicament va desenvolupar la pneumònia i va morir, sinó que Griffith també va trobar bacteris S vius en la sang del ratolí quan va prendre una mostra de sang. Griffith va concloure que els bacteris R van adquirir un principi transformant dels bacteris S morts per calor, el qual els va permetre transformar-se en bacteris de cobertura llisa i virulents. 14 Tema 1: Anatomia del genoma EXPERIMENT D’AVERY-MACLEOD-MCCARTY En 1944, Oswald Avery, Maclyn McCarty i Colin MacLeod van proposar-se identificar el principi transformant de Griffith. Van agafar grans cultius de bacteris S morts per calor i, a partir d’aquests, van purificar el principi transformant. Posteriorment, aquest producte transformant altament purificat va ser analitzat per determinar la seva identitat. Diverses evidències van suggerir que el principi transformant podia ser DNA, ja que la substància purificada havia donat negatiu en proves per detectar proteïnes (no era una proteïna), però havia donat resultats altament positius en una prova per detectar DNA. o La composició del principi transformant purificat era molt similar a la del DNA en porcions de nitrogen i fòsfor, i enzims que degradaven RNA tenien poc efecte sobre ell, mentre que enzims capaços de degradar DNA eliminaven l’activitat transformant. Tots aquests resultats apuntaven al DNA com el probable principi transformant. No obstant això, Avery se n’adonà que era possible que alguna substància contaminant en petites quantitats (i no el DNA) fos el principi transformant real. A causa d’aquesta possibilitat, no va ser fins el 1952 que Alfred Hershey i Martha Chase van utilitzar un enfocament alternatiu per identificar el DNA com a portador del material genètic. EXPERIMENT DE HERSHEY I CHASE Hershey i Chase estudiaven bacteriòfags (virus que atacaven bacteris), els quals estaven composats de proteïnes i DNA. Ells sabien que aquests bacteriòfags s’unien a la superfície de la cèl·lula hoste i injectaven alguna substància (ja fos DNA o proteïnes). Aquesta substància feia que la cèl·lula hoste comencés a produir el material genètic del bacteriòfag. Per determinar si era DNA o proteïnes el que s’injectava, van preparar dos lots diferents de bacteriòfags. En cada lot van introduir un element radioactiu específic que es va incorporar al DNA i proteïnes que composaven els bacteriòfags. o En una mostra es va introduir S-35 (un isòtop radioactiu del sofre). El sofre està present en moltes proteïnes i absent en el DNA, de manera que aquest tractament només marcava les proteïnes del bacteriòfag. o En l’altra mostra va introduir-se P-32 (un isòtop radioactiu del sofre). El fòsfor es troba en el DNA i està absent en les proteïnes, de manera que aquest tractament només marcava el DNA del bacteriòfag. 15 Tema 1: Anatomia del genoma Cada lot de bacteriòfags es va utilitzar per infectar diferents cultius de bacteris. Després de la infecció, els cultius es van liquar per retirar els bacteriòfags de l’exterior de la superfície de les cèl·lules bacterianes i, posteriorment, van patir una centrifugació (procés que va fer que els bacteris es disposessin a la part inferior del tub formant una massa = sediment. Les restes de bacteriòfags van quedar a la part superior del tub formant una massa = sobrenedant). Quan Hershey i Chase van mesurar la radioactivitat del sediment i del sobrenedant en ambdues mostres, van trobar que una gran quantitat de P-32 apareixia en el sediment, mentre que quasi tot el S-35 es trobava en el sobrenedant. En base a això i a altres experiments similars, van concloure que era el DNA (i no proteïnes) era el portador de la informació genètica. CONTINGUT EN DNA D’ALGUNS VIRUS I GENOMES D’ORGANISMES VIUS Com més complex és un virus, més DNA té. En eucariotes, tenir més DNA no implica tenir més gens ni cromosomes! En canvi, en els procariotes sí. o Els eucariotes tenen introns i exons, i n’hi ha regions no codificants, per tant, el nombre de gens no és proporcional a la complexitat, al número de parells de bases d’un organisme o al nombre de cromosomes. o Els procariotes no tenen introns i totes les regions són codificants. 16 Tema 1: Anatomia del genoma RELACIÓ CONTINGUT DE DNA I EL NOMBRE DE CROMOSOMES D’UN ORGANISME El genoma del muntjac comú és d’igual tamany que l’humà, però només está composat per 3 parells de cromosomas molt grans. Cèl·lula híbdrida amb el genoma d’un mutjac comú (taronja) i 2 cromosomes humans (verd). En les eucariotes no hi ha correlació quantitat del DNA i el nombre de cromosomes. COMPOSICIÓ DELS ÀCIDS NUCLEICS. DNA I RNA Els àcids nucleics són polímers lineals de nucleòtids (= nucleòsids fosfat), els quals estan enllaçats entre sí mitjançant enllaços fosfodièster que van del C5 d’un nucleòtid al C3 del següent. Els nucleòsids monofosfats, rNMPs i dNMPs, són els monòmers constituents dels àcids nucleics. Altrament, els nucleòsids trifosfats, rNTPs i dNTPs, són molècules precursores en la síntesi dels àcids nucleics. Nucleòtids constituents dels àcids nucleics: Nucleòtids: fosfat + sucre + base nitrogenada Els fosfats, a pH fisiològic, són responsables de la càrrega negativa dels àcids nucleics COMPOSICIÓ DELS ÀCIDS NUCLEICS (DNA I RNA) o Bases nitrogenades: o Púriques (no planes): adenina i guanina o Pirimidíniques (planes): citosina, timina (DNA) i uracil (RNA) La citosina es diferència de l’uracil perquè aquesta té un grup amí, mentre que l’uracil té un grup ceto. D’altra banda, l’uracil es diferència de la timina perquè aquest no té un metil i la timina sí, així és que la timina té un desgast energètic molt major a causa d’aquest grup. El fet que el DNA tingui timina en comptes d’uracil a pesar de ser energèticament més costosa és perquè la citosina, quan es desamina, dona lloc a l’uracil. Aleshores, no podríem diferenciar la citosina desaminada de l’uracil i podrien produir-se mutacions. En canvi, en el RNA no ens preocupa tenir mutacions, ja que durant la transcripció obtenim moltes còpies (tot i que una còpia patís mutacions les altres seguirien essent correctes). o Sucre: pentosa o Ribosa (RNA) o Desoxiribosa (DNA) 17 Tema 1: Anatomia del genoma CONFORMACIÓ DE L’ENLLAÇ N-BETA-GLICOSÍDIC La unió de la base nitrogenada amb la pentosa es dona mitjançant un enllaç N-β-glicosídic que s’estableix entre el C1 de la pentosa i un nitrogen de la base (el N1 si és pirimidínica o el N9 si és púrica). Amb la unió es desprèn una molècula d’aigua. L’enllaç pot girar sobre sí mateix, de manera que l’orientació de la base pot variar respecte la pentosa. Aleshores, podem obtenir dues conformacions diferents: o Anti: la base es troba el més allunyat del sucre (base dibuixada a fora o a la dreta de la pentosa) o Syn: la base es troba el més a prop del sucre (base dibuixada a sobre de la pentosa) 18 Tema 1: Anatomia del genoma BASES MODIFICADES DNA RNA En el DNA trobem bases modificades La inosina permet reconèixer codons en determinades regions. Una forma que codifiquen per un aminoàcid. de modificació és la metilació de les La pseudouridina es troba unida a la bases. ribosa pel C5 en comptes d’estar-ho La metilació consisteix en el bloqueig per un nitrogen. de la transcripció d’un gen actiu. La tiouridina té un grup tiol en lloc Tanmateix, provoca canvis d’un grup ceto. estructurals en la cromatina, la qual passa a ser heterocromatina i perd la seva capacitat de transcriure’s. PROPIETATS FISICOQUÍMIQUES DE LES BASES o Són bases febles (pKa = 9-10) o Són molècules planes o quasi planes o Absorbeixen llum al UV (260 nm) o Són hidrofòbiques i relativament insolubles en aigua a pH fisiològic, encara que els oxígens i els nitrògens poden formar enllaços d’hidrogen. o Presenten tautomeria: o Amino (-NH2) – imino (=NH) o Ceto (=O) – enol (-OH) ESTRUCTURA PRIMÀRIA DELS ÀCIDS NUCLEICS: POLINUCLEÒTIDS I ENLLAÇ FOSFODIÈSTER Els àcids nucleics són cadenes llargues formades per nucleòtids units covalentment (enllaços 3’-5’ fosfodièster) de forma lineal. El sentit va de 5’à 3’! L’estructura primària dels àcids nucleics és la seqüència de nucleòtids. L’esquelet lineal (part constant formada per pentoses i fosfats que es van alternant en la cadena) té funció estructural. D’altra banda, la seqüència de bases púriques i pirimidíniques (part variable, les quals estan unides a intervals regulars a l’esquelet lineal) codifica la informació genètica. 19 Tema 1: Anatomia del genoma REGLES D’APARELLAMENT DE BASES: REGLES DE CHARGAFF o La composició de bases del DNA és característica de cada espècie. o El DNA aïllat de teixits diferents procedents de la mateixa espècie té la mateixa composició de bases. o La composició de bases del DNA d’una espècie no varia amb l’edat del organisme, l’estat nutricional o els canvis medi-ambientals. o En la majoria dels DNAs, el contingut de purines és aproximadament igual al de pirimidines: el quocient (A+G) / (T+C) és aproximadament 1. ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL RNA És el primer nivell d’estructura tridimensional que adopten les cadenes del DNA. El DNA és polimòrfic, ja que dintre d’una mateixa espècie existeixen variacions entre individus. Per estudiar més detalladament l’estructura del DNA, Rosalind Franklin va analitzar DNA mitjançant la difracció de raigs X. Durant aquests estudis va sorgir la famosa “Foto 51”, una imatge que va permetre a Franklin detallar les distàncies relatives entre diferents elements repetitius en una molècula de DNA (bases nitrogenades), a més de permetre el descobriment d’una certa complementarietat entre aquestes. La foto 51 va ser la peça clau per les investigacions de Watson i Crick, els quals van construir el primer model correcte de l’estructura de la molècula de DNA à dues cadenes de DNA amb forma helicoidal = doble hèlix (dextrògira). Models estructurals secundaris: o B-DNA (doble hèlix de Watson i Crick, 1953) o A-DNA o Z-DNA o Estructura de forqueta i cruciforme o H-DNA (triple hèlix de Hoogsten) B-DNA Watson i Crick, després de descobrir que el DNA era una doble hèlix, van concloure que: o Està format per dues cadenes antiparal·leles de polinucleòtids. o Són cadenes complementàries que interaccionen per ponts d’hidrogen entre parells de bases. o Les interaccions són entre purines i pirimidines 20 Tema 1: Anatomia del genoma o Les dues cadenes formen una doble hèlix dextrogira. o Les bases, orientades cap a l’interior de l’hèlix, es disposen quasi perpendicularment a l’eix longitudinal de l’estructura i s’apilen paral·lelament entre si. o Els esquelets lineals de les cadenes se situen en l’exterior de l’hèlix. o El model B-DNA té aproximadament 10 pb/volta d’hèlix (36 Å) (10,5 pb/volta, en solució). o S’estabilitza principalment per ponts d’hidrogen entre els parells de bases complementaris (A-T à 2 PH ; C-G à 3 PH). o És una doble hèlix asimètrica: té un solc major i un solc menor. SOLC MAJOR I SOLC MENOR La formació d’un enllaç d’hidrogen requereix que els àtoms implicats se situïn sobre una línia quasi recta (formant gairebé un pla). Els enllaços N-β-glicosídics no es disposen totalment perpendiculars a l’eix longitudinal de l’hèlix. Es generen dos angles diferents entre els enllaços N-β-glicosídics complementaris (uns 120º per un costat i uns 240º per l’altre) i, en formar-se la doble hèlix, l’angle de 120º genera un solc menor i el de 240º genera un solc major. Les proteïnes d’unió al DNA interaccionen específicament amb el solc major, el qual conté més grups exposats (donadors i acceptors d’hidrogen, i superfícies hidrofòbiques -grups metil i hidrògens no polars-). El codi dels grups exposats en el solc major (G≡C: AADH, C≡G: HDAA, A=T: ADAM, T=A: MADA) permet el reconeixement específic per part de proteïnes interaccionants amb el DNA sense necessitat d’obrir la doble hèlix. B-DNA: LA DOBLE HÈLIX QUE PERMET MÚLTIPLES CONFORMACIONS Les bases nitrogenades de cada parell de bases enfrontades poden fer un cert gir helicoidal. En conseqüència, els solcs major i menor poden variar localment. 21 Tema 1: Anatomia del genoma ALTRES ESTRUCTURES SECUNDÀRIES DEL DNA A-DNA o Forma afavorida in vitro per deshidratació o Doble hèlix més compacta, curta i gruixuda, amb 11 pb per volta o Dextrògira o Només tenim aquest DNA en híbrids DNA-RNA i en plegaments secundaris RNA-RNA Z-DNA o Forma afavorida in vitro a altes concentracions de Na+ o Doble hèlix més prima i llarga, amb 12 pb per volta o Plegament zig-zag de l’esquelet covalent o Levògira o Es troba en seqüències curtes on s’alternen pirimidines (en conformació anti) i purines (en conformació syn), especialment C, o 5-metil-C, i G VARIACIONS ESTRUCTURALS EN ALGUNES SEQÜÈNCIES DE DNA PALÍNDROMS I REPETICIONS ESPECULARS Palíndrom: és la repetició invertida de la cadena complementària. Els palíndroms que generen estructures autocomplementàries dins de la mateixa cadena poden actuar com a senyals de reconeixement de moltes proteïnes reguladores de l’expressió gènica. Els palíndroms poden formar estructures en forqueta (hairpin) i cruciformes. Quan es desnaturalitza una regió (es trenca l’estructura secundària i se separen les cadenes), es trenquen els ponts d’hidrogen intracatenaris entre bases. No obstant això, el DNA pot tornar a formar-los d’una manera alternativa, donant com a resultat la formació de dos forquetes en les quals s’aparellen repeticions invertides (complementarietat). Repetició especular: és la repetició invertida a la mateixa cadena (com si ho miréssim a través d’un mirall). 22 Tema 1: Anatomia del genoma APARELLAMENTS DE HOOGSTEEN Els enllaços de Hoogsteen permeten la formació d’estructures de DNA de 3 o 4 cadenes (H-DNA). Aquest es forma en regions amb només purines (GA) o pirimidines (CT) en una cadena. La formació de l’estructura està afavorida in vitro en medi àcid, ja que promou la protonació de les citosines. Tanmateix, In vivo la cadena senzilla pot interaccionar amb proteïnes. Una cadena queda desaparellada, doncs si hi ha proteïnes que volen interaccionar amb el DNA tindran el seu espai per fer-ho. Altrament, es pot formar una hèlix quàdruple (tot i que només es dona en seqüències de DNA amb una alta proporció de guanosines). L’estructura que es forma és molt estable, i la seva orientació pot ser paral·lela o antiparal·lela. ESTRUCTURES SECUNDÀRIES DEL RNA L’RNA és una cadena lineal. Les estructures secundàries que forma són més diversificades, doncs s’ha de plegar buscant zones complementàries en la seva pròpia cadena. Com que és difícil trobar regions completament complementàries, n’hi ha zones que queden amb cadena senzilla (= bases desaparellades). L’estabilitat de les estructures secundàries de l’RNA es veu afavorida per tetrallaços (tetraloops) formats per la seqüència C(UUCG)G (freqüent en els extrems de les forquetes -5’-), i la formació de pseudonusos (pseudoknots) entre seqüències complementàries allunyades. Aquests protegeixen els extrems de la cadena mitjançant la creació de nusos (entre bases i sucres complementaris) per tal que la cadena no quedi lliure. PROPIETATS FISICOQUÍMIQUES DELS ÀCIDS NUCLEICS o Les cadenes dels àcids nucleics són hidròfiles. o Són àcids amb moltes càrregues negatives a pH fisiològic. o A pH neutre i temperatura ambient, les solucions de DNA són molt viscoses; són molècules força rígides i molt llargues respecte al seu diàmetre. o Absorbeixen llum al UV (260 nm). o Són químicament molt estables, principalment el DNA. o Hidròlisi química: o Els enllaços fosfodièster i glicosídics del DNA i l’RNA s’hidrolitzen per tractament amb àcids forts. o Els àcids febles hidrolitzen únicament els enllaços glicosídics. o La hidròlisi alcalina trenca els enllaços fosfodièster de l’RNA, però no del DNA. 23 Tema 1: Anatomia del genoma HIDRÒLISI DELS ENLLAÇOS FOSFODIÈSTER DEL RNA MEDIADA PER OH- L’RNA és més reactiu que el DNA perquè té hidroxils lliures en els carbonis 2’. En un medi bàsic s’hidrolitzen els enllaços fosfodièster de l’RNA. AGENTS DESNATURALITZANTS Els agents desnaturalitzants, in vitro, eliminen estructures secundàries: o Temperatura elevada: o 95-100ºC, per al DNA o 60-65ºC, per a l’RNA o Solucions alcalines (solucions diluïdes de NaOH, pH=11, per al DNA). o Tractaments amb agents químics desnaturalitzants: o Urea o Formamida o Formaldehid El DNA, en ser una doble cadena estabilitzada per PH i forces hidrofòbiques entre bases de la mateixa cadena, serà més difícil de desnaturalitzar que l’RNA, el qual està format per una única cadena amb zones senzilles (desaparellades) que seran més fàcils de desnaturalitzar. Desnaturalitzar és separar les interaccions entre bases, no és el mateix que la hidròlisi. DESNATURALITZACIÓ I RENATURALITZACIÓ (HIBRIDACIÓ) DEL DNA La desnaturalització del DNA consisteix en la separació de la doble cadena per tal d’obtenir cadenes simples. Manipulant adequadament la temperatura i el pH d’una solució es poden trencar els enllaços d’hidrogen de la molècula per separar les cadenes. No obstant això, generalment és un procés reversible, doncs si les condicions de temperatura i pH tornen als seus valors normals la desnaturalització es pot invertir. Aquest procés rep el nom de renaturalització, el qual consisteix en la unió novament de les cadenes per tal d’obtenir l’estructura de la doble hèlix. Ara bé, perquè la renaturalització es pugui donar és necessari que durant la desnaturalització no es trenquin els enllaços fosfodièster entre nucleòtids! La separació de les cadenes de DNA és de vital importància pel procés de replicació i transcripció, per exemple. DESNATURALITZACIÓ TÈRMICA DEL DNA La temperatura de fusió (tm) del DNA és la temperatura en què el 50% de la molècula està desnaturalitzada. Aquesta s’incrementa proporcionalment al seu contingut en aparellaments G≡C. Quan la temperatura és elevada es trenquen els ponts d’hidrogen i, en conseqüència, es desnaturalitza el DNA. Tanmateix, podrem saber si el DNA a analitzar té més parells de bases A-T o C-G en funció de la desnaturalització, doncs un DNA format per més parells A-T serà més fàcil de desnaturalitzar que un amb més parells C-G, ja que entre A-T tenim 2 ponts d’hidrogen i en C-G tenim 3 (és més fàcil trencar 2 enllaços que no pas 3). També influeix la llargada 24 Tema 1: Anatomia del genoma de la cadena, ja que una cadena major tindrà un nombre més elevat de ponts d’hidrogen. És per aquest motiu que en gràfic podem determinar que el DNA vermell té més parells C-G que el blau perquè requereix més temperatura per desnaturalitzar- se. HIBIDRACIÓ DEL DNA El grau d’hibridació del DNA s’utilitza per comparar similituds entre espècies diferents. Si agafem dos tipus diferents de DNA i els barregem podrem observar la presència o no d’híbrids. Si n’hi ha híbrids vol dir que hi ha seqüències complementaries. ABSORCIÓ DE LLUM UV El DNA de cadena senzilla absorbeix llum més eficaçment que el DNA de cadena doble a causa de la disposició de les bases. En una cadena doble queden bases a l’interior, mentre que en una cadena senzilla totes estan exposades a la llum. o Hipocromisme: disminució d’absorbància produïda en la formació del dúplex de DNA. o Hipercromisme: augment d’absorbància produïda en la desnaturalització del DNA. SUPERENROTLLAMENT I TOPOISOMERASES TOPOLOGIA I TOPOISOMERASES La topologia estudia propietats estructurals invariants per deformitat com ara estiraments o doblaments. Com que el DNA té una estructura de doble hèlix, la separació de les cadenes condueix a estrès i superenrotllament si aquest està restringit (no lliure de girar). De normal, el DNA té 10 pb/volta, però aquest nombre disminueix quan s’origina tensió estructural. El DNA circular tancat normalment no està relaxat, de manera que la tensió originada en la molècula el fa recargolar-se sobre sí mateix. D’altra banda, el DNA lineal està sotmès a l’ajut de les proteïnes per evitar que les cadenes puguin girar. 