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Rechberger 1. Sie trennen ein Lipidextrakt mittels DC auf einer Kieselgelfolie a. Welches Trennprinzip kommt hier zur Anwendung? Geben Sie eine kurze Beschreibung = ist ein relativ einfaches Trennverfahren, das sich durch sehr geringen apparativen und zeitlichen Aufwand auszeichnet. Be...

Rechberger 1. Sie trennen ein Lipidextrakt mittels DC auf einer Kieselgelfolie a. Welches Trennprinzip kommt hier zur Anwendung? Geben Sie eine kurze Beschreibung = ist ein relativ einfaches Trennverfahren, das sich durch sehr geringen apparativen und zeitlichen Aufwand auszeichnet. Bei korrekter Durchführung können recht einfach hohe Trennleistungen und niedrige Nachweisgrenzen erzielt werden. Das Anwendungsspektrum der DC umfasst sowohl polare wie auch unpolare, bevorzugt schwer flüchtige Substanzen. Die am weitesten verbreitete stationäre Phase ist Kieselgel, aber auch Aluminiumoxid wird oft verwendet. Bei der Trennung mittels DC (Dünnschichtchromatographie) findet Adsorption an der Oberfläche der stationären Phase aus feingepulverten polaren Materialien statt (Kieselgel, Aluminiumoxid). Porengröße, Teilchengröße, Porenzahl und Wassergehalt der stationären Phase haben Einfluss auf die Absorptionskraft der stationären Phase. Die mobile Phase übernimmt die Entwicklung des Chromatogramms durch unterschiedliche Elution der Komponenten vom Adsorbens. Die Lösungsmittel können nach ihrer Elutionskraft in die sogenannte elutrope Reihe eingeordnet werden. Je höher die Elutionskraft eines Lösungsmittels ist, desto schneller wandert eine Substanz über die jeweilige stationäre Phase. Die chemische Struktur einer Verbindung bestimmt ihr chromatographisches Verhalten wesentlich: - Mit zunehmender Polarität der Verbindung wird diese adsorbiert, damit nimmt die Wanderungsgeschwindigkeit am Adsorbens ab. - Wasserstoffbrücken-Donatoren wie Alkohole oder Carbonsäuren adsorbieren besonders gut an oxidischen Adsorbentien wie Kieselgel und Aluminiumoxid. - Bei ungesättigten und aromatischen Kohlenwasserstoffen steigt die Adsorptionsstärke mit der Größe des konjugierten π-Systems. Substanzen mit niedriger Polarität wird man demnach an Adsorbentien mit hoher Adsorptionsstärke mit einem schwach eluierenden Solvens chromatographisch trennen und umgekehrt. b. Nennen Sie 4 Möglichkeiten Lipide am DC anzufärben und die jeweilige Spezifität des Reagens Lipide sind farblos, daher müssen sie durch ein Reagens gefärbt werden: 1. Joddampf - Jod lagert sich reversibel an Doppelbindungen an - alle Lipidklassen (Unspezifische Färbung) Sehr schnelle und einfache Methode zur Lipidfärbung. DC- Folie wird in eine mit Ioddampf gesättigte Kammer gestellt. Das Iod lagert sich besonders an Doppelbindungen an und bildet gelb- braune Flecken. Die Färbung ist reversibel, aber auch unspezifisch, da auch anderer Verbindungen mit Doppelbindungen gefärbt werden. Die Färbung ist schlecht für quantitative Aussagen geeignet, da die Färbung nicht nur von der Stoffmenge auf der DC- Folie abhängig ist, sondern auch vom Sättigungsgrad der Analyten. Durch vorsichtiges Erwärmen lässt sich das Iod relativ rasch entfernen und die Lipide bleiben weitgehend intakt. Es ist möglich, das Kieselgel nach dem Entfärben selektiv von der Folie zu kratzen, die Lipide zu extrahieren und weiter zu analysieren 2. Fluoreszierende Farbstoffe - (Unspezifische Färbung) 1 2,7- Dichlorfluorescin in Methanol färbt als Sprühreagenz Lipide als gelbe Spots. Der Farbstoff ist sehr sensitiv, allerdings destruktiv. Ein weiterer fluoreszierender Farbstoff ist Rhodamin in Ethanol, welches Lipide als rot- rosa Spots sichtbar macht 3. Molybdänblau-Färbung (Phospholipde) nach Dittmer und Lester - Phosphathaltige Lipideblaue spots (Spezifische Färbung) Ein sehr empfindlicher Nachweis für alle Phospholipide gelingt durch die Färbung mit Molybdänblau. Dazu wird die DC- Folie mit einer frischen schwefelsauren Lösung von Molybdän und Molybdän- Oxid und besprüht. Nach dem Trocknen sind Phospholipide als blaue Spots sichtbar. Die Nachweismethode ist zwar sehr empfindlich, jedoch können alle möglichen anderen Phosphate die Blaufärbung ebenfalls auslösen und somit den Nachweis verfälschen. 