Tema 1 (II) Anatomia del genoma PDF

Tema 1 (II) Anatomia del genoma (estructura del DNA i l’RNA) - La doble hèlix - Superenrotllament del DNA - Topoisomerases Atès el caràcter no lucratiu i la finalitat exclusivament docent i eminentmen...

Tema 1 (II) Anatomia del genoma (estructura del DNA i l’RNA) - La doble hèlix - Superenrotllament del DNA - Topoisomerases Atès el caràcter no lucratiu i la finalitat exclusivament docent i eminentment il·lustrativa dels materials disponibles en aquest espai virtual, els professors s'acullen a l’article 32 de la Llei de Propietat Intel·lectual vigent respecte de l’ús parcial d'obres alienes com ara imatges, gràfics, texts o altre material utilitzat en els diferents recursos docents presents en aquest Campus Virtual.  Anatomia del genoma (II) Estructura primària dels àcids nucleics: polinucleòtids i enllaç fosfodièster ü Els àcids nucleics són cadenes llargues formades per nucleòtids units covalentment (enllaços 3’-5’ fosfodièster) de forma lineal. ü L’estructura primària dels àcids nucleics és la seqüència de nucleòtids. ü L’esquelet lineal, constant (pentoses i fosfats que es van alternant en la cadena) té funció estructural. ü La seqüència de bases púriques i pirimidíniques, variable (unides a intervals regulars a l’esquelet lineal) codifica la informació genètica.  Anatomia del genoma (II) L’estructura primària dels àcids nucleics és la seqüència de nucleòtids 5’-UGC- 3’ 5’-ATG- 3’  Anatomia del genoma (II) Regles d
aparellament de bases: regles de Chargaff !! La composició de bases del DNA és característica de cada espècie. !! El DNA aïllat de teixits diferents procedents de la mateixa espècie té la mateixa composició de bases. !! La composició de bases del DNA d
una espècie no varia amb l
edat del organisme, l
estat nutricional o els canvis medi-ambientals. !! En la majoria dels DNAs, el contingut de purines és aproximadament igual al de pirimidines: el quocient (A+G) / (T+C) és aproximadament 1. A ! T G ! C A + G ! T + C Relació d
asimetria en el contingut de bases púriques i pirimidíniques  Anatomia del genoma (II) Estructura secundària del DNA ü És el primer nivell d’estructura tridimensional que adopten les cadenes del DNA. ü El DNA és polimòrfic. ü Models estructurals secundaris: – B-DNA (doble hèlix de Watson i Crick, 1953) – A-DNA – Z-DNA – Estructura de forqueta i cruciforme – H-DNA (triple hèlix de Hoogsten)  Anatomia del genoma (II) B-DNA ü Està format per dues cadenes antiparal·leles de polinucleòtids. ü Són cadenes complementàries que interaccionen per ponts d’hidrogen entre parells de bases. ü Les interaccions són entre purines i pirimidines  Anatomia del genoma (II) B-DNA !! Les dues cadenes formen una doble hèlix dextrogira. !! Les bases, orientades cap a l’interior de l’hèlix, es disposen quasi perpendicularment a l’eix longitudinal de l’estructura i s’apilen paral!lelament entre si. !! Els esquelets lineals de les cadenes se situen en l’exterior de l’hèlix. !! El model B-DNA té aproximadament 10 pb/volta d’hèlix (36 Å) (10,5 pb/volta, en solució). !! S’estabilitza principalment per ponts d’hidrogen entre els parells de bases complementaris. !! És una doble hèlix asimètrica: té un solc major i un solc menor. Vista axial  Anatomia del genoma (II) B-DNA: solc major i solc menor !! La formació d
un enllaç d
hidrogen requereix que els àtoms implicats es situïn sobre una línea quasi recta (formant gairebé un pla). !! Els enllaços N-!-glicosídics no es disposen totalment perpendiculars a l
eix longitudinal de l
hèlix. !! Es generen dos angles diferents entre els enllaços N-!-glicosídics complementaris (uns 120º per un costat i uns 240º per l
altre). !! Al formar-se la doble hèlix l
angle de 120º genera un solc menor i el de 240º genera un solc major.  Anatomia del genoma (II) B-DNA: solc major i solc menor  Anatomia del genoma (II) B-DNA: solc major i solc menor !! Les proteïnes d