25  Tema 1: Anatomia del genoma El superenrotllament facilita la separació posterior de les cadenes. Aquest procés és molt útil durant la divisió cel·lular, ja que es duen a terme els processos de replicació i transcripció del DNA, els quals requereixen dita separació. La tensió estructural de la doble hèlix del DNA genera superenrotllament en forma solenoidal (gira com al voltant d’un cilindre) o plectonèmica (les cadenes s’envolten l’una amb l’altra). Ambdues formes són interconvertibles i la forma solenoïdal permet una major compactació del DNA. El superenrotllament es pot quantificar pel número d’enllaç Lk (nombre de vegades que una cadena creua l’altra). Aquest sempre és un número enter per un DNA circular tancat. És sempre un número positiu per definició, ja que la superhèlix va en la mateixa direcció de la doble hèlix del B-DNA (cap a la dreta). En un DNA circular, el canvi de voltes en el B-DNA requereix el trencament de les cadenes de forma transitòria. En el DNA relaxat el número d’enllaç Lk és: Lk = número de pb ÷ número de bases per volta Exemple: Un dsDNAR circular i relaxat de 2100 pb en forma de B (10.5 pb per volta) té: Lk = 2100 pb ÷ 10.5 bases per volta = 200 La ΔLk i la densitat superhelicoidal (σ) per descriure el superenrotllament: Recordem que per un DNA de 2100 pb: Lk0 = 200 Si eliminem dues voltes de B-DNA: Lk = 198 DLk = Lk- Lk0 =198 – 200 = –2 A partir de Lk també es pot determinar la densitat superhelicohidal (s): En aquest cas es dona de forma que no es té en compte la longitud del DNA: s = -2/200= -0,01 (1 volta eliminada per cada 100 voltes) Per conveni, el superenrotllament pot ser: o Negatiu: es genera si la doble hèlix té menys voltes que el model relaxat (com és el cas del DNA desenrotllat). La tensió estructural provocada s’estabilitza promovent la formació d’un superenrotllament negatiu. La superhèlix generada gira en el mateix sentit que la doble hèlix (dextrògira en el cas del DNA). o En els éssers vius les voltes superhelicoidals són negatives perquè la doble hèlix del DNA està parcialment desenrotllada (té menys voltes que el model relaxat de Watson i Crick). 26 Tema 1: Anatomia del genoma o Es dona en tots els DNA cel·lulars i està estrictament regulat. o Compacta el DNA facilitant la separació de les cadenes durant la replicació i la transcripció. o Positiu: es genera si la doble hèlix té més voltes que el model relaxat. La tensió estructural provocada s’estabilitza promovent la formació d’un superenrotllament positiu. La superhèlix generada gira en sentit contrari a la doble hèlix. DNA PLASMÍDICS Els plasmidis són molècules petites de DNA circular tancat de doble cadena, els quals es troben al citoplasma de molts bacteris. El grau de superenrotllament dels plasmidis és característic de cada molècula. PROPIETATS TOPOLÒGIQUES DEL DNA o El nombre d’enllaç, Lk (linking number), es pot definir com el nombre de vegades que dues cadenes del DNA es creuen (no es poden separar sense trencament). o Lk0 és el nombre d’enllaç del DNA relaxat (es pren com a referència). o La diferència d’enllaç, ΔLk, permet determinar el grau de superenrotllament del DNA: ΔLk = Lk- Lk0 o El Lk és la suma de dos components: o Lk = Tw + Wr Tw (twist) = nombre de girs de les cadenes de la doble hèlix (enrotllament helicoïdal de les cadenes entre si) Wr (writhe) = nombre de torsions de l’eix de la doble hèlix (nombre de voltes de superhèlix) TOPOISÒMERS Isòmers estructurals que només es diferencien en una propietat topològica, com el nombre d’enllaç topològic (Lk). Són resultat dels diferents graus de superenrotllament del DNA. Aquests es poden transformar entre si mitjançant el tall d’una o les dues cadenes de DNA i posterior unió, i es poden separar entre si mitjançant electroforesi en gel d’agarosa (el superenrotllament condensa el DNA). 27 Tema 1: Anatomia del genoma TOPOISOMERASES Les topoisomerases són enzims encarregats in vivo d’interconvertir els topoisòmers del DNA. Aquestes catalitzen el canvi en el nombre d’enllaç del DNA (Lk), i augmenten o disminueixen el grau d’enrotllament del DNA (el superenrotllen o el relaxen). També encadenen i desencadenen molècules de DNA circular. Són imprescindibles en la transcripció, replicació i compactació del DNA. Hi ha dos tipus principals de topoisomerases: o Tipus I o Tipus II Les topoisomerases de tipus I i II tallen cadenes de DNA mitjançant la formació d’un intermediari covalent entre un residu de tirosina i una cadena de DNA. Procariotes i eucariotes tenen topoisomerases tipus I i II que eliminen superenrotllament negatiu (relaxen el DNA). E. coli té una topoisomerasa tipus II (DNA-girasa) que introdueix superenrotllament negatiu (compacta el DNA). Les topoisomerases eucariotes no generen superenrotllament negatiu! TOPOISOMERASES DE TIPUS I o Trenquen únicament una de les cadenes del DNA i catalitzen la relaxació del DNA superenrotllat, en un procés termodinàmicament favorable. o Eliminen superenrotllament negatiu. o Cada cicle catalític augmenta Lk en una unitat. o Inhibidors de la topoisomerasa I humana s’utilitzen com a agents antitumorals 28 Tema 1: Anatomia del genoma FÀRMACS INHIBIDORS DE LA TOPOISOMERASA I EN TERÀPIA CONTRA EL CÀNCER o Irinotecan: contra el càncer colorectal o Topotecan: contra el càncer d’ovari i pulmó Ambdós són derivats d’un alcaloide natural (camptotecina) aïllat de l’escorça d’un arbre xinés. El càncer fa referència a qualsevol d’un gran nombre de malalties que es caracteritzen pel desenvolupament de cèl·lules anormals, les quals es divideixen descontroladament i tenen la capacitat d’infiltrar-se i destruir el teixit corporal normal. Sovint el càncer es propaga per tot l’organisme. Si s’inhibeix la topoisomerasa I no es pot eliminar el superenrotllament negatiu i, en conseqüència, no es pot replicar el DNA. Aleshores, el tumor no podrà expandir-se. TOPOISOMERASES DE TIPUS II o Trenquen les dues cadenes del DNA. o En procariotes poden generar superenrotllament negatiu (disminueixen Lk). Necessiten l’energia d’hidròlisi de l’ATP per promoure canvis conformacionals enzimàtics. Les topoisomerases II d’eucariotes no generen superenrotllament negatiu, però poden relaxar superenrotllaments positius i negatius. o La topoisomerasa II bacteriana (DNA-girasa) és diana de diversos antibiòtics. FÀRMACS INHIBIDORS DE LA DNA-GIRASA COM A AGENTS TERAPÈUTICS o Àcid nalidíxic (poc actiu, ja no s’utilitza) o Ciprofloxacin: per a la infecció urinària Antibiòtics sintètics derivats de quinolines, com la ciprofloxacina (antibiòtic d‘ampli espectre), o el norfloxací (utilitzat fonamentalment contra infeccions urinàries). 29 Tema 1: Anatomia del genoma ALTRES FUNCIONS DE LES TOPOISOMERASES Les topoisomerases tenen també altres funcions importants en el manteniment de l’estructura del DNA: o Enrotllen i desenrotllen molècules de DNA circular. o Desenrotllen els cromosomes lineals després de la replicació. o Desfan nusos del DNA generats en algunes reaccions de recombinació. GENOMA PROCARIOTA I EUCARIOTA CONTINGUT EN DNA D’ALGUNS CIRUS I GENOMES D’ORGANISMES VIUS o A un nivell superior en l’escala evolutiva li correspon un contingut més gran de DNA. o Entre els eucariotes, el contingut de DNA no té relació lineal amb la complexitat biològica. o Paradoxa del valor C (o quantitat de DNA per genoma haploid): no hi ha una correlació directa entre la mida del genoma i el nombre de gens. o Una gran quantitat del DNA eucariota no codifica per cap producte gènic. o Hi ha una correlació inversa entre la complexitat de l’organisme i la densitat gènica: com més simple és l’organisme més densitat gènica presenta. (nombre de gens / mida del genoma). GENOMA PROCARIOTA: COMPACTACIÓ DEL DNA D’ESCHERICHIA COLI El cromosoma bacterià és una estructura relativament dinàmica, indicatiu de la necessitat de tenir un accés ràpid a la informació. El genoma és una molècula única de DNA de gran mida (4.6 · 106 pb), molt compactada i condensada en una zona central del citoplasma cel·lular. L’estructura del genoma es coneix com a NUCLEOIDE (doble hèlix circular compactada unida a proteïnes formant 500 llaços o dominis d’unes 10 Kb cadascun). Els llaços són importants perquè si un d’ells es trenca només es relaxaria un domini i no tindria conseqüències pel següent. Per aquest motiu és una mesura de protecció. Les proteïnes són de tipus histona, petites i generalment bàsiques (HU, 19 kDa). Aquesta estructura en dominis: o Protegeix la informació gènica o Augmenta el grau de compactació de la molècula. 30 Tema 1: Anatomia del genoma GENOMA EUCARIOTA El genoma eucariota és més complex i gran, per tant, s’ha de compactar molt més. La compactació es produeix pel superenrotllament i la unió a proteïnes. Quan el DNA està compactat no es pot replicar ni expressar, però és la manera en què s’aconsegueix separar bé la informació entre dues cèl·lules filles sense que hi hagi pèrdues ni intercanvis incorrectes. El grau de compactació del DNA varia en funció de les fases del cicle cel·lular: o El màxim nivell d’empaquetament del DNA és el cromosoma, visible en el nucli en metafase. o Quan les cèl·lules estan en interfase, el DNA està menys condensat (en forma de cromatina). Els cromosomes i la cromatina estan formats per DNA, proteïnes i una petita porció d’RNA. FASES DEL CICLE CEL·LULAR EN EUCARIOTES En les cèl·lules eucariotes, el cicle cel·lular es divideix en dues fases: o Interfase: la cèl·lula creix i fa una còpia del seu DNA o Fase G1: la cèl·lula creix físicament, còpia els orgànuls i fabrica components moleculars que necessitarà en etapes posteriors. o Fase S: la cèl·lula sintetitza una còpia completa del DNA al seu nucli. També duplica el centrosoma (estructura d’organització de microtúbuls), el qual ajuda a separar el DNA durant la fase M. o Fase G2: la cèl·lula encara creix més, fa proteïnes i orgànuls, i comença a preparar el seu contingut per preparar la mitosi. Aquesta fase termina quan comença la mitosi. o Fase M (mitòtica): la cèl·lula separa el seu DNA en dos grups i divideix el seu citoplasma per formar dues cèl·lules noves o Profase o Metafase o Anafase o Telofase GRAU DE COMPACTACIÓ EN LA CROMATINA o Eucromatina: o Regions de cromatina amb un grau d’empaquetament baix, no visibles al microscopi òptic. o El DNA es pot replicar i transcriure, és accessible. o Heterocromatina: Regions de cromatina molt més empaquetada (10000 x), visible al microscopi òptic i no activa transcripcionalment. Pot ser de dos tipus: 31 Tema 1: Anatomia del genoma o Constitutiva: sempre amb el màxim nivell de compactació i és transcripcionalment inactiva (centròmers, telòmers). o Facultativa: cromatina que no sempre està tant compactada. Quan no està compactada pot haver transcripció, expressió gènica (en un moment donat o en un determinat teixit). CONDENSACIÓ DEL DNA 1. En el nivell més simple, la cromatina té estructura de doble hèlix de DNA. 2. El DNA s’uneix a histones (proteïnes) formant els nucleosomes. Aquests ajudaran a l’empaquetament. 