4. Ninhydrin (Primäre Aminogruppen) - Färbung - Lipide mit primären Aminogruppen (Spezifische Färbung) Zum Nachweis primärer Aminogruppen eignet sich Ninhydrin. Die Ninhydrin- Lösung wird auf die DCFolien gesprüht und beim Erwärmen auf 110 °C wird mit Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin sowie den entsprechenden Lyso- Formen ein rot-violetter Farbstoff gebildet. 5. Dragendorf-Reagenz (Cholingruppen) - Cholin-hältige Lipide - orange-rote Spots (Spezifische Färbung) Das Dragendorf- Reagenz ist eine frisch bereitete Mischung aus Kaliumiodid in Wasser und Wolframnitrat in 20 % Eisessig. Wird die DC- Folie damit besprüht und mäßig erwärmt, so werden alle Cholin- hältigen Lipide wie Phosphatidylcholin, Lyso-Phosphatidylcholin und Sphingomyelin als orange- rote Spots sichtbar c. Was ist der RF-Wert und was sagt er hinsichtlich der Vergleichbarkeit von Proben auf unterschiedlichen DC's aus? Der Rf-Wert (retarding factor) dient zur Beschreibung des Laufverhaltens einer Substanz.Dabei steht „Rf“ für „relate to front“ oder „retarding factor“. RF-Werte sind immer nur Richtwerte! (konzentrationsabhängig). Immer Standard vergleichbarer Konzentrationen mitlaufen lassen! Sinnvolle Rf- Werte liegen in der Größenordnung zwischen 0,2 und 0,8. Der Rf-Wert berechnet sich aus dem Quotienten aus der gesamten Laufstrecke der mobilen Phase und der Laufstrecke des Analyten. Der Rf Wert setzt sich aus a/f (a = Laufstrecke der Substanz ; f = Laufstrecke des Laufmittels) Bei TAG und Sterolestern kann es aufgrund der unterschiedlichen Fettsäuren zu mehr als einer Bande kommen. 2. Sie haben ein Protein isoliert von dem Sie annehmen, dass es nahe am N-Terminus ein phosphoryliertes Serin aufweist. a. Welche Methoden zur Sequenzierung stehen Ihnen zu Verfügung? Proteinanalytik mit Massenspektroskopie zurückgreifen. z.B.: - Tandem - MS 2  - Peptide werden im MS fragmentiert ->full scan - Die Peaks der Fragmente im Produktionen- Spektrum sind dann immer um die Masse der jeweiligen Aminosäure voneinander getrennt. Aus diesen Abständen kann so – meist mit Hilfe einer Datenbanksuche – die Aminosäuresequenz ermittelt werden. - Charakteristisches Fragmentierungsmuster liefert Sequenzinformation - Durch die Phosphorylierung am Serin ändert sich der m/z- Wert - Identifizierung über Datenbanksuche - Die heute weit verbreitete Methode zur Proteinanalytik geht von einer Mischung von Peptiden nach einem enzymatischen Verdau aus. Diese Peptide werden chromatographisch – meist mittels nanoHPLC- getrennt und dann mittels einer Kombination aus Full-Scan und Produktionen-Scan analysiert. In den meisten Fällen gibt es ein automatisiertes System, wo softwaregesteuert die jeweils intensivsten Peaks aus einem Full-Scan unmittelbar danach in einem Produktionen-Scan fragmentiert werden. Typischerweise folgen auf einen Full-Scan drei bis zehn Produktionen- Scans, dann beginnt die Serie von Scans mit einem neuen Full-Scan von vorne. So können von Peptiden in komplexen Mischungen jeweils die spezifischen Produktionen- Spektren aufgenommen und dann mittels Datenbanksuche analysiert werden - - Proteinanalytik mit Peptide- Mass- Fingerprint (PMF)! - Aminosäurezusammensetzung aus Peptidmassen errechnet - Proteinidentifizierung über Datenbanksuche - Heute weniger gebräuchlich - b. Mit welcher Methode können Sie die Modifikation lokalisieren? Begründen Sie in Stichworten Ihre Wahl Durch Phosphorylierung ändert sich der Ladungszustand des Moleküls. Durch Fragmentierung von Peptiden und Analyse im MS kann man dadurch die Fragmente identifizieren. Durch Phosphorylierung erhöht sich auch die m/z. In diesem Beispiel ist die Aminosäure 3 modifiziert. Die Fragment-Massen der Aminosäuren 1 und 2 sind unverändert, ab der 3. Aminosäure ändern sich die Massen der Fragmente um die Masse der Modifikation. Daraus lässt sich bestimmen, an welcher Aminosäure die Modifikation lokalisiert ist 3. Ein wesentlicher Bestandteil der Lipidanalytik ist die Ermittlung des Fettsäuremusters. Sie haben erfolgreich einen S.cerevisiae-Totallipidextrakt mittels DC getrennt und den Spot mit dem Phosphatidylinositol (PI) von der Folie abgekratzt. a. Welche prinzipiellen Möglichkeiten haben Sie, um das Fettsäuremuster der PI- Fraktion zu ermitteln? Beschreiben Sie stichwortartig die Methoden (Probenvorbereitung, Analysentechnik etc.) und vergleichen Sie die Aussagekraft der Ergebnisse. Gehen Sie auch auf mögliche Probleme ein. (10) 1) Präparation und Reinigung der Lipide aus biologischem Material a. Flüssigphasenextraktion der Lipide mit organischen LM b. Festphasenextraktion mit hydrophoben Trägermaterialien! 