unió al DNA interaccionen específicament amb el solc major, què conté més grups exposats (donadors i acceptors d
hidrogen, i superfícies hidrofòbiques -grups metil i hidrògens no polars-). !! El codi dels grups exposats en el solc major (G"C: AADH, C"G: HDAA, A=T: ADAM, T=A: MADA) permet el A: acceptors de ponts d
hidrogen reconeixement específic per part de proteïnes D: donadors de ponts d
hidrogen interaccionants amb el DNA sense que sigui H: hidrògens no polars necessari obrir la doble M: grups metil hèlix.  Anatomia del genoma (II) B-DNA: la doble hèlix del DNA permet multiples conformacions ü Les bases nitrogenades de cada parell de bases enfrontades poden fer un cert gir helicoidal. Com a conseqüència els solcs major i menor poden variar localment.  Anatomia del genoma (II) Altres estructures secundàries del DNA ü A-DNA: – Forma afavorida in vitro per deshidratació. – Doble hèlix més compacta, curta i gruixuda, amb 11 pb per volta. – Dextrògira – En híbrids DNA-RNA; en plegaments secundaris RNA-RNA. ü Z-DNA: – Forma afavorida in vitro a altes concentracions de Na+. – Doble hèlix més prima i llarga, amb 12 pb per volta. – Plegament zig-zag de l’esquelet covalent. – Levògira. – En seqüències curtes on s’alternen pirimidines (en conformació anti) i purines (en conformació syn), especialment C, o 5-metil-C, i G.  Anatomia del genoma (II) Estructures secundàries del DNA: formes A, B i Z  Anatomia del genoma (II) Variacions estructurals en algunes seqüències de DNA: repeticions invertides (palíndroms) i repeticions especulars Palíndrom: repetició invertida a la cadena complementària Repetició especular: repetició invertida a la mateixa cadena ü Els palíndroms, que generen estructures autocomplementàries dins la mateixa cadena, poden actuar com a senyals de reconeixement de moltes proteïnes reguladores de l’expressió gènica.  Anatomia del genoma (II) Les repeticions invertides (palíndroms) poden formar estructures en forqueta (hairpin) i cruciformes  Anatomia del genoma (II) Variacions estructurals del DNA: els aparellaments de Hoogsteen permeten la formació de tríplex de DNA (H-DNA) ü H-DNA: 3 cadenes de DNA formen una triple hèlix. ü Es forma en regions amb només purines (GA) o pirimidines (CT) en una cadena. ü La formació de l’estructura està afavorida in vitro en medi àcid, què promou la protonació de les citosines. ü In vivo la cadena senzilla pot interaccionar amb proteïnes. ü L’estructura s’estabilitza per enllaços de Hoogsteen. D. L. Nelson, M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. Worth Publishers, 2004.  Anatomia del genoma (II) Els enllaços de Hoogsteen permeten la formació d’estructures de DNA de 3 i 4 cadenes  Anatomia del genoma (II) Estructures secundàries de l
RNA  Anatomia del genoma (II) Estructures secundàries de l’RNA ü L’estabilitat de les estructures secundàries de l’RNA es veu afavorida per tetrallaços (tetraloops) formats per la seqüència UUCG (freqüent en els extrems de les forquetes), i la formació de pseudonusos (pseudoknots) entre seqüències complementàries no contínues. Formació d’un pseudonus  Anatomia del genoma (II) Estructura tridimensional de l’RNA Estructura tridimensional del fenilalanina-tRNA de llevat, el qual presenta alguns aparellaments de bases poc freqüents.  Anatomia del genoma (II) Propietats físico-químiques dels àcids nucleics ü Les cadenes dels àcids nucleics són hidrofíliques. ü Són àcids amb moltes càrregues negatives a pH fisiològic. ü A pH neutre i temperatura ambient, les solucions de DNA són molt viscoses; són molècules força rígides i molt llargues respecte al seu diàmetre. ü Absorbeixen llum al UV (260 nm). ü Són químicament molt estables, principalment el DNA. ü Hidròlisi química: – Els enllaços fosfodièster i glicosídics del DNA i l’RNA s’hidrolitzen per tractament amb àcids forts. – Els àcids febles hidrolitzen únicament els enllaços glicosídics. – La hidròlisi alcalina trenca els enllaços fosfodièster de l’RNA, però no del DNA.  