3. Cada nucleosoma consta de 8 histones al voltant de les quals el DNA s’embolica 1,65 vegades (no arriba a 2 voltes) 4. El cromatosoma consta d’un nucleosoma + la histona H1. 5. Els nucleosomes s’enrotllen per formar una fibra de 30nm. 6. Aquesta fibra forma llaços d’una mitjana de 300nm de longitud 7. Aquestes fibres es comprimeixen per donar lloc a una fibra de 250nm. 8. Finalment, es forma l’estructura (cromàtides) dels cromosomes. HISTONES Són les principals proteïnes, molt conservades evolutivament, constituents de la cromatina en els eucariotes. Són proteïnes petites i bàsiques, carregades positivament a pH fisiològic, que interaccionen electrostàticament amb els fosfats del DNA. Tenen alt contingut en Lys i Arg. Aquestes s’encarreguen d’estabilitzar l’estructura del DNA ajudant a compactar-lo. Segons la fase del cicle cel·lular pateixen modificacions químiques que alteren la càrrega elèctrica i regulen el grau de condensació del DNA i la transcripció (metilacions, acetilacions, fosforilacions, ADP-ribosilacions, glicosilacions, sumoïlació, ubiquitinació...). Hi ha 5 tipus principals d’histones: H1, H2A, H2B, H3, H4. (H3 i H4 estan molt conservades). Per formar el nucleosoma necessitem una histona H1 i dues histones H2, H3 i H4. 32 Tema 1: Anatomia del genoma NUCLEOSOMA Els nucleosomes són complexos formats per l’associació d’histones amb el DNA. Aquests estan formats per un nucli proteic (octàmer d’histones centrals format per 2 molècules dels tipus H2A, H2B, H3 i H4) sobre el qual s’enrotlla el DNA, i per la histona H1 (histona d’unió) que interacciona amb el DNA adjacent al nucleosoma, però que no forma part de l’octàmer (actua com a grapa subjectant l’estructura). ESTRUCTURA DEL GENOMA EUCARIOTA FIBRES DE 10nm Són les fibres que formen els nucleosomes (connectats entre si per fragments de DNA). Aquestes fibres (10 nm) proporcionen un empaquetament del DNA 6 vegades superior al de la doble hèlix. Hi ha 1 nucleosoma per cada aproximadament 200 pb. Podem distingir: o El DNA nucli (core), DNA (de 146-147 pb) superenrotllat negativament (dóna ≈1.7 voltes a l’octàmer d’histones); és un DNA de mida força constant en totes les espècies. o El DNA nexe (linker), DNA que connecta els nucleosomes, de longitud variable (20-60 pb). El DNA s’embolica al voltant de les histones formant un solenoide levogir (superenrotllament negatiu). FIBRES DE 30nm La fibra de 10 nm s’enrotlla sobre ella mateixa amb la intervenció de la histona H1. El grau d’empaquetament és d’unes 40-100 vegades respecte la doble hèlix. S’han proposat diversos models per explicar com s’associen els nucleosomes en la fibra de 30 nm: el model del solenoide i el model zig-zag. Les cues N-terminals de les histones de l’octàmer, les quals resten cap a l’exterior, són necessàries per a formació de la fibra de 30 nm. Aquestes cues poden ser modificades químicament, desestabilitzant la fibra de 30 nm i permetent la transcripció gènica. 33 Tema 1: Anatomia del genoma MODIFICACIÓ D’HISTONES PER ACETILACIÓ o Epigenètica: estudi del conjunt de canvis en el patró d’expressió gènica que poden ser hereditaris, però que no impliquen alteració en la seqüència del DNA. Permet entendre la diversitat morfològica i funcional de les cèl·lules que tenen el mateix genoma. o Factors epigenètics: modifiquen l’estructura de la cromatina sense alterar la seqüència de nucleòtids. Són modificacions químiques de les histones o de les bases del DNA. Les marques epigenètiques presenten estabilitat meiòtica: àvies fumadores transmeten als seus nets predisposició a l’asma bronquial. Tot el que van fer els pares i els avis (el que van menjar, l’entorn en que van créixer, l’aire que van respirar, les malalties que van patir...) poden afectar els fills i els nets. NIVELLS SUPERIORS DE COMPACTACIÓ DE LA CROMATINA Durant la interfase, les fibres de 30 nm semblen formar llaços o bucles (20-100 kpb) i superenrotllaments lligats a una matriu proteica no histona (esquelet nuclear o cromosòmic). Aquesta estructura compacta més el DNA i sembla que permet distribuir els gens en unitats transcripcionals. El DNA en les regions del cromosoma que s’estan replicant o transcrivint es presenta poc (fibra de 10 nm) o nul·lament (DNA nu) compactat. CROMOSOMA X HETEROCROMÀTIC EN MAMÍFERS En els mamífers, per igualar el nivell d'expressió dels gens del cromosoma X en els dos sexes, un dels dos cromosomes X femenins és inactiu: està totalment condensat en forma d’heterocromatina (facultativa). 34 Tema 1: Anatomia del genoma CROMOSOMA METAFÀSIC Durant la metafase, el DNA que ja s’ha replicat es condensa en heterocromatina adquirint l’aspecte típic dels cromosomes visibles al microscopi òptic. Cada cromosoma presenta dues estructures en forma de bastó (cromàtides). Cada cromàtide és una fibra de heterocromatina superenrotllada. El cromosoma: o Compacta el DNA o Estabilitza les molècules de DNA i les protegeix de l’entorn cel·lular o Permet la transferència segura a les cèl·lules filles de tota la informació codificada. o Organitza la informació continguda en el DNA, facilitant l’expressió gènica. CENTRÒMERS I TELÒMERS o Centròmer: Lloc d’unió del cromosoma a les fibres del fus mitòtic. Lloc d’unió de les cromàtides germanes. o Telòmers: Seqüències dels extrems dels cromosomes associades a proteïnes que participen en l’estabilitat i manteniment de la integritat estructural. Asseguren la replicació completa dels extrems dels cromosomes lineals. Entre ambdós es troben els gens, seqüències repetides disperses i múltiples orígens de replicació. GENOMA HUMÀ 1. Genoma nuclear humà diploide (cèl·lules somàtiques): § 46 cromosomes lineals (22 parells de cromosomes homòlegs més els cromosomes sexuals X i Y). 2. Genoma nuclear humà haploide (cèl·lules sexuals): § 3.2 · 109 pb distribuïts en 23 cromosomes lineals 3. Genoma mitocondrial humà: § 16.5 · 103 pb en una molècula circular. § 37 gens per molècula (13 proteïnes, 22 tRNA i 2 rRNA). § Moltes còpies per cèl·lula. 35 Tema 1: Anatomia del genoma MANTENIMENT ESTRUCTURAL DELS CROMOSOMES: PROTEÏNES SMC Les proteïnes SMC s’encarreguen del manteniment estructural dels cromosomes. Ajuden a la segregació mitòtica, l’adhesió de cromàtides germanes, la compensació de la dosi, la recombinació... Hi ha dos tipus: o Cohesines: Implicades en la unió de cromàtides germanes en la replicació i en el manteniment de la unió durant la compactació en la metafase (procés essencial per a la correcta segregació dels cromosomes en la divisió cel·lular). Formen una anell amb la kleisina (un component del complex de la cohesina), què es pot expandir o contraure per hidròlisi d’ATP. o Condensines: Essencials per a la condensació dels cromosomes durant la mitosi. GENOMA EXTRANUCLEAR EN MITOCONDRIS I CLOROPLASTS Lynn Margulis va elaborar la teoria endosimbiont, la qual explica que les modernes cèl·lules eucariotes descendeixen d’una cèl·lula anaeròbica primitiva que es va fusionar amb un bacteri aeròbic per simbiosi. La cèl·lula protegia el bacteri que, amb el pas del temps, va perdre la seva membrana i es va convertir en un mitocondri. Tanmateix, la cèl·lula va engolir un cianobacteri fotosintètic, a partir del qual es van desenvolupar els cloroplasts. 36 Tema 1: Anatomia del genoma COMPARACIÓ DEL GENOMA EUCARIOTA AMB EL D’E. COLI E. COLI EUCARIOTES Pràcticament la totalitat del DNA és El DNA té moltes seqüències repetides codificant i de còpia única. i la majoria d’aquestes repeticions no Els gens estan disposats de manera codifiquen cap producte gènic. contigua. Hi ha molt poc DNA no La majoria dels gens són de còpia codificant entre els gens. única. Els gens són continus, no estan Els gens estan separats uns dels altres fragmentats per llargues seqüències intergèniques de DNA no codificant. Els gens estan interromputs per llargs fragments de DNA no codificant (introns); no són continus. GENOMA PROCARIOTA: OPERONS Molts genomes procariotes estan agrupats en operons. Els operons són agrupacions de gens amb funcions relacionades, els quals es regulen i s'expressen conjuntament. Expressen un mRNA comú que donarà lloc a diferents proteïnes (policistrònic). Els gens que formen operons comparteixen el precursor i el gen regulador. Els eucariotes no presenten operons; els gens eucariotes són monocistrònics, és a dir, cada gen presenta el seu propi promotor i la seva pròpia regulació. Exemple: l’operó de la lactosa està format per 3 gens estructurals (z, y, a) i un gen regulador dels gens estructurals (i). TIPUS FUNCIONALS DE DNA EN ELS CROMOSOMES EUCARIOTES En el genoma eucariota sempre hi ha regions que no es transcriuen ni tradueixen, ja que són els punts indicadors per tal de saber on començar. Ara bé, tenim diversos tipus de DNA que sí son funcionals: o DNA codificant de proteïnes i RNAs: exons, introns, UTRs, pseudogens. o DNA intergènic: DNA repetitiu dispers (LINEs, SINEs, LTRs, transposons) i DNA repetitiu agrupat (satèl·lits, microsatèl·lits, minisatèl·lits). DNA REPETITIU DISPERS Es tracta de DNA dispers per tot el genoma, el qual segueix una distribució aparentment atzarosa (a l’atzar). 