2) Folch – Extraktion: Häufigste Methode zur Extraktion von Totallipiden a. Man gibt das 20-fache an Chloroform/Methanol (2:1) zum Gewebe, Zellsuspension 3  3) MS - Verwendung von GC das man FS-Fettsäuremuster haben will - Detektion mittels Massenspektroskopie, gute selektive Scantechnik dann charakteristischer Kopfgruppe - Zuerst Full Scan mit Tripple Quadrupol (Q1) um die Häufigste Fettsäure mit m/z Wert zu ermitteln - Dann Product Ionen Scan mit Q1 auf diesen m/z Wert eingestellt (somit Scan des Peaks). Q2 fragmentiert und Q3 auf Full Scan, somit kann die Kopfgruppe ermittelt werden, sowie die Masse der beiden Fettsäuren -> ermöglicht Bestimmung der Länge und Doppelbindungen der FS (Bsp; 18.0+16.1 = 34.1) - Bei PI wird Precursor Scan durchgeführt (Q1 Full Scan, Q2 fragmentiert und Q3 auf m/z der Kopfgruppe eingestellt) und mit Vergleich des Full-Scans können weitere Fettsäurelänge identifiziert werden (Bsp: 32.1 oder 36.2 etc…) (brauche ich nicht unbedingt, wenn die probe rein ist und nur PI drin ist, dann brauche ich nicht nach der Kopfgruppe speziell zu detektieren) b. Für ihr Experiment ist es notwendig, die Fettsäuren an der sn-2 Position des PI’s zu charakterisieren. Beschreiben Sie stichwortartig, wie Sie zu Ihrem Probenmaterial kommen und welche Möglichkeiten Sie zur Untersuchung der Fettsäuren hinsichtlich Molekulargewicht, Lage von Doppelbindungen und OH- Gruppen haben. (10) 1) Zuerst will man, dass das Enzym (Phospholipase A2) an der sn-2 Position die Fettsäure abschneidet (PLA1 sn-1, PLA1 sn- 2) a) Die Phospholipasen A1 und A2 schneiden die an Phospholipide gebundene Fettsäuren spezifische von der sn-1 beziehungsweise von der sn- 2 Position. Die jeweils andere Fettsäure bleibt ans Glycerol verestert. Das so entstandene Lyso- Phospholipid kann man leicht von der freien Fettsäure abtrennen und diese dann weiter analysieren. 2) Derivatisierung zur Bestimmung der Lage von Doppelbindungen - Methylester liefern kaum Informationen zur Lage von Doppelbindungen innerhalb der Fettsäure. - Besonders bei einfach ungesättigten Fettsäuren kann Doppelbindung durch Derivatisierung erkannt werden. - Zur Bestimmung der Doppelbindungs- Position kann der Fettsäuremethylester mit Dimethyl-Disulfid und Iod als Katalysator umgesetzt werden. Dabei lagert sich an den Kohlenstoffatomen der ehemaligen Doppelbindung Methylsulfid an - Nach einer derartigen Derivatisierung bilden sich bei Elektronenstoß- Ionisationsbedingungen charakteristische Fragmente, anhand derer man die Position der ehemaligen Doppelbindung ermitteln kann. Diese Methode 4  funktioniert gut bei ein- und zweifach ungesättigten Fettsäuren, bei mehreren Doppelbindungen wird das Fragmentmuster oftmals sehr komplex und schwierig zu interpretieren. - Derivatisierung - Umwandlung von Fettsäuren in Fettsäure-Methylester 4. In Kombination mit der klassischen HPLC sind unter anderem folgende Detektoren im Einsatz: Lichtstreudetektor, MS- und UV- Detektor. a. Welche Ionisierungstechnik eignet sich am besten zur Kombination von HPLC und MS? Geben Sie eine kurze Beschreibung (er sagt zwar eine kurze Beschreibung, aber es ist besser, das nicht zu ungenau zu beschreiben) und gehen Sie auch auf Limitierungen ein. (6) ESI (Electrospray- Ionisierung) - eignet sich ideal zur Kopplung von Flüssigchromatographie- Systemen mit Massenspektrometern - durch Anlegen von Spannung (bis ca. 4eV) wird Probelösung in geladene Tröpfchen zerstäubt. - ist sehr schonend und ermöglicht sogar die Ionisierung großer Biomoleküle wie Proteine, ohne diese zu fragmentieren - Die geladenen Tröpfchen verlieren auf ihrem Weg von der Kapillare zum MS Lösungsmittel, wodurch die so lange schrumpfen, bis die Abstoßungskräfte zwischen den Ladungen zur sogenannten "Coulomb-Explosion" führen und der Tropfen in kleinere Tröpfchen zerplatzt - Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, bleiben Pseudomolekülionen der Form [M+xH]x+ zurück, die MS analysiert werden können. Je nach Größe des Proteinmoleküls sind Mehrfachladungen möglich. Limitierung: - Die Ionisierungseffizienz ist abhängig von der Konzentration der Probe und empfindlich gegenüber Verunreinigungen. b. Reihen Sie die Detektoren hinsichtlich