Anatomia del genoma (II) Hidròlisi dels enllaços fosfodièster de l’RNA mediada per OH- ü L’RNA és més reactiu que el DNA perquè té hidroxils lliures en els carbonis 2’. ü En un medi bàsic s’hidrolitzen els enllaços fosfodièster de l’RNA.  Anatomia del genoma (II) Desnaturalització i renaturalització (hibridació) del DNA  Anatomia del genoma (II) Desnaturalització tèrmica del DNA La temperatura de fusió (tm) del DNA és la temperatura a què el 50% de la molècula està desnaturalitzada. La tm d’un dúplex s’incrementa proporcionalment al seu contingut en aparellaments G≡C.  Anatomia del genoma (II) Absorció de llum UV Espectre d
absorció dels nucleòtids components dels àcids nucleics Efectes hipocròmic i hipercròmic del DNA. El DNA de cadena sencilla absorbeix llum més eficaçment que el DNA de cadena doble. -Hipocromisme: disminució d
absorbància produïda en la formació del dúplex de DNA. -Hipercromisme: augment d
absorbància produïda en la desnaturalització del DNA.  Anatomia del genoma (II) Hibridació del DNA ü El grau d’hibridació del DNA s’utilitza per comparar similituds entre espècies diferents.  Anatomia del genoma (II) Els agents desnaturalitzants, in vitro, eliminen estructures secundàries: ü Temperatura elevada: – 95-100ºC, per al DNA – 60-65ºC, per a l’RNA ü Solucions alcalines (solucions diluïdes de NaOH, pH=11), per al DNA. ü Tractaments amb agents químics desnaturalitzants: – Urea – Formamida – Formaldehid  Anatomia del genoma (II) Topologia del DNA: superenrotllament de la doble hèlix sobre si mateixa, formant una superhèlix  Anatomia del genoma (II) Topologia del DNA: superenrotllament de la doble hèlix sobre si mateixa, formant una superhèlix ü La tensió estructural de la doble hèlix del DNA genera superenrotllament en forma solenoïdal o plectonèmica. Ambdues formes són interconvertibles i la forma solenoïdal permet una major compactació del DNA.  Anatomia del genoma (II) DNA plasmídics relaxats i superenrotllats Relaxat Superenrotllat Plasmidis: molècules petites de DNA circular tancat de doble cadena que estan en el citoplasma de molts bacteris.  Anatomia del genoma (II) Superenrotllament de DNA ü Per conveni, el superenrotllament pot ser: – Positiu: es genera si la doble hèlix té més voltes que el model relaxat. La superhèlix és levògira (gira en sentit contrari a la doble hèlix). – Negatiu: es genera si la doble hèlix té menys voltes que el model relaxat (DNA desenrotllat). La superhèlix és dextrògira (gira en el mateix sentit que la doble hèlix). En els éssers vius les voltes superhelicoidals són negatives perquè la doble hèlix del DNA està parcialment desenrotllada: Té menys voltes que el model relaxat de Watson i Crick. Té més de 10,4 pb / volta.  Anatomia del genoma (II) Superenrotllament de DNA ü Es genera superenrotllament en un DNA circular tancat si pateix tensió estructural: Si es redueix el nombre de voltes de la doble hèlix del B-DNA (per desenrotllament en algun punt de la molècula) la tensió estructural provocada s’estabilitza provocant superenrotllament negatiu. Si augmenta el nombre de voltes de la doble hèlix del B-DNA (per enrotllament) la tensió estructural provocada s’estabilitza provocant superenrotllament positiu. ü El superenrotllament negatiu: Es dóna en tots els DNA cel·lulars i està estrictament regulat. Compacta el DNA però facilita la separació de les cadenes durant la replicació i la transcripció, ja que la doble hèlix està una mica desenrotllada.  Anatomia del genoma (II) Propietats topològiques del DNA ü El nombre d’enllaç, Lk (linking number), es pot definir com el nombre de vegades que dues cadenes del DNA es creuen (no es poden separar sense trencament). ü Lk0 és el nombre d’enllaç del DNA relaxat (es pren com a referència). ü La diferència d’enllaç, ΔLk, permet determinar el grau de superenrotllament del DNA: ΔLk = Lk- Lk0 ü El Lk és la suma de dos components: Lk = Tw + Wr Tw (twist) = nombre de girs de les cadenes de la doble hèlix (enrotllament helicoïdal de les cadenes entre si) Wr (writhe) = nombre de torsions de l’eix de la doble hèlix (nombre de voltes de superhèlix)  Anatomia del genoma (II) Nombre d