37 Tema 1: Anatomia del genoma DNA REPETITIU AGRUPAT Són repeticions d’unitats disposades en tàndem (seqüència de 2 o més bases de DNA que es repeteixen diverses vegades en forma de cadena en un cromosoma). TÀNDEM o DNA satèl·lit: repeticions d’unitats altament repetitives (centenars de milers de pb) agrupades en regions del genoma, com telòmers i centròmers. Són repeticions en tàndem d’unitats de 5-200 pb. o Minisatèl·lits: repeticions en tàndem d’unitats de fins a 25 pb que ocupen fins a 20 kb. o Microsatèl·lits: repeticions en tàndem d’unitats de fins a 13 pb que ocupen fins a 125 pb. Molts microsatèl·lits tenen gran polimorfisme entre individus d’una espècie i fins-i-tot entre els 2 cromosomes homòlegs d’un individu. El DNA minisatèl·lit i microsatèl·lit és molt polimòrfic: presenta molts canvis en el nombre de repeticions entre individus i fins-i-tot en la seqüència. S’utilitzen com a “empremtes” de DNA per proves forenses i de paternitat. CARACTERÍSTIQUES DELS GENS En els gens (eucariotes i procariotes) distingim: o Una seqüència estructural, que es transcriu i codifica per a RNAs o proteïnes. o Seqüències reguladores, que controlen la transcripció de les seqüències estructurals. Els gens eucariotes són gens fragmentats formats per: o Exons: són les seqüències codificants del gen (50-200 pb) que es troben en el RNAm madur. DNA codificant. o Introns: seqüències no codificants del gen de mida variable (0,5-5 Kb) que no es troben en el RNAm madur. DNA no codificant. GENOMA: DNA CODIFICANT El DNA està format per dues cadenes que s’aparellen per complementarietat de bases. Aquestes són antiparal·leles, de manera que una anirà en sentit 5’ à 3’ i l’altra anirà en sentit contrari (3’ à 5’). o Cadena codificant: anirà en sentit 5’ à 3’ o Cadena no codificant: és la cadena motlle (template) de la transcripció. Anirà en sentit 3’ à 5’ La cadena codificant del gen té la mateixa seqüència que l’RNA producte de la transcripció, però canviant l’uracil per timina. Es numera la cadena codificant del gen a partir de l’extrem 5’, i el nucleòtid 1 del gen és el primer nucleòtid que es transcriu. 38 Tema 1: Anatomia del genoma En la majoria dels gens eucariotes la seqüència de nucleòtids del DNA no és col·lineal amb la de l’RNA madur ni amb la dels aminoàcids (existeixen seqüències transcrites però no traduïdes, els introns). GENOMA EUCARIOTA Els gens eucariotes són seqüències que codifiquen per un producte gènic: tots els tipus de RNAs i de proteïnes de l’organisme. Tenen un locus (lloc) determinat en els cromosomes. En el genoma haploide trobem: o Gens de còpia única: no repetits. Codifiquen per la majoria de les proteïnes. o Gens moderadament repetits (famílies gèniques clàssiques): codifiquen per RNAs (tRNA, rRNA) i algunes proteïnes (histones). o Els gens d’alguns RNAs (rRNA, tRNA) i d’algunes proteïnes (histones) estan agrupats en unitats de repetició (~5,8 Kb), disposades en tàndem. o Tots els gens són funcionals. S’expressen totes les repeticions amb mRNA independents. o Codifiquen productes que es necessiten en molta quantitat i que s’han de sintetitzar ràpidament en un determinat moment del cicle cel·lular. o Famílies multigèniques: Conjunt de gens relacionats evolutiva i funcionalment. o Codifiquen per proteïnes amb funcions relacionades i es disposen agrupats freqüentment en la mateixa regió del cromosoma (cluster). Exemple: hemoglobina. Essent gens funcionals, no s’expressen tots alhora sinó alternativament en diferents estadis del desenvolupament. o Un pseudogèn és un gen mutat que ha perdut la capacitat de codificar una proteïna funcional. La presència de pseudogens en les famílies multigèniques és el resultat de com s’han originat, a partir d’un gen ancestral per processos de duplicació-mutació- selecció. PSEUDOGENS PROCESSATS Es tracta de còpies de DNA a partir d’RNAs madurs, sintetitzades per transcripció inversa (transcriptasa inversa), les quals s’han integrat en el genoma. Són gens silenciosos que no es poden expressar perquè no tenen regions promotores funcionals (regió de control de l’expressió). 39 Tema 1: Anatomia del genoma TRANSCRIPTASA INVERSA És una polimerasa de DNA que utilitza RNA com a motlle. La transcriptasa inversa està present en: o Retrovirus: són virus que tenen RNA com a material genètic. Només es poden integrar en el genoma eucariota injectant el RNA dins la cèl·lula hoste que, mitjançant l’acció de la transcriptasa inversa, podrà esdevenir DNA viral. Aquest sí podrà integrar-se en el genoma eucariota. o Retrotransposons LTR: el genoma de RNA dels retrovirus acaba en repeticions directes i el procés de retrotranscripció els converteix en repeticions terminals llargues (LTR). Aquestes LTR funcionen com un transposó (seqüències de DNA que només porten informació genètica per poder moure’s dintre dels genomes dels essers vius) en convertir l’RNA en DNA mitjançant la transcriptasa inversa. Aleshores, s’insereixen en el genoma de l’hoste. o Telomerasa: molècula que té la capacitat de revertir l’escurçament dels telòmers (extrems dels cromosomes). Cada vegada que una cèl·lula es multiplica, els telòmers perden una quantitat petita de DNA i s’escurcen. Amb el pas del temps, els cromosomes es danyen i les cèl·lules moren, de manera que aquest enzim ajuda a prolongar la vida i combatre malalties. CONCEPTES BÀSICS DE GÈNETICA o Cromosomes homòlegs (vs. cromosomes heteròlegs): cromosomes morfològicament idèntics i que contenen els mateixos gens. o Cromosomes autosòmics (vs. cromosomes sexuals): cromosomes no implicats en la determinació del sexe. o Un locus genètic és la posició definida que ocupa un gen (o una seqüència no codificant) en un cromosoma. o Un al·lel és una de les variants gèniques que pot presentar la seqüència d’un gen en la població. o Polimorfisme gènic = existència en un locus de dos o més al·lels alternatius per a un determinat gen. o Genotip: constitució genètica d’un organisme. Conjunt d’al·lels presents en tots els cromosomes d’un individu o espècie. o Genotip per a un determinat locus d’un gen: parell d’al·lels presents en aquell locus en cromosomes homòlegs. o Fenotip: manifestació externa del genotip. Conjunt de caràcters observables (morfològics, bioquímics, moleculars) resultat de l’expressió del genotip i de la interacció de l’organisme amb el medi extern. o Fenotip per a un determinat caràcter: caràcter observable resultat de l’expressió d’un parell d’al·lels i de la interacció de l’organisme amb els factors ambientals. 40 Tema 1: Anatomia del genoma o Un homozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels idèntics en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs. o Un heterozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels diferents en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs. o Al·lel dominant: la seva presència es manifesta sempre en el fenotip. o Al·lel recessiu: es manifesta únicament en homozigosi. o Dominància: fenotip que es manifesta sempre en l’heterozigot. El fenotip no permet distingir entre l’homozigot i l’heterozigot. o Dominància incompleta (semi dominància): el fenotip de l’heterozigot és intermedi al dels respectius homozigots. o Codominància: el fenotip de l’heterozigot expressa simultàniament els dos fenotips dels respectius homozigots. POLIMORFISME GÈNIC o La variabilitat genètica és comú en la població, és estable i heretable. o Un locus (lloc) és polimòrfic quan la variabilitat afecta a més de l’1% de la població. o Les ¾ parts del genoma són monomòrfics: gens únics sense variabilitat entre individus, que defineixen l’espècie i les seves característiques morfològiques. La resta, ¼ part, són polimòrfics. o El polimorfisme pot tenir o no efectes fenotípics. El polimorfisme amb efecte fenotípic pot ser: o polimorfisme fisiològic: alçada, color dels ulls, grup sanguini. o polimorfisme de susceptibilitat a malalties: càncer, Alzheimer, malalties metabòliques,.... o polimorfisme de predisposició a patir addiccions o dependències: a fàrmacs, drogues, alcohol, tabac... 41 Tema 2: Genoma procariota TEMA 2: GENOMA PROCARIOTA REPLICACIÓ DEL DNA És la duplicació completa del genoma. La replicació del DNA és semiconservativa: o Cada cadena del DNA parental serveix de motlle per a la síntesi d’una nova cadena complementària. o En la divisió cel·lular, cada cèl·lula filla rep molècules de DNA formades per la cadena nova acabada de sintetitzar i la cadena motlle parental. EXPERIMENT DE MESELSON-STAHL Meselson i Stahl van fer créixer bacteris (E.coli) en un medi amb nitrogen pesat (N15). El N15 és un isòtop del nitrogen habitual (N14), el qual és més pesat a causa del neutró que té de més. Aquest isòtop es va incorporar a les cadenes de DNA que es sintetitzaven, fent-les més pesades. Posteriorment, van passar els bacteris a un medi amb N14 (més lleuger) on van continuar amb el seu creixement. Com que les molècules de DNA sintetitzades amb N15 pesaven més que les de N14, aquestes podien separar-se mitjançant un procés de centrifugació. o En la primera generació de bacteris, es va obtenir una única banda de DNA amb densitat intermèdia. o En la segona generació van obtenir-se dues bandes, una amb densitat lleugera i l’altra amb densitat intermèdia. La banda intermèdia representa una molècula de DNA que conté una cadena pesada i una altra lleugera. En canvi, les bandes lleugeres representen una molècula de DNA en què les dues cadenes han estat sintetitzades (encara no existien quan les cèl·lules es van posar en presència de N15). El fet que cada vegada i hagués més molècules lleugeres i es mantingués el nombre de molècules intermèdies va demostrar que la replicació del DNA és semiconservativa. 