der Spezifität der erzielbaren Daten. Erklären Sie, welche Aussagen mit welchem System möglich sind und welche nicht bzw. was unter den jeweiligen Bedingungen zu beachten ist. (4) - In Kombination mit der klassischen HPLC sind unter anderem folgende Detektoren im Einsatz: Lichtstreudetektor, MS und UV- Detektor. - Spezifität: Massenspektrometrie > UV-Detektor >Lichtstreudetektor 1) Massenspektrometer Auftrennung von Ionen in Gasphase aufgrund ihres Masse-Ladung-Verhältnis. Aussagen: sind sehr potente und vielfältig einsetzbare Detektoren, die sehr detaillierte Analysen ermöglichen. Bedingungen: Reinheit der Lösungsmittel - nur Ionen detektierbar 5  - Wahl der Ionenquelle: Art der zu analysierenden Substanz + wie schonend soll Ionisiert werden - 2) UV-Detektor Aussagen: In der einfachsten Ausführung können sie nur bei bestimmten, zum Beispiel durch feingebaute Filter definierte Wellenlängen messen. - geringe Eigenabsorbtion - geringer Gehalt UV-aktiver Verunreinigungen →Spezifikation, HPLC-grade, gradient grade Bedingungen: Bei der Verwendung von UV- Detektoren sollten Lösungsmittel der Spezifikation „gradient garde“ oder „HPLC grade“ verwendet werden, da hier wenig UV aktive Verunreinigungen enthalten sind. Eine Verunreinigung muss in diesem Zusammenhang nicht unbedingt klassischer Schmutz sein, es kann sich auch besonders bei Chloroform um Stabilisatoren oder bei Ethanol auch um Vergällungsmittel handeln. - geringe Eigenabsorption der Eluenten - geringer Gehalt UV aktiver Verunreinigungen 3) Lichtstreudetektor Aussagen: = ein universeller Detektor für schwer flüchtige Substanzen in verdampfbaren Laufmitteln. Einsatzgebiete des Lichtstreudetektors liegen im Bereich der Polymerchemie, der Pharmazie und der Biochemie (Peptide, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Lipide etc.) Bedingungen: Die Betriebstemperatur des Verdampfers soll etwas höher als der Siedepunkt des Eluenten sein (um eine reproduzierbare Partikelbildung gewährleisten zu können) - Temperatur muss höher als der Siedepunkt des Eluenten, aber unter dem Siedepunkt der Probe liegen. - Das verwendete Gas muss ein Inertgas sein (meist Stickstoff, aber auch Helium). - Volumenstrom muss an den Siedepunkt des Eluenten angepasst werden -> höherer Siedepunkt, langsamerer Strom - Wenn Puffer als Eluent verwendet wird, müssen ALLE Komponenten flüchtig, nur in geringen Mengen vorhanden und von großer Reinheit sein. 5. Edman Abbau: Vorteile / Nachteile Eine klassische Methode zur Sequenzierung von Proteinen ist der sogenannte Edman- Abbau. Der EDMAN-Abbau besteht aus 3 voneinander abgrenzbaren Schritten: 1. Kupplung: An die freie N-terminale Aminogruppe der Peptidkette wird das EDMAN Reagens "Phenylisothiocyanat" (PITC) gekoppelt. 2. Spaltung: Durch den säurekatalytisierten nucleophilen Angriff des Schwefels an der ersten Peptidbindung kommt es zur Abspaltung der N-Terminalen Aminosäure als Anilinthiazolinion-Aminosärue (ATZ Amionsäure) 3. Konvertierung: Die instabile ATZ-Aminosäure wird mit wäßriger Säure linearisitert und bei erhöhter Temperatur zur relativ stabilen Phenylthiohydantoin-Aminosäure (PTH) Aminosäure umgelagert. Vorteile - PTH-AS spezifisches UV-Spektrum (269 nm) - Nachweisgrenze Femtomolbereich 6  - Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und kann daher weiter untersucht werden. - Das Peptid wird nicht denaturiert. Es wird nur die Kette in jedem Zyklus um ein Peptid verkürzt. - Bei dieser Synthese können Reinheiten des Produktes von bis zu 95% erreicht werden. - Trotz langer Analysezeiten lässt sich die Methode zuverlässig, robust und mit einfacher Interpretation betreiben - Nachteile - Amino-Gruppe darf nicht derivatisiert sein (ansonsten ist keine Reaktion möglich) → Ungefähr 50% der natürlich vorkommenden Proteine weisen einen modifizierten und somit für den Edman-Abbau blockierten N- Terminus auf. Nur selten ist die Entfernung der Blockade möglich. - darf nur ein Protein in Probe sein (Ergebnisse sonst nicht eindeutig) - Salze, Detergenzien und freie AS stören bzw. verhindern die Reaktion - unvollständigen Abbaureaktion führt zu komplexen Reaktionsgemischen - Reaktionsausbeute eines Abbau- Schrittes liegt bei etwa 95%, was die eindeutige Identifizierung der Sequenz auf eine Kettenlänge von 30 bis 40 Aminosäuren beschränkt 6. 