enllaç (Lk) (25 voltes x 10.4 pb per volta = 260 pb)  Anatomia del genoma (II) Nombre d
enllaç (Lk)  Anatomia del genoma (II) Topoisòmers !! Isòmers estructurals que només es diferencien en una propietat topològica, com el nombre d
enllaç topològic (Lk). !! Són resultat dels diferents graus de superenrotllament del DNA. !! Els topoisòmers es poden transformar entre si mitjançant el tall d
una o les dues cadenes de DNA i posterior unió. !! Els topoisòmers es poden separar entre si mitjançant electroforesi en gel d
agarosa (el superenrotllament condensa el DNA).  Anatomia del genoma (II) Topoisomerases ü Les topoisomerases són enzims encarregats in vivo d’ interconvertir els topoisòmers del DNA. ü Catalitzen el canvi en el nombre d’enllaç del DNA (Lk). ü Augmenten o disminueixen el grau d’enrotllament del DNA: el superenrotllen o el relaxen. També encadenen i desencadenen molècules de DNA circular. ü Són imprescindibles en la transcripció, replicació i compactació del DNA ü Hi ha dos tipus principals de topoisomerases: Tipus I Tipus II  Anatomia del genoma (II) Topoisomerases Topoisomerasa de tipus I Topoisomerasa de tipus II  Anatomia del genoma (II) Topoisomerases ü Les topoisomerases de tipus I i II tallen cadenes de DNA mitjançant la formació d’un intermediari covalent entre un residu de tirosina i una cadena de DNA. ü Procariotes i eucariotes tenen topoisomerases tipus I i II que eliminen superenrotllament negatiu: relaxen el DNA ü E. coli té una topoisomerasa tipus II (DNA-girasa) que introdueix superenrotllament negatiu: compacta el DNA. ü Les topoisomerases eucariotes no generen superenrotllament negatiu. Topoisomerases de tipus I Anatomia del genoma (II) !! Trenquen únicament una de les cadenes del DNA i catalitzen la relaxació del DNA superenrotllat, en un procés termodinàmicament favorable. !! Eliminen superenrotllament negatiu. !! Cada cicle catalític augmenta Lk en una unitat. !! Inhibidors de la topoisomerasa I humana s
utilitzen com a agents antitumorals.  Anatomia del genoma (II) Fàrmacs inhibidors de la topoisomerasa I en la teràpia contra el càncer Càncer d’ovari i pulmó Càncer colorectal !! Derivats d’un alcaloide natural (camptotecina) aïllat de l’escorça d’un arbre xinés  Anatomia del genoma (II) Topoisomerases de tipus II ü Trenquen les dues cadenes del DNA. ü En procariotes poden generar superenrotllament negatiu (disminueixen Lk). Necessiten l’energia d’hidròlisi de l’ATP per promoure canvis conformacionals enzimàtics. Les topoisomerases II d’eucariotes no generen superenrotllament negatiu, però poden relaxar superenrotllaments positius i negatius. ü La topoisomerasa II bacteriana (DNA-girasa) és diana de diversos antibiòtics.  Anatomia del genoma (II) Fàrmacs inhibidors de la DNA-girasa com a agents terapèutics ü Antibiòtics sintètics derivats de quinolones, com la ciprofloxacina (antibiòtic d‘ampli espectre), o el norfloxací (utilitzat fonamentalment contra infeccions urinàries).  Anatomia del genoma (II) Topoisomerases Les topoisomerases tenen també altres importants funcions en el manteniment de l’estructura del DNA: ü Enrotllen i desenrotllen molècules de DNA circular. ü Desenrotllen els cromosomes lineals després de la replicació. ü Desfan nusos del DNA generats en algunes reaccions de recombinació.