42 Tema 2: Genoma procariota DNA POLIMERASES Les DNA polimerases necessiten: o Els 4 desoxirribonucleòsids trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) i Mg2+ com a cofactor. o Un petit fragment d’RNA (in vivo) amb un grup hidroxil-3’ lliure que actua d’encebador (primer). Els encebadors serveixen com a punt d’inici per la replicació del DNA, i són necessaris perquè les DNA polimerases no poden iniciar la síntesi incorporant el primer nucleòtid (necessiten una cadena ja existent de DNA). o Una cadena senzilla de DNA que actua de motlle. Les DNA polimerases llegeixen la seqüència de la cadena motlle en la direcció de 3’ a 5’ i catalitzen l’elongació de la nova cadena en la direcció de 5’ a 3’. MECANISME CATALÍTIC DE LES DNA POLIMERASES Les DNA polimerases catalitzen l’atac nucleofílic d’un hidroxil 3’ lliure sobre el fosfat més intern del dNTP (fosfat α), el qual s’addicionarà formant un enllaç fosfodièster sempre que el nucleòtid a incorporar sigui complementari al del motlle. Tanmateix, necessiten l’ió Mg2+ per estabilitzar els intermediaris de la reacció. CARACTERÍSTIQUES DE LES DNA POLIMERASES o Processivitat: nombre de nucleòtids que addicionen sense desenganxar- se del motlle. o Velocitat: nombre de nucleòtids incorporats per segon. o Fidelitat: capacitat d’elongar la cadena sense cometre errors de complementarietat. o La geometria en l’aparellament de les bases contribueix a la fidelitat de la replicació del DNA, ja que únicament els aparellaments correctes tenen cabuda al centre actiu de la DNA polimerasa. o El centre actiu de les DNA polimerases no catalitza eficaçment l’addició de ribonucleòtids per incorrecte alineament entre el fosfat a del ribonucleòtid i l’extrem 3’-OH de la cadena a elongar. 43 Tema 2: Genoma procariota REPLICACIÓ DEL DNA EN PROCARIOTES L’objectiu de la replicació és que en la divisió cel·lular cada cèl·lula filla rebi una còpia completa del genoma. L’inici de la replicació ha d’estar controlat amb precisió; en el procés té un important paper la metilació del DNA. El temps de replicació del cromosoma d’ E. coli és constant (uns 40 minuts). En procariotes, no hi ha cap interval de temps entre el final de la replicació i el començament de la divisió (la divisió es produeix quan ja s’ha iniciat un nou cicle de replicació). PRINCIPALS TIPUS DE POLIMERASES EN PROCARIOTES Funció de síntesi à elevada velocitat Funció reparadora à baixa velocitat Reparació forats à baixa processivitat Reparació lesions importants à processivitat moderada Síntesi total del DNA àalta processivitat DNA POLIMERASA I (E. COLI) La DNA polimerasa I és monomèrica, presenta una baixa velocitat de polimerització (16-20 nucleòtids/segon) i té tres dominis amb diferents activitats enzimàtiques: EXONUCLEASA DE 3’ A 5’: o Trenca enllaços fosfodièster a partir d’extrems 3’-hidroxil lliures quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari al motlle. o És una activitat correctora d’errors lligada a la replicació: corregeix immediatament els errors de l’activitat polimerasa. o In vitro, la DNA polimerasa I d’E. coli comet 1 error cada 104-105 nucleòtids incorporats. L’activitat exonucleasa 3’ a 5’ (correctora d’errors) redueix els errors a 1 cada 107 nucleòtids incorporats. La tasa de mutació observada és 1 cada 1010 nucleòtids incorporats, gràcies als sistemes de reparació del DNA post replicació. EXONUCLEASA DE 5’ A 3’: o Trenca enllaços fosfodièster a partir d’extrems 5’-fosfat lliures. o Pot eliminar un únic nucleòtid o fragments de 5 o 6 nucleòtids. o Elimina els encebadors d’RNA utilitzats en la replicació. També corregeix lesions en el DNA. 44 Tema 2: Genoma procariota DNA POLIMERASA II (E. COLI) És el principal enzim responsable de la síntesi del DNA en la replicació. És molt ràpid i poc abundant (250- 1000 nucleòtids/segon). Es tracta d’un complex multienzimàtic gran, el qual està constituït per 10 subunitats diferents que formen una estructura complexa. Té 3 dominis bàsics formats per 3 subunitats αεθ unides a través d’un complex de càrrega (“camp- loader”t2gdd’) de l’abraçadora de múltiples subunitats (holoenzim DNA Pol III). Aquesta estructura acobla unes abraçadores o grapes formades per dues subunitats β (en color lila), les quals formen una pinça lliscant per evitar la dissociació. Aquestes es troben en contacte amb el nucli (color groc) i envolten la doble hèlix. La complexitat de l’enzim facilita que repliqui les dues cadenes del DNA al mateix temps i en la mateixa direcció. L’associació de les abraçadores β amb la DNA polimerasa III és responsable de l’elevada processivitat d’aquest enzim durant la replicació. La processivitat de l'ADN Pol III és > 500.000 pb a causa de les pinces b. El complex interacciona també amb la DNA helicasa (enzim que actua en la separació de les cadenes de DNA). SUBUNITATS DE LA DNA POLIMERASA II o Les subunitats α i ε unides per la subunitat θ formen el nucli de l’enzim (amb activitat polimerasa, però amb baixa processivitat). Té activitat catalítica en diferents subunitats: o Activitat polimerasa de 5’ a 3’, responsable de l’elongació de les noves cadenes (subunitats α). o Activitat exonucleasa de 3’ a 5’, correctora de proves en el moment de la replicació (subunitats ε). o El complex g (també denominat complex de càrrega de l’abraçadora) està format per 5 subunitats: γ,d,d’ i el domini amino-terminal de cada subunitat t. La seva activitat és la responsable de carregar les abraçadores β a les cadenes de DNA. El complex s’uneix a tres molècules d’ATP i a una pinça β dimèrica, i aquesta unió obliga a obrir la pinça β en una de les seves dues interfícies de subunitats (la hidròlisi de l’ATP unit permet que la pinça β es torni a tancar al voltant de l’ADN). ORIGEN DE LA REPLICACIÓ EN E. COLI E. coli té un únic origen de replicació (oriC) en el seu cromosoma, a partir del qual les dues cadenes del DNA es copien simultàniament. Per tant, el genoma d’E. coli és un replicó (DNA que es replica a partir d’un únic origen de replicació). 45 Tema 2: Genoma procariota L’oriC consta de 245 pb amb: o 3 seqüències (de 13 pb) pràcticament idèntiques, ordenades en tàndem, molt riques en A i T: element de separació del DNA (DUE). o 5 seqüències repetides (de 9 pb) orientades en diferent sentit, les quals són el punt d’unió de la proteïna DnaA (iniciadora de la replicació). o Regió rica en seqüències GATC (dianes de metilació). PROTEÏNES QUE INICIEN LA REPLICACIÓ EN L’ORIC D’E.COLI o DnaA: reconeix seqüències ori i obre el dúplex en un lloc específic de l’origen. Dit d’una altra manera, és la proteïna iniciadora. Aquesta es troba inactiva quan està unida a ADP i activa quan està unida a ATP. o DnaB (helicasa): trenca els ponts d’hidrogen entre bases complementàries per tal d’obrir i separar les cadenes. o DnaC: no té paper catalític, sinó que es necessita perquè es dugui a terme la unió de la DnaB en lloc d’origen. o HU (proteïna similar a les histones), FIS i IHF: s’uneixen al DNA i simulen la iniciació. o DnaG (primasa): es tracta d’una RNA polimerasa, la qual sintetitza el primer o iniciador de RNA. o SSB: s’uneix a DNA monocatenari i evita que les dues cadenes es tornin a ajuntar després de separar-les. o DNA topoisomerasa II: elimina la tenisó generada pel desenrotllament del DNA o Dam metilasa: metilen seqüències (5’)GATC de l’oriC. METILACIÓ DE L’ORIC La metilació de l’oriC controla la replicació en E. Coli. Ambdues cadenes del dúplex han d’estar metilades per ser replicades. La proteïna SeqA manté el DNA hemimetilat després d’un cicle de replicació, i la seva separació permet la metilació per la Dam metilasa i l’inici de la replicació (entrada de DnaA). 46 Tema 2: Genoma procariota MODEL D’INICIACIÓ EN E.COLI 1. Metilació d’oriC: La replicació comença amb la metilació de les adenines de les seqüències GATC de l’oriC per l’enzim la Dam metilasa. 2. Separació de les cadenes de la doble hèlix en l’oriC: o La metilació d’oriC provoca la unió de la proteïna DnaA a les 5 repeticions de 9 pb i a tres llocs addicionals, formant un complex inicial helicoidal dextrògir. o Es forma un complex obert d’iniciació per desnaturalització seqüencial de les repeticions de 13 pb (DUE). La reacció requereix ATP, la proteïna bacteriana tipus histona (HU), IHF i FIS. o Participen també hexàmers de la proteïna DnaB, helicasa que s’uneix a cadascuna de les cadenes i les separa (s’hidrolitzen els ponts d’hidrogen) utilitzant ATP i una proteïna adaptadora, DnaC. o La proteïna de fixació al DNA de cadena senzilla, SSB (“single-stranded DNA-binding protein”) ajuda a mantenir les cadenes separades durant la replicació. FORQUETES DE REPLICACIÓ EN E. COLI La replicació és bidireccional a partir del complex obert en l’oriC. Allà es formen dues forquetes de replicació que avancen en sentit contrari recorrent tot el genoma. 47 Tema 2: Genoma procariota SÍNTESI DELS ENCEBADORS: PRIMASA La primasa (DnaG) és una RNA polimerasa que inicia la replicació del DNA en catalitzar la síntesi dels encebadors (fragments d’RNA de 10-60 nucleòtids). Els seus substrats són els ribonucleòsids trifosfat: ATP, GTP, CTP i UTP. Necessita Mg2+. Seguint el motlle, polimeritza de 5’ a 3’ un fragment d’RNA deixant un extrem 3’-OH lliure. No té activitat correctora d’errors i la unió de l’encebador d’RNA a la cadena motlle forma una estructura que és reconeguda per la DNA polimerasa III, facilitant la ràpida elongació de l’encebador. ELONGACIÓ DE LES CADENES EN E. COLI La DNA polimerasa III (“dímer” asimètric) sintetitza les dues cadenes elongant els encebadors. Cadascuna de les dues parts de l’enzim s’uneix a una de les cadenes motlle (parentals) i sintetitza la nova cadena complementària. Seguidament, llegeix els motlles a mesura que es desplaça en la direcció de 3’ a 5’ i replica les dues cadenes del DNA simultàniament i en la mateixa direcció de 5’ a 3’: o Una de les cadenes la sintetitza de forma contínua a partir d’un únic encebador; és la cadena guia o conductora (leading strand). o L’altra cadena la sintetitza de forma discontínua, en fragments curts (≈1000-2000 nucleòtids en els procariotes), fragments d’Okazaki, a partir de tants encebadors com fragments; és la cadena retardada (lagging strand). SÍNTESI DELS FRAGMENTS D’OKAZAKI Els fragments d’Okazaki són seqüències curtes de nucleòtids de DNA que es sintetitzen de manera discontínua i, posteriorment, s’uneixen entre sí gràcies a l’enzim DNA lligasa per crear la cadena retardada durant la replicació del DNA. Durant el procés de replicació, la doble hèlix del DNA es desenrotlla i les cadenes complementàries es separen per l’acció de la DNA helicasa, creant el que es coneix com a forquetes de replicació. Després d’aquesta separació, la DNA primasa (DnaG) i la DNA polimerasa comencen a actuar per tal de crear una nova cadena complementària. Ara bé, com