2 Adsorptionschromatographien beschreiben und hinsichtlich stationärer und mobiler Phase vergleichen. Auf was basiert Trennung? Normal-Phasen-Adsorptionschromatographie Dient zur Analyse relativ polarer Substanzen. Die Retention innerhalb einer Mischung steigt mit der Polarität des Analyten. Als stationäre Phase dient Silikagel -Si-OH-Gruppen. Sie besteht aus Material mit polaren funktionellen Gruppen. Die Adsorption basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem permanenten Dipol der SilanolGruppe und einem permanenten oder induzierten Dipol am Analytmolekül. Elutionsmittel: schwach (Hexan, Pentan) , mittel (Chloroform, Dichlormethan) stark: (Propanol, Methanol) Eluiert wird mit einem unpolaren Stoff. Faustregel: Polare Stoffe werden später eluiert als unpolare (Je polarer die mobile Phase, umso stärker die eluierende Wirkung. Je polarer der Analyt, umso stärker die Wechselwirkung mit der stationären Phase) Umkehrphasen-Adsorptionschromatographie ist ideal zur Analyse unpolarer Substanzen und ist weit verbreitet. Als stationäre Phase dient Silikagel (Kieselgel), welches durch chemische Modifikation apolar gemacht wurde (z.B.: durch Kohlenwasserstoffketten C8, C18). Da die Adsorption durch die relativ schwachen Van-Der- Waals-WW stattfindet, ist das Trennverhalten stark vom LM abhängig. Eluiert wird mit einem polaren Stoff. Faustregel: Unpolare Stoffe werden später eluiert als polare (Je unpolarer die mobile Phase, umso stärker die eluierende Wirkung. Je unpolarer der Analyt, umso stärker die Wechselwirkung mit der stationären Phase) 7. Die 2sn FS an einem PC (Phosphatidylcholin) will ich untersuchen, wie komme ich ausgehend von einem Totallipidextrakt nach Folch-Extraktion auf diese FS und ihre Struktur? 1) DC von Lipiden 7  - Auftragen der Lipide am DC unter N2 Strom werden mit der Mikroliterspritze sehr feine dünne Linien aufgetragen für qualitative und quantitative Analysen. - Das Auftragen von Proben auf einer DC- Folie sollte in so kleinen Punkten wie möglich erfolgen. Jedes Auseinanderlaufen der Probelösung auf der Folie beim Auftragen führt zu breiten Banden, im schlimmsten Fall sogar zu Doppelbanden - Durch 2D DC erhält man eine bessere Auftrennung dabei 1. Dimension: Chloroform-Methanol-Wasser (75:25:2.5) und in der 2. Dimension: ChloroformMethanol-Essigsäure-Wasser (80:9:12:2) - Zur Verbesserung der Trennung von anionischen Phospholipiden (PI; PS oder Phosphatidsäure) kann das Kieselgel mit EDTA oder Oxalsäure impregniert werden. Diese Substanzen bilden einen Komplex mit Ca 2) Färbung von Lipiden - Lipide sind farblos. Molybdänblau - Färbung für Phospholipide. Die Färbung ist begrenzt haltbar - blaue Spots Oder mit Dragendorf Reagenz. Das Dragendorf- Reagenz ist eine frisch bereitete Mischung aus Kaliumiodid in Wasser und Wolframnitrat in 20 % Eisessig. Wird die DC- Folie damit besprüht und mäßig erwärmt, so werden alle Cholin- hältigen Lipide wie Phosphatidylcholin, Lyso-Phosphatidylcholin und Sphingomyelin als orange- rote Spots sichtbar 3) Schneiden Sie das Band, das dem 2-sn-Phosphatidylcholin entspricht, aus der TLC- Platte aus. Extrahieren Sie das Lipid aus dem geschnittenen Band unter Verwendung der Folch-Extraktionsmethode. 4) Zuerst will man, dass das Enzym (Phospholipase A2) an der sn-2 Position die Fettsäure abschneidet (PLA1 sn-1, PLA1 sn-2) Die Phospholipasen A1 und A2 schneiden die an Phospholipide gebundene Fettsäuren spezifische von der sn-1 beziehungsweise von der sn-2 Position. Die jeweils andere Fettsäure bleibt ans Glycerol verestert. Das so entstandene Lyso- Phospholipid kann man leicht von der freien Fettsäure abtrennen und diese dann weiter analysieren. 5) Tandem MS Der Vorläuferionen- Scan(Precurser scan) kommt zum Einsatz, wenn die Ladung nach der Fragmentierung des Phospholipids bevorzugt auf der Kopfgruppe lokalisiert ist. Das Prinzip wird am Beispiel von Phospatidylcholin, kurz PC, erklärt. Das Kopfgruppen- Fragment jedes PCs hat den m/z- Wert von 184. Egal, wie schwer das gesamte PC ist, egal, wie kurz oder lang die zwei Fettsäuren sind und egal, wieviel Doppelbindungen in den Fettsäuren vorhanden sind, das Kopfgruppen- Fragment, das bei jedem PC detektiert werden kann, hat immer m/z 184. Beim Vorläuferionen- Scan wird daher Q3 auf dieses m/z mit 184 fix eingestellt. Die Fragmentierung in Q2 wird aktiviert und Q1 scannt über den gesamten