Résumé du TP de BM 2022-2023 PDF

Résumé des deux séances de travaux pratiques de biologie moléculaire - S5- 2022/2023 I. Première séance de TP de biologie moléculaire L’objectif de la première séance de TP de biologie moléculaire est : (1) d’extraire l’ADN total d’une plante supérieure (cas du...

Résumé des deux séances de travaux pratiques de biologie moléculaire - S5- 2022/2023 I. Première séance de TP de biologie moléculaire L’objectif de la première séance de TP de biologie moléculaire est : (1) d’extraire l’ADN total d’une plante supérieure (cas du Chou-fleur, E/ Brassica oleracea) ; et, (2) de réaliser l’analyse qualitative et quantitative de la solution d’ADN total extrait. 1. Extraction de l’ADN total de plantes supérieures L’extraction de l’ADN total de plantes supérieures est réalisée selon la méthode du CTAB décrite dans votre polycopié (voir la partie C/ Extraction du DNA total de plantes du polycopié, page 5). 2. Analyse qualitative d’une solution d’acides nucléiques L’analyse qualitative a pour but de vérifier la pureté d’une solution d’acides nucléiques. Autrement dit, elle permet de vérifier si l’extrait d’acides nucléiques contient des contaminants pouvant provenir du tissu végétal (exemple : protéines, phénols, polysaccharides etc.) et/ou des produits utilisés pour sa purification (exemple : EDTA, chloroforme etc.). Pour réaliser cette analyse qualitative, on peut utiliser la spectrophotométrie d’absorption dans l’UV afin de mesurer les absorbances de la solution d’acides nucléiques à 3 longueurs d’onde (notée λ) qui sont : λ=260 nm qui correspond au maximum d’absorbance des acides nucléiques. λ=280 nm qui correspond au maximum d’absorbance des protéines. λ=230 nm qui correspond à l’absorbance d’autres types de contaminants autres que les protéines tels que l’EDTA, phénols, polysaccharides, etc. Les 3 valeurs d’absorbances données par la solution d’acides nucléiques sont utilisées pour calculer 2 ratio qui sont des indicateurs de pureté (notés, R1 et R2). Les relations mathématiques utilisées pour calculer ces ratios et l’interprétation des résultats obtenus sont données dans le tableau I. Tableau I : méthode de calcul des 2 ratios utilisés dans l’analyse qualitative de la solution d’acides nucléiques et l’interprétation des résultats obtenus. Rapports calculés pour 𝐷𝑂 λ=260nm 𝐷𝑂 λ=260nm l’analyse qualitative de 𝑅1 = 𝑅2 = l’ADN extrait 𝐷𝑂 λ=280nm 𝐷𝑂 λ=230nm Si R 2 est significativement < Si 𝑅1 < 1,6 alors la solution 2 alors la solution contient des est riche en protéines. contaminants absorbant à la Si 𝑅1 ~2,0 alors la solution est λ=230 nm (EDTA, phénols, Interprétation des riche en acides nucléiques (DNA polysaccharides etc.). résultats obtenus + RNA) et pauvre en protéines. Si 2 ≤ 𝑅1 ≤ 2,2 alors la Si 𝑅1 𝑙𝑎𝑟𝑔𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 > 2,0 alors solution ne contient pas de la solution est contaminée par le contaminants absorbant à la chloroforme. λ=230 nm. Remarques : pour mesurer ces absorbances, une cuve de quartz est utilisée car elle n’absorbe pas dans l’UV (190 - 400 nm) contrairement à la cuve de verre ou de polystyrène. Cette cuve doit aussi avoir une largeur de 1 cm, qui est une condition nécessaire à l’analyse quantitative (voir la partie I.3 Analyse quantitative d’une solution d’acides nucléiques).  3. Analyse quantitative d’une solution d’acides nucléiques L’analyse quantitative d’une solution d’acides nucléiques nécessite uniquement de connaître l’absorbance à la longueur d’onde de 260 nm : A (λ=260 nm). La cuve de quartz utilisée pour mesurer cette absorbance doit avoir une largeur de 1 cm pour pouvoir utiliser les facteurs de conversion suivants qui lient entre l’absorbance et la concentration tels que : 1 𝑢𝑛𝑖𝑡é 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒~50 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝐷𝑁 𝑑𝑜𝑢𝑏𝑙𝑒 𝑏𝑟𝑖𝑛/𝑚𝑙 1 𝑢𝑛𝑖𝑡é 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒~33 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝐷𝑁 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑏𝑟𝑖𝑛/𝑚𝑙 1 𝑢𝑛𝑖𝑡é 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒~40 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝑅𝑁 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑏𝑟𝑖𝑛/𝑚𝑙 4. Exemple traité au cours du TP L’extraction de l’ADN total du Chou-fleur est réalisée à partir de 200 mg de tissu végétal frais selon le protocole expérimental décrit dans votre polycopié (voir la partie C/ Extraction du DNA total de plantes du polycopié, page 5). Le culot d’ADN obtenu à la fin de l’extraction est suspendu dans 500 µl d’eau distillée constituant la solution mère d’ADN extrait. Avant de réaliser la mesure des absorbances avec un spectrophotomètre UV, cette solution mère d’ADN extrait est diluée 8 fois (facteur de dilution=8) afin d’avoir des valeurs d’absorbances de la solution inférieures à 1 unité. L’utilisation de valeurs d’absorbances dépassant 1 unité pour quantifier l’ADN extrait risque de sous-estimer la quantité d’ADN réellement extraite. Le volume final de la solution d’ADN 8 fois diluée est fixé à 2000 µl (ou 2 ml puisque 1 ml = 1000 µl). La concentration de la solution d’ADN 8 fois diluée obtenue est déduite à partir de la mesure de l’absorbance de cette solution à 260 nm. On donne pour exemple une valeur d’absorbance à la longueur d’onde de 260 nm de la solution d’ADN 8 fois diluée égale à 0,6553, soit A (λ=260 nm)= 0,6553. a. Préparation de la solution d’ADN diluée Volume final (Vf) Par définition, on a : Facteur de dilution (FD) = volume initial (Vi) Et, sachant qu’on a choisi un FD = 8 et un Vf de la solution diluée = 2000 µl, alors on peut déterminer le Vi qu’il faut prélever à partir de la solution mère d’ADN extrait pour préparer un Vf de 2000 µl de solution d’ADN extrait 8 fois diluée comme suit : 𝑉𝑓 2000 µ𝑙 𝑉𝑖 = 𝐹𝐷 = = 250 µ𝑙 de solution mère d’ADN extrait 8 Dans un tube propre, il faut donc déposer 250 µl de solution mère auxquels on ajoutera 1750 µl d’eau distillée pour obtenir un Vf de 2000 µl de solution d’ADN extrait 8 fois diluée. Le volume d’eau distillée à ajouter au Vi prélevé a été déterminé en calculant Vf –Vi ce qui donne dans notre cas : 2000 µl - 250 µl =1750 µl. b. Calcul de la concentration d’ADN extrait de la solution mère La solution d’ADN extrait 8 fois diluée a donné une A (λ=260 nm)= 0,6553. Puisque cette extraction est réalisée à partir d’un tissu de plante supérieure eucaryote, on utilisera le facteur de conversion qui lie entre l’absorbance et la concentration d’ADN bicaténaire comme suit : Sachant que : 1 unité Absorbance (λ = 260 nm) → 50 µg d’ADN bicaténaire /ml Alors pour : 0,6553 unité Absorbance (λ = 260 nm) → 𝑥 µg d’ADN bicaténaire /ml On en déduit donc que la : Concentration d’ADN bicaténaire de la solution 8 fois diluée = x = 50 µg/ml X A (λ=260 nm) de la solution 8 fois diluée = 50 µg/ml X 0,6553 = 32,765 µg d’ADN bicaténaire/ml de solution 8 fois diluée. Or, pour obtenir la concentration d’ADN bicaténaire de la solution mère, il faut tenir compte du facteur de dilution (FD) choisi au cours du TP qui est égale à 8. Comme expliqué plus haut, on choisit un FD qui pourra donner une valeur d’absorbances inférieure à 1 unité. Toutefois, si avec un FD=8, l’absorbance obtenue dépasse toujours 1 unité alors on doit choisir un FD plus élevé jusqu’à obtenir une valeur d’absorbance idéalement comprise entre 0,2 et 0,8. Dans notre exemple de calcul, pour le FD=8, on a obtenu A (λ=260 nm)= 0,6553 qui est inférieure à 1. Le FD choisi dans ce cas est donc correcte et on ne risque pas de sous estimer la quantité d’ADN extraite. Ainsi donc la : Concentration d’ADN total extrait de la solution mère = Concentration d’ADN total extrait de la solution 8 fois diluée X FD = 32,765 µg/ml X 8 = 262,12 µg d’ADN total extrait /ml de solution mère. c. Calcul de la quantité d’ADN total extrait en µg par gramme de matériel végétal frais Dans le paragraphe I.4.b, on a pu déterminer la concentration