que aquests enzims només poden funcionar en la direcció 5’à3’, les dues cadenes motlle es repliquen de diferents maneres: 48 Tema 2: Genoma procariota o En la cadena avançada hi ha un procés de replicació continu, ja que la seva cadena motlle té una direccionalitat de 3’à5’, permetent que la polimerasa que sintetitza la nova cadena segueixi la forquilla de replicació sense interrupció. o La cadena retardada, en canvi, no pot crear-se de manera continua perquè la seva cadena motlle té una direccionalitat de 5’à3’, de manera que la polimerasa hauria de treballar de manera inversa des de la forquilla de replicació. Això provoca trencaments periòdics en la cadena retardada. La primasa i la DNA polimerasa es mouen en direcció oposada a la forquilla, de manera que els enzims s’han d’aturar repetidament i tornar a començar. Un cop fets els fragments, els primers són eliminats i els fragments d’Okazaki s’uneixen en una única cadena contínua gràcies a la DNA lligasa (enllaça covalentment extrems 3’-OH lliures amb extrems 5’ fosfat formant enllaços fosfodièster en cadenes de dúplex de DNA. La reacció utilitza: el coenzim NAD+ en E. Coli i l’energia d’hidròlisi de l’ATP en eucariotes i alguns virus). FORQUETA DE REPLICACIÓ EN E. COLI Cada forqueta de replicació avança amb la intervenció de diverses proteïnes: o Una helicasa (DnaB en E. coli) separa les cadenes lliscant sobre la cadena retardada en direcció 5’ a 3’ (procés dependent d’ATP). o La proteïna d’unió a DNA de cadena senzilla (SSB): evita la renaturalització de les cadenes. o La primasa: sintetitza els encebadors. o La DNA polimerasa III: elonga les cadenes. o La DNA polimerasa I: elimina els encebadors (activitat exonucleasa de 5’ a 3’) i omple els forats. o La topoisomerasa II: elimina superenrotllament generat davant de la forqueta per la separació de les cadenes per part de l’helicasa. Si no s’eliminés el superenrotllament la forqueta s’aturaria. o La DNA lligasa: uneix tots els fragments de la cadena retardada. En E.coli participen més de 20 proteïnes diferents en la replicació. El conjunt de totes les proteïnes implicades en la replicació és el replisoma. La DNA polimerasa forma un llaç (model del trombó) en la cadena retardada que li permet llegir el motlle en la direcció correcta (de 3’ a 5’) i sintetitzar fragments curts en la direcció de 5’ a 3’. 49 Tema 2: Genoma procariota TERMINACIÓ DE LA REPLICACIÓ EN E. COLI La replicació acaba on es troben les dues forquetes de replicació, a l’extrem oposat a l’oriC, denominat Ter (terminal). Ter conté múltiples còpies d’una seqüència de 20 pb que es troben disposades en el cromosoma en dos grups amb orientació oposada. Són punts d’unió de la proteïna Tus. Aquestes seqüències Ter actuen com a trampes que atrapen (i aturen) les forquetes de replicació quan es forma el complex Tus-Ter. Només actua un complex Tus-Ter per replicació, el qual atura una forqueta de replicació. L’altra forqueta s’atura quan es topa amb la forqueta oposada (ja aturada). Controlen l’arribada coordinada de les dues forquetes i eviten la sobrerreplicació. La replicació genera cromosomes encadenats que han de ser separats per una topoisomerasa de tipus II (topoisomerasa IV), la qual trenca les dues cadenes d’un dels cromosomes i les separa. GENOMA EUCARIOTA ORIGENS DE REPLICACIÓ EN EUCARIOTES Els cromosomes eucariotes tenen molts orígens de replicació (replicons), fet que facilita i accelera la replicació de molècules de DNA de gran longitud. És una replicació bidireccional. SIMILITUDS I DIFERÈNCIES ENTRE LA REPLICACIÓ EN EUCARIOTES I LA REPLICACIÓ EN E.COLI Similituds Diferències La replicació en el genoma o La replicació la duen a terme dues DNA nuclear dels eucariotes, encara polimerases que treballen que és més complex, segueix sincrònicament en la forqueta de els mateixos principis que en replicació. procariotes: o El genoma nuclear eucariota té múltiples o És semiconservativa i cromosomes a replicar, de gran longitud bidireccional a partir dels i lineals. orígens de replicació. o Els cromosomes nuclears d’eucariotes o Les DNA polimerases tenen múltiples orígens de replicació sintetitzen simultàniament (distanciats entre 30 i 300 Kb). les dues cadenes del DNA o En eucariotes hi ha un interval de temps de 5’ a 3’. (fase G2 del cicle cel·lular) entre el final o Es necessiten encebadors de la replicació (fase S) i el d’RNA. començament de la mitosi. o La síntesi d’una cadena és contínua i la de l’altra és discontínua, en fragments d’Okazaki (100-400 nucleòtids) que després són 50 Tema 2: Genoma procariota lligats (replicació semidiscontínua). o Quan s’inicia la síntesi d’un replicó (fragment de DNA que se sintetitza a partir d’un mateix origen de replicació) continua fins al final, no s’atura (replicació seqüencial). DNA POLIMERASES D’EUCARIOTES ESSENCIALS PER A LA REPLICACIÓ DEL GENOMA Les polimerases de DNA d’eucariotes no tenen activitat exonucleasa 5’ a 3’. Les exonucleases que eliminen els encebadors d’RNA són enzims independents. o El complex DNA Pol α/primasa inicia noves cadenes. Està format per dues subunitats DNA pol α i dues subunitats primasa. L’activitat primasa sintetitza l’encebador d’RNA i a continuació l’activitat DNA Pol α comença a polimeritzar DNA. Té baixa processivitat, raó per la qual és ràpidament reemplaçat per polimerases amb més elevada processivitat, com la DNA Pol δ o la DNA Pol ε (procés denominant canvi de polimerases). o DNA Pol δ: sintetitza la cadena retardada. o DNA Pol: sintetitza la cadena guia. o DNA Pol g: és la única DNA polimerasa no localitzada en el nucli cel·lular. Està en el mitocondri, on replica i repara el DNA mitocondrial. La resta de polimerases estan implicades fonamentalment en la reparació del DNA nuclear. CANVI DE POLIMERASES DURANT LA REPLICACIÓ DEL GENOMA EN EUCARIOTES La processivitat de les DNA Pol δ o ε es veu incrementada per l’associació amb proteïnes que formen una pinça que llisca sobre el DNA (sliding clamp). 51 Tema 2: Genoma procariota COMPLEX PRERREPLICATIU (PRE-RC) EN EUCARIOTES La replicació en els eucariotes està regulada i coordinada amb el cicle cel·lular. Els complexos prerreplicatius (pre-RC) es formen en els inicis de replicació (replicons). Formació del complex pre-RC: un complex de 6 proteïnes diferents homòlogues a DnaA (ORC, complex de reconeixement de l’origen) s’uneix al replicó i recluta altres proteïnes (Cdt1 i Cdc6), permetent que una helicasa replicativa hexamèrica (MCM2-7, proteïnes de manteniment del minicromosoma) formi un anell i funcioni de manera similar a la helicasa DnaB en E. coli. FORQUETA DE REPLICACIÓ EN EUCARIOTES En la fase S del cicle cel·lular, les cinases Ddk i Cdk fosforilen Cdc6 i Cdt1, les quals se separen del complex pre-RC, permetent la seva activació. Aquest control assegura que el genoma eucariota es repliqui només un cop en cada cicle cel·lular. Al complex pre-RC activat s’hi uneixen altres proteïnes com ara les DNA Pol δ, ε i α/primasa. 1. Un cop la DNA Pol α/primasa inicia la replicació, el fragment que ha sintetitzat és reconegut per la proteïna carregadora de l’abraçadora (RF-C), que permet la unió d’una abraçadora PCNA (antigen nuclear de cèl·lules en proliferació), similar a l’abraçadora β de la DNA Pol III d’E. coli. 2. La DNA Pol ε comença a sintetitzar la cadena guia. 3. La desnaturalització de la doble hèlix permet a la DNA Pol α/primasa sintetitzar encebadors addicionals, permetent la síntesi de fragment d’Okazaki en la cadena retardada per la DNA Pol δ. 52 Tema 2: Genoma procariota SÍNDROMES GENERATS PER LA DEFICIÈNCIA EN LES ACTIVITATS HELICASA I LLIGASA DE DNA EN HUMANS La síndrome de Werner, desencadenat per dèficit de l’activitat helicasa, es caracteritza per un envelliment prematur. Fins a l’adolescència el desenvolupament és normal, però a partir de l’adolescència s’envelleix ràpidament. La deficiència genètica en la lligasa de DNA (autosòmica recessiva) es relaciona amb greus síndromes: immunodeficiències, sensibilitat a radiacions, anomalies en el desenvolupament... MANTENIMENT DELS EXTREMS DE MOLÈCULES LINEALS DE DNA En cada cicle de replicació, els extrems d’una molècula de DNA lineal es poden anar escurçant perquè l’extrem 3’ de la cadena retardada no es pot copiar perquè: 1. Es troba a menys de 200 pb de l’últim fragment Okazaki (no hi ha espai per a un nou complex d’inici de fragment Okazaki). 2. Tot i que hi hagi espai per posicionar l’últim fragment Okazaki, el seu encebador d’RNA no pot ser convertit a DNA (es requeriria un nou fragment Okazaki començant des de l’exterior de la cadena de DNA). Alguns virus i bacteris amb cromosoma lineal poden solucionar el problema gràcies a l’ús de proteïnes que interaccionen amb la DNA polimerasa i l’estabilitzen en l’extrem 3’ del DNA motlle, sense necessitar encebador d’RNA per la síntesi de l’últim fragment Okazaki. Els eucariotes tenen seqüències telomèriques (predominantment DNA satèl·lit composat per centenars de còpies de DNA repetitiu en tàndem) situades als extrems del cromosomes, les quals poden ser esteses mitjançant un mecanisme independent amb participació de l’enzim telomerasa. SEQÜÈNCIES TELOMÈRIQUES EN EUCARIOTES Els telòmers són seqüències de DNA no codificants especialitzades i associades a proteïnes. Estan en els extrems dels cromosomes lineals, on els protegeixen (en cada cicle de replicació no es copien entre 50-200 pb dels extrems 3’ de les cadenes parentals). Els telòmers són seqüències de DNA repetitiu: o Múltiples repeticions (150-2000) en tàndem d’un oligonucleòtid curt (4-12 nucleòtids). o L’extrem 3’ sobresurt 12-16 nucleòtids respecte l’extrem 5’ de la cadena complementària. 