Massenbereich, der auf PCs untersucht werden soll. Wenn ein PC Q1 passiert, wird es fragmentiert und das charakteristische Fragment gelangt durch Q3 zum Detektor und wird registriert. Jedes andere Ion, dass fragmentiert wird, aber dabei kein Fragment mit dem ausgewählten m/z für Q3 liefert, wird auch nicht registriert. Im Spektrum werden dann jene m/z- Werte dargestellt, die Q1 passierten und deren entsprechendes Fragment durch Q3 zum Detektor gelangt ist. 1. Tandem MS - Precursor (Scan erfasst alle Spezies die die Kopfgruppe liefern) / Neutrol Loss Scan (Scan erfasst alle Spezies die die Kopfgruppe verlieren) 8  2. Product Ion Scan der jeweiligen Peaks zur bestimmung der Fettsäurezusammensetzung der jeweiligen Spezies. 8. Möglichkeiten der FS-Methylesterherstellung + 2 Beispiele, bei welchen eine andere Veresterung von Vorteil wäre Analyse freier Fettsäuren mittels HPLC (nicht so häufig) Problem: Freie, underivatisierte Fettsäuren haben keinen charakteristischen Chromophor (ungesättigte Fettsäuren absorbieren im nahen UV bei 205 nm, aber schlechte Empfindlichkeit) - UV Detektion unmöglich, MS oder Derivatisierung notwendig Während estergebundene Fettsäuren durch sauer- oder basenkatalysierte Umesterung direkt in Methylester überführt werden können, kann man spezifisch für freie Fettsäuren auch Diazomethan zur Bildung der Methylester einsetzten - Meist ist eine direkte Umesterung möglich. Säurekatalysierte Methylesterbildung Zur Veresterung von freien Fettsäuren und zur Umesterung von O-Acyl-gebundenen Fettsäuren aus Triglyceriden. Umsetzung mit wasserfreiem Methanol und Säure als Katalysator Wasser stört oder verhindert die Reaktion. Bei Verwendung von CHCl3 werden mit dem oft als Stabilisator zugesetzten Ethanol zusätzlich die entsprechenden Ethylester gebildet. Basenkatalysierte Methylesterbildung Die Fettsäuren in O-Acyl Lipide wie Triglyceride, Phospholipide lassen sich schnell und quantitativ in wasserfreiem Methanol mit einem basischen Katalysator (wie Natrium- Methanolat) direkt zu Fettsäuremethylester umsetzen. (Die Anwesenheit von Wasser verhindert die Umesterungsreaktion, es findet lediglich die Hydrolyse der Fettsäuren statt. Die gebildeten freie Fettsäuren werden nicht weiter umgesetzt) Andere Veresterungen: kurzkettige Fettsäuren bilden leicht flüchtige methylester, deswegen wird eine derivatisierung mit langkettigen alkoholen durchgeführt Um das Fragmentierungsverhalten von Fettsäurederivaten bei Elektronenstoß-Ionisation zu beeinflussen gibt es eine Reihe von stickstoffhältigen Derivaten. 9. Welche Möglichkeiten gibt es neben GC-MS noch? - GC-FID Erklären Sie diese und nennen Sie Vor & Nachteile - TCD - Thermal Conductivity Detector - FID - Flammenionisationsdetektor - FID ist eine alternative Detektionsmethode. Wenn die Probe von der Säule eluiert wird sie in einer Knallgasflamme verbrannt. Zusätzlich werden Luft und Wasserstoff eingeleitet. Dabei entstehen Ionen und die veränderte Leitfähigkeit wird zwischen den beiden Elektroden gemessen. Der Strom, der zwischen den Elektroden fließt, wird als Signal abgegeben. 9  - Genauer: Das Ende der GC- Säule mündet in einer Art Düse, in der die aus der Säule austretenden Probenmoleküle mit Luft und Wasserstoff vermischt und in eine Knallgasflamme geleitet werden, die zwischen 2 Elektroden brennt. In dieser Flamme verbrennen die Probenmoleküle und es entstehen Ionen. Anders als beim Massenspektrometer werden die Ionen nicht weiter analysiert, sondern durch die Elektroden nur ihr Einfluss auf die Leitfähigkeit gemessen. Kurz gesagt: Mehr Probenmoleküle bedeuten mehr Ionen, was zu mehr Stromfluss zwischen den Elektroden und somit zu einem stärkeren Signal führt. Das Signal lässt keinerlei Rückschlüsse auf die Art oder Größe der Ionen zu, lediglich auf deren Anzahl. Das Ergebnis einer GC-FID- Messung ist also ein Chromatogramm, bei dem die Retentionszeit der einzelnen Peaks der einzige Parameter zur Identifizierung einer Substanz ist. Sollten zwei Substanzen zur gleichen Zeit eluieren und sich die Peaks überlagern, so hat man rein über den Detektor keine Möglichkeit, sie getrennt zu identifizieren. - Vorteil: billiger und platzsparender (kleiner) - Nachteil: FID detektiert alles was über die Säule kommt -> keine zusätzliche Information wie bei MS; die einzige Information ist die Retentionszeit (bei MS: Retentionszeit und zusätzlich MS-Spektrum). Die Ionen werden nur registriert, nicht analysiert. 