d’ADN total extrait de la solution mère qui est égale à 262,12 µg /ml. On sait donc que dans chaque 1 ml de solution mère, il y a une quantité d’ADN total extrait de 262,12 µg. Or, on n’a préparé que 500 µl (soit 0,5 ml) de solution mère (ce sont les 500 µl d’eau distillée qu’on a ajouté au culot d’ADN qu’on a extrait) (voir la partie C/ Extraction du DNA total de plantes du polycopié, page 5). Il faut donc chercher la quantité d’ADN qu’il y a dans les 500 µl de solution mère qu’on a réellement préparé. Pour cela : 262,12 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝐷𝑁 𝑏𝑖𝑐𝑎𝑡é𝑛𝑎𝑖𝑟𝑒 → 1 𝑚𝑙 (𝑜𝑢 1000 µ𝑙) 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑚è𝑟𝑒 𝑥 µ𝑔 𝑑′ 𝐴𝐷𝑁 𝑏𝑖𝑐𝑎𝑡é𝑛𝑎𝑖𝑟𝑒 → 0,5 𝑚𝑙(𝑜𝑢 500 µ𝑙) 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑚è𝑟𝑒 On en déduit que la : Quantité d’ADN total extrait dans les 500 µl de solution mère = 𝑥 0,5 𝑚𝑙 500 µ𝑙 = 262,12 µ𝑔 × (𝑜𝑢 262,12 µ𝑔 × ) = 131,06 µ𝑔 1 𝑚𝑙 1000 µ𝑙 Il y a donc 131,06 µg d’ADN total extrait dans les 500 µl de solution mère. Cette même quantité d’ADN existe dans le poids total de tissu végétal frais utilisé pour purifier l’ADN bicaténaire total qu’il contient. Au cours du TP, nous avons utilisé 200 mg de Chou-fleur dont on a extrait la totalité de l’ADN total. Donc, on peut déduire qu’il y a 131,06 µg d’ADN total bicaténaire dans les 200 mg de Chou-fleur. Connaissant cette information, il ne reste plus qu’à déterminer la quantité d’ADN total qu’il y a dans 1 mg de Chou-fleur comme suit : 131,06 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝐷𝑁 total → 200 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑡𝑖𝑠𝑠𝑢 𝑣é𝑔é𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑎𝑖𝑠 𝑥 µ𝑔 𝑑 ′ 𝐴𝐷𝑁 total → 1 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑡𝑖𝑠𝑠𝑢 𝑣é𝑔é𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑎𝑖𝑠 On en déduit que la : 1 𝑚𝑔 Quantité en µg d’ADN total par mg de matériel végétal frais = 𝑥 = 131,06 µ𝑔 × = 200 𝑚𝑔 0,6553 µ𝑔/mg Donc, il y a une quantité de 0,6553 µg d’ADN total dans chaque 1 mg de Chou-fleur frais.  d. Analyse qualitative de la solution d’ADN extrait Pour réaliser l’analyse qualitative de la solution d’ADN, en plus de l’absorbance mesurée à 260 nm, les absorbances aux longueurs d’ondes de 230 nm et 280 nm doivent aussi être mesurées donnant les valeurs suivantes : A (λ=260 nm) = 0,6553; A (λ=280 nm) = 0,3153; A (λ=230 nm) = 0,3690. Comme expliqué dans le tableau I, nous devons calculer et interpréter chacun des 2 rapports suivants : R1= A (λ=260 nm)/ A (λ=280 nm) = 0,6553/0,3153 = 2,07 R2= A (λ=260 nm)/ A (λ=230 nm) = 0,6553/0,3690 = 1,77 On en déduit donc: ✓ Puisque R1 = 2,07 alors la solution est riche en ADN et pauvre en protéines. ✓ Puisque R2 = 1,77 alors la solution contient aussi des contaminants qui absorbent à la longueur d’onde de 230 nm. II.Deuxième séance de TP de biologie moléculaire L’objectif de la deuxième séance de TP de biologie moléculaire est d’utiliser la technique d’électrophorèse sur gel d’agarose pour: mettre en évidence les séquences hautement répétées chez les plantes supérieures (voir planche 2 : photo du gel 2 incluse dans votre polycopié, page 9). 1. Principe de séparation de l’ADN par électrophorèse en gel d’agarose Étant chargées négativement, les molécules d’ADN vont toutes migrer du pôle négatif (cathode) vers le pôle positif (anode) au cours de l’électrophorèse. Toutefois, malgré que leur charge négative soit nécessaire pour leur migration, on peut considérer qu’elle n’intervient pas dans leur séparation par électrophorèse en gel d’agarose. La séparation de molécules d’ADN linéaires dépend plus exactement de leur poids moléculaire uniquement. En effet, les molécules de faible poids moléculaire vont migrer plus rapidement que les molécules de haut poids moléculaire. 2. Détermination de la taille des fragments d’ADN révélés sur gel d’agarose La détermination de la taille en pb des fragments d’ADN se fait par rapport à la migration d’un marqueur de taille (référence) contenant plusieurs fragments d’ADN de tailles connues. Ce marqueur migre en parallèle avec les échantillons d’ADN à analyser. Il permettra de tracer une courbe d’étalonnage de la taille des fragments d’ADN en pb en fonction de la distance de migration en cm. Cette courbe a été tracée au cours de la deuxième séance de TP en utilisant la taille connue de 11 fragments d’ADN formant le marqueur de taille (voir planche 1 : photo du gel 1, puits n°1) et leur distance de migration en cm. Pour tracer cette courbe, il a fallu tout d’abord positionner verticalement le point zéro de votre double décimètre au centre du puits n°1 du gel où un certain volume du marqueur de taille a été déposé. En fixant votre double décimètre en cette position, les distances parcourues par chaque fragment de taille connue formant marqueur de taille sont relevés en cm (voir fig.1).  Figure 1 : positionnement du double-décimètre pour relever les distances de migration des bandes d’ADN sur le gel d’agarose : cas des 11 fragments formant le marqueur de taille. Les points relevés sont ensuite reportés sur un papier semi-logarithmique avec la taille des fragments en pb sur une échelle logarithmique en ordonnée (l’axe des y) et la distance migration en cm en abscisse (l’axe des x) (voir fig. 2). Cette droite permettra de déterminer la taille en pb de n’importe quel fragment d’ADN linéaire qui a migré sur le même gel d’agarose que le marqueur de taille en mesurant la distance qu’il a parcouru en cm. Il suffit de reporter cette valeur en cm sur l’axe des x et la projeter verticalement jusqu’à son intersection avec la droite tracée. Encore une fois, on projette horizontalement à partir de ce point d’intersection avec la droite tracée sur l’axe des « y » pour déterminer la taille recherchée en pb du fragment d’ADN ayant migré à cette distance prenant comme exemple 3 fragments d’ADN ayant migrés à la distance de 2,2 cm, 3,2 cm et 5 cm. La détermination de la taille en pb de ces fragments d’ADN est montrée sur la figure 3)  Figure 2 : courbe de la taille des fragments en pb sur une échelle logarithmique en ordonnée (l’axe des y) et la distance migration en cm en abscisse (l’axe des x). Figure 3 : utilisation de la courbe de la taille des fragments d’ADN en pb en fonction de la distance de migration dans la détermination de la taille des 3 fragments d’ADN linéaires pris comme exemple ayant migrés aux distances 2,2 cm, 3,2 cm et 5 cm marqués sur l’axe des abscisses.  3. Mise en en évidence les séquences hautement répétées chez 4 plantes supérieures Les résultats de l’hydrolyse de l’ADN extrait à partir de quatre différents tissus végétaux (Chou-fleur ; Chou ; Concombre ; et, Courgette) par l’enzyme de restriction HindIII ont été analysés (voir planche 2 : photo du gel 2 incluse dans votre polycopié). L’ADN génomique extrait de chaque plante est digéré par l’enzyme de restriction HindIII puis séparé par électrophorèse en gel d’agarose à 0,8%. La révélation de l’ADN sur le gel d’agarose a montré : - un voile formé de plusieurs fragments d’ADN collés les uns aux autres (voir fig.4); -et, aussi vers le bas du gel, la présence de bandes épaisses qui correspondent aux séquences hautement répétées (voir fig.4). Il existe donc plusieurs sites de coupures par l’enzyme de restriction HindIII au sein de l’ensemble du génome des 4 plantes supérieures choisies dans cette étude et en particulier aux extrémités des séquences hautement répétées. La détermination de la taille de ces séquences est aussi réalisée par l’utilisation de la courbe de la taille en pb des fragments d’ADN en fonction de la distance de migration en cm comme pour l’exemple vu dans la figure 3. Figure 4 : mise en évidence des séquences hautement répétées chez 4 plantes supérieures (puits 4 : Chou-fleur ; puits 5 : Chou ; puits 6 : Concombre ; puits 7 : Courgette) par l’hydrolyse de leur ADN génomique par l’enzyme de restriction HindIII. Le puits 3 contient le marqueur de taille.