53 Tema 2: Genoma procariota Els telòmers són heterocromatina, mai es transcriuen! En mamífers, l’extrem 3’ dels telòmers està protegit per una estructura en forma de llaç (llaç T). Aquesta estructura segresta i protegeix l’extrem 3’ de l’acció de les nucleases. Per a la formació dels llaç T participen diverses proteïnes TBP (Telomere Binding Protein). Mutacions en el gen POT1, que codifica una proteïna fixadora de la caputxa proteica protectora dels telòmers, està relacionada amb leucèmia linfocítica crònica. TELOMERASA Els telòmers s’escurcen en la replicació, però són regenerats per la telomerasa, que és una ribonucleoproteïna (enzim associat a RNA): o El component proteic és una transcriptasa inversa (polimerasa que sintetitza DNA a partir d’RNA). o El fragment d’RNA associat és de mida variable segons l’espècie i té una seqüència complementària a la seqüència telomèrica. L’escurçament dels telòmers és un rellotge biològic que mesura l’envelliment. En la majoria de les cèl·lules somàtiques dels teixits adults no hi ha activitat telomerasa, però sí que està present en totes les cèl·lules d’elevada proliferació. La telomerasa és una diana terapèutica en la lluita contra el càncer. El comportament de les cèl·lules mare ve determinat pels seus telòmers i per l’activitat telomerasa que contenen. Si una cèl·lula mare presenta massa telomerases es sintetitzaran massa cèl·lules, fet que ens podria induir un càncer. Per tal de mantenir una quantitat adequada de telomerases existeixen fàrmacs inhibidors d’aquestes com ara el imetelstat (fàrmac en estudi preclínic pel tractament de càncers hematològics). MUTACIONS MUTACIONS Una mutació és una alteració permanent en la seqüència del DNA. o En els procariotes, les mutacions afecten directament a la descendència. o En els eucariotes, les mutacions poden afectar: o Les cèl·lules germinals: mutacions hereditàries, poc freqüents. o Les cèl·lules somàtiques: mutacions més freqüents i transmissibles a les cèl·lules filles (mitosi), però no a la descendència. Conjuntament amb la recombinació meiòtica, les mutacions són la principal font de variabilitat genètica dels organismes. Principals causes de les mutacions: o Errors en la replicació. o Alteració espontània de nucleòtids. o Alteració de nucleòtids per l’acció de mutàgens (agents físics o químics). 54 Tema 2: Genoma procariota o Classificació de les mutacions segons la magnitud del canvi: o Mutuacions puntuals (un o pocs nucleòtids). o Reorganitzacions cromosòmiques (fragments de cromosomes). o Aneuploïdies (canvi en el número de cromosomes). MUTACIONS PUNTUALS Mutacions que afecten un únic o pocs nucleòtids. Trobem: o Substitució d’un o pocs nucleòtids per uns altres. Són les mutacions a petita escala més freqüents i poden ser: o Transicions: canvis de purines per purines, o bé, de pirimidines per pirimidines. o Transversions: canvis de purines per pirimidines, o bé, de pirimidines per purines. o Deleció: pèrdua d’un o més nucleòtids d’un segment de DNA. o Inserció d’un o pocs nucleòtids. TIPUS DE MUTACIONS PUNTUALS SEGONS ELS EFECTES o Mutacions silencioses: no produeixen cap canvi fenotípic. o Mutació silenciosa: afecta a la 3a base d’un codó; si el triplet mutat codifica el mateix aminoàcid (mutacions amb sentit correcte). o Mutació conservativa: provoca canvis d’aminoàcids equivalents sense afectar la proteïna. o Mutacions en zones no codificants: no s’expressen. o Mutacions no silencioses: produeixen canvi fenotípic. o Mutacions beneficioses que canvien el fenotip positivament per a l’espècie i són seleccionades des del punt de vista evolutiu. o Mutacions perjudicials que canvien el fenotip negativament. o Mutacions per substitució en la 1a o 2a base del codó: § Donen proteïnes alterades amb un aminoàcid diferent, no equivalent (mutacions de sentit erroni). § Provoquen un codó d’aturada on hi havia codificat un aminoàcid formant proteïnes truncades (mutacions sense sentit). o Mutacions que canvien el marc de lectura del gen, alterant gran part de la seqüència de la proteïna. Són produïdes per inserció o deleció d’un o més nucleòtids, sempre que no siguin múltiple de 3 (el nombre de bases d’un codó). 55 Tema 2: Genoma procariota EFECTE DE LES MUTACIONS EN ORGANISMES DIPLOIDES o Sense efecte o Pèrdua de funció: Usualment són recessives perquè la còpia no mutada del segon cromosoma té un efecte compensador. Freqüentment, l’organisme tolera bé tenir només el 50% de l’activitat proteica, tot i que en alguns casos és un efecte dominant. o Guany de funció: Menys freqüents. Acostumen a ser conseqüència de mutacions en zones reguladores de l’expressió del gen. EXEMPLES DE MALALTIES MOLECULARS CAUSADES PER MUTACIONS MUTACIONS RELACIONADES AMB EL CÀNCER Són causa de càncer l’acumulació de mutacions que afecten a: o Protooncogens = gens que estimulen la proliferació. Per mutació es transformen en oncogens (causen proliferació aberrant). Hi ha guany de funció. Exemples: factors de creixement, receptors de factors de creixement i d’hormones, proteïnes de transducció de senyals, factors de transcripció, etc. o Gens supressors de tumors (oncosupressors) = gens que inhibeixen el creixement cel·lular. Hi ha pèrdua de funció. Exemples: factors inhibidors del creixement i els seus receptors, proteïnes de transducció de senyals, factors de transcripció, etc o Gens implicats en la reparació del DNA. Hi ha pèrdua de funció, generant inestabilitat genètica (“fenotip mutador”). Danys en el DNA poden inhibir el creixement de les cèl·lules canceroses. El cisplatí és un fàrmac utilitzat com a agent antitumoral, ja que desorganitza l’estructura del DNA impedint la replicació i la transcripció, i indueix l’apoptosi. PRINCIPAL TIPUS DE MUTACIONS SEGONS LES CAUSES o Mutacions associades a errors en la replicació no corregides per les activitats correctores d’errors: o Substitucions per una base no complementària (generalment un tautòmer menys estable). Poc freqüents. o Delecions o insercions per la presència de seqüències curtes amb repeticions directes o invertides no llegides correctament per la polimerasa en la cadena motlle. 56 Tema 2: Genoma procariota o Mutacions no associades a la replicació causades per: o Desaminació de bases o Pèrdua de bases per hidròlisi de l’enllaç N-glicosídic o Alquilació de bases per agents químics o Alteracions de les bases per radiacions o Oxidació de bases per agents oxidants (ROS) o Deformacions de la doble hèlix per agents intercalants DESAMINACIÓ ESPONTÀNIA DE LES BASES O INDUÏDA PER AGENTS QUÍMICS La desaminació espontània de la citosina és la més freqüent en mamífers (centenars de mutacions per cèl·lula i dia). Aquestes desaminacions es poden corregir (són reversibles). L’agent químic causant de més desaminacions és l’àcid nitrós, el qual es produeix a partir de conservants alimentaris (nitrit i nitrat sòdic). La desaminació produeix mutacions puntuals que repercuteixen només una cadena. En la replicació s’obtindrà una cadena igual a la original i l’altra mutada, de manera que una de les cèl·lules filles tindrà aquesta mutació puntual. PÈRDUA DE BASES PER HIDRÒLISI DE L’ENLLAÇ N-GLICOSÍDIC La pèrdua espontània de purines és la més freqüent. El nucleòtid afectat queda reduït a l’esquelet format pel sucre lligat per enllaços fosfodièster i es genera un lloc AP (lloc apurínic/apirimidínic). Agents antitumorals com la bleomicina generen llocs AP. El nucleòtid sense base és poc estable, de manera que es degrada deixant un gap (espai) en una cadena. La calor indueix la hidròlisi de l’enllaç N-glicosídic. ALQUILACIÓ DE BASES PER REACTIUS QUÍMICS Es tracta de la introducció de grups metil o etil en un àtom d’oxigen o nitrogen de les bases, no catalitzat enzimàticament. Aleshores, s’impedeix l’aparellament entre bases complementàries i, per tant, es generen mutacions. La dimetilnitrosamina o el dimetilsulfat són exemples d’agents alquilants. 57 Tema 2: Genoma procariota ALTERACIONS DE LES BASES PER RADIACIONS La llum UV indueix la formació de dímers de timina. Provoca distorsions estructurals en la doble hèlix. Dímer de pirimidina: és dona per la formació d’un anell de ciclobutà o un fotoproducte 6-4 entre dues pirimidines adjacents (per exemple timines), les quals s’enllacen entre sí i impedeixen l’aparellament amb les bases complementàries. LESIONS CAUSADES PER AGENTS OXIDANTS (ROS) Les espècies reactives de l’oxigen (ROS) són potents agents oxidants generats en l’ambient cel·lular, radiacions ionitzants i agents químics. Les oxidacions poden provocar aparellaments de bases incorrectes. Els radicals lliures danyen el DNA oxidant-lo i generant bases modificades com la 8-oxoguanina i la timina glicol. LESIONS CAUSADES PER AGENTS INTERCALANTS: BENZO(A)PIRÈ Els agents intercalants són molècules policícliques, planes i hidrofòbiques que s’intercalen entre les bases deformant la doble hèlix. En la replicació, s’elimina o addiciona un o més parells de bases als costats de la molècula intercalada. Són mutagènics i carcinogènics. El benzo[a]pirè és un hidrocarbur policíclic aromàtic (PAH) present en el fum del tabac, resultat de combustió incompleta. Aquest no reacciona directament amb el DNA, sinó que ha de ser oxigenat pel citocrom P450 per tal de generar un producte molt reactiu (BPDE) i cancerigen que forma adductes (productes de l’addició directa de 2 o més molècules diferents que donen lloc a un únic producte de reacció que conté tots els àtoms de tots els coponents) amb el DNA (generalment guanina). MUTACIONS I RECOMBINACIÓ FACTORS IMPLICATS EN LA SUSCEPTIBILITAT ALS EFECTES DEL FUM DEL TABAC El fenotip biològic ve determinat per factors genètics, epigenètics i ambientals. Factors ambientals i hàbits que causen canvis epigenètics: contaminació, nutrició, climatologia, radiació solar, exercici físic, tabaquisme, etc. FACTORS GENÈRICS: POLIMORFISMES 58 Tema 2: Genoma procariota FACTORS EPIGENÈTICS o Metilació del DNA: Silenciació gènica (repressió de la transcripció). o Modificació d’histones (metilació, acetilació, fosforilació):Regula l’expressió gènica per canvis en el grau de condensació del DNA. o RNA d’interferència (iRNA): Molècules d’RNA no codificant, com els microRNAs (miRNAs), els quals s’uneixen i promouen la degradació d’mRNAs específics evitant la seva traducció en els ribosomes. PRINCIPALS SISTEMES DE REPARACIÓ DEL DNA EN E.COLI o Reparació d’aparellaments incorrectes o Reparació per escissió de base o Reparació per escissió de nucleòtid o Reparació