10. Zur Analyse von FS werden meist Methylester erzeugt. Nennen Sie 3 verschiedene Möglichkeiten, wie Sie diese Methylester weiter verwenden können und nennen Sie je ein Beispiel, wozu diese eingesetzt werden. - Derivatisierung zur Bestimmung der Lage von Doppelbindungen - Zur Bestimmung der Doppelbindungs- Position kann der Fettsäuremethylester mit Dimethyl-Disulfid und Iod als Katalysator umgesetzt werden. Dabei lagert sich an den Kohlenstoffatomen der ehemaligen Doppelbindung Methylsulfid an - Methylester liefern kaum Information zur Lage von Doppelbindungen innerhalb der Fettsäure - Besonders bei einfach ungesättigten Fettsäuren kann Doppelbindung durch Derivatisierung erkannt werden - Sehr brauchbar: Derivatisierung mit Dimethyldisulfid mit Iod als Katalysator 10  - Nach einer derartigen Derivatisierung bilden sich bei Elektronenstoß- Ionisationsbedingungen charakteristische Fragmente, anhand derer man die Position der ehemaligen Doppelbindung ermitteln kann. Diese Methode funktioniert gut bei ein- und zweifach ungesättigten Fettsäuren, bei mehreren Doppelbindungen wird das Fragmentmuster oftmals sehr komplex und schwierig zu interpretieren. - Derivatisierung von OH Gruppen - Silylierungs- Reagenzien, mit denen Hydroxy- Gruppen derivatisiert werden können. Damit wird einerseits die Polarität des Fettsäureesters reduziert und somit das gaschromatographische Verhalten verbessert, andererseits aber auch bei Verwendung eines Massenspektrometers die Lokalisierung der Hydroxy- Gruppe ermöglicht. - Freie OH-Gruppen reagieren mit GC-Säulenmaterial und führen zu Peakverbreiterungen - Häufige Derivatisierung: Silylierung - Mit Silylierungsreagenzien werden die Hydroxy- Gruppen in Anwesenheit einer organischen Base wie Pyridin bei milden Bedingungen zu den entsprechenden Trimethylsilyl-Ethern umgesetzt. Diese Reaktion greift zwar keine bestehenden Esterbindungen an, sie funktioniert allerdings auch an Carbonsäure- Gruppen. - Positionsbestimmung der OH-Gruppe - Dieses charakteristische Massenspektrum eines Fettsäuremethylesters mit einer silylierten HydroxyGruppe zeigt unter Elektronenstoß-Ionisationsbedingungen charakteristische Fragmente, anhand derer die Position der Hydroxy- Gruppe ermittelt werden kann. - Unter EI-Bedingungen wird bei gesättigten Fettsäuren die Fragmentierung vor und hinter der O-TMS-Gruppe favorisiert- typische Fragmente, die auch die Lage der OH-Gruppen anzeigen - Hydrieren von Fettsäuren - Bei der eben beschriebenen Positionsermittlung können Doppelbindungen in der Kohlenwasserstoffkette störend sein, da durch ihre Delokalisierung bei der Fragmentierung das Spektrum komplexer wird. Durch eine katalytische Hydrierung können Doppelbindungen entfernt du das Spektrum so vereinfacht werden. Dazu wird die methanolische Lösung des Fettsäure-Methylesters mit Platinoxid versetzt. Platinoxid ist ein sehr feines Pulver, das die gesamte Lösung trüb-grau erscheinen lässt. Nun wird Wasserstoff durch die Lösung geleitet und so die Doppelbindungen entfernt. Der Endpunkt der Reaktion ist erreicht, wenn das Platinoxid selbst reduziert wird und schlagartig ausflockt, wodurch die Lösung wieder klar wird. - Doppelbindungen können bei EI-MS delokalisieren und Spektrum sehr komplex machen, besonders wenn es um die Positionsbestimmung von OH-Gruppen geht - Katalytische Hydreierung mit PtO2 (Adams-Katalysator) und H2 - Methanolische Lösung der Fettsäure bzw. des Derivates wird mit Spatelspitze PtO2-Pulver versetzt- Einleiten von H2 bis Pt-Pulver flockig wird - DC von Lipiden. Das RP-DC ist vorteilhaft bei Fettsäuremethylestern. Das Kieselgel wird mit einer Imprägnierung (langkettige KW, Dimethyldichlorsilan) unpolar gemacht. - Modifikation der OH-Gruppen Methylsilylester abreagieren 11  - Doppelbindungen mit (CH3)2s2 und Iod als Katalysator - Doppelbindungen reduzieren pd kat und h2 Gaschromatographie (GC) mit MS-Detektion: - Verwendung: Methylester eignen sich gut für die Gaschromatographie (GC), da sie flüchtig sind und gut verdampfen können. Die Methylierung ermöglicht die Trennung und Analyse von Fettsäuren. - Beispiel: In der Ernährungsforschung können Methylesteranalysen durch GC-MS verwendet werden, um den Fettsäuregehalt in Lebensmitteln zu bestimmen und die Zusammensetzung von Fettsäuren in verschiedenen Proben zu vergleichen. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion: - Verwendung: Methylester können auch für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) geeignet sein, insbesondere wenn die Detektion mittels UV-Spektroskopie erfolgt. Dies ist besonders relevant für nicht- flüchtige oder weniger flüchtige Verbindungen. - Beispiel: In der medizinischen Forschung können Methylesteranalysen durch HPLC- UV verwendet werden, um die Konzentrationen von Fettsäuren in biologischen Proben wie Blut oder Gewebeproben zu quantifizieren. Massenspektrometrie (MS) für Strukturanalyse: - Verwendung: Methylester eignen sich für die Analyse mittels Massenspektrometrie (MS) zur Strukturanalyse von Fettsäuren. MS ermöglicht die genaue Bestimmung von Molekulargewichten und strukturellen Informationen. - Beispiel: In der Lipidomik können Methylesteranalysen durch LC-MS oder GC-MS eingesetzt werden, um komplexe Lipidprofile zu charakterisieren und spezifische Fettsäuren sowie Lipidklassen in biologischen Proben zu identifizieren. 11. Welche Ionisierung wird mit HPLC und MS eingesetzt? Beschreiben, Limitierungen! Elektrospray-Ionisierung (ESI) siehe Frage 4 a 12. Detektoren (UV-, Lichtstreu, MS-Detektor) beschreiben. Was ist bei jedem zu beachten, wofür werden sie eingesetzt? siehe Frage 4 b Lichtstreudetektor Einsatzgebiete des Lichtstreudetektors liegen im Bereich der Polymerchemie, der Pharmazie und der Biochemie (Peptide, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Lipide etc.) 12 Links ist die Zuleitung für die Probe von der HPLC sowie ein Einlass für das Zerstäuber- Gas. Durch das beheizbare Verdampfer- Rohr gelangt die Probe in den Bereich der Lichtquelle, wo sie das eingestrahlte Licht zum Detektor hin ablenkt Der Lichtstreudetektor ist ein universeller Detektor für schwer flüchtige Substanzen in verdampfbaren Laufmitteln. Der Eluentenstrom tritt durch eine Zerstäuberdüse, wo dieser mit einem Gas, meist Stickstoff oder Helium vernebelt wird. Dem Zersträuber schließt sich ein beheizbares Verdampferrohr an. Die Temperatur ist hierbei so gewählt, das nur der Eluent, nicht aber die Probenmoleküle verdampft werden. Generell gilt, dass die Betriebstemperatur des Verdampfers etwas höher als der Siedepunkt des Eluenten liegen sollte, um ein reproduzierbare Partikelbildung gewährleisten zu können. Die Probensubstanz wird durch den Gasstrom in Form von Mikrotropfen in die Detektionskammer weitergeführt. Die Wegstrecke ist dabei so dimensioniert, dass der Eluent vollständig verdampft werden kann, aber unnötige Wege, die das Rauschen erhöhen, vermieden werden. Rechtwinklig zur Eintrittsöffnung sind eine Lichtquelle und ein Photodetektor installiert. Als Lichtquelle kann sowohl ein Laser wie auch eine Wolframlampe eingesetzt werden. Der Photodetektor ist in einem Winkel von 120° zur Lichtquelle angebracht. Er empfängt lediglich die Menge an Licht die durch die Mikrotropfen abgelenkt wird. Da die Intensität des gestreuten Lichts weitgehend eine Funktion der Tropfengröße ist, liefert dieses Signal eine Messgröße für die Probenmenge. Zusätzlich geht noch der Brechungsindex und der Absorptionskoeffizient in die Funktion ein, so dass sich abhängig von der Probe unterschiedliche Responsefaktoren ergeben. Massenspektrometrie ermöglicht Analyse komplexer Mischungen. Um Auswertungen zu erleichtern sollte Probe vor getrennt werden (HPLC, DC) - Grundprinzip: Auftrennung von Ionen in der Gasphase nach ihrem Masse zu Ladungs Verhältnis (m/z) - Vorteil: - Jeder einzelne Punkt im Chromatogramm enthält komplettes MS-Spektrum, genaue Bestimmung der Molekülmasse ist möglich. 13  - Durch MS kann man Proteinsequenzen viel schneller identifizieren als durch Edman Degradation. - MS kann einfach automatisiert werden für Hochdurchsatzverfahren und so können tausende von Spots von einer 2D Gelelektrophorese oder HPLC fraktionen analysiert werden UV-Detektor Bei der Verwendung von UV- Detektoren sollten Lösungsmittel der Spezifikation „gradient garde“ oder „HPLC grade“ verwendet werden, da hier wenig UV aktive Verunreinigungen enthalten sind. Eine Verunreinigung muss in diesem Zusammenhang nicht unbedingt klassischer Schmutz sein, es kann sich auch besonders bei Chloroform um Stabilisatoren oder bei Ethanol auch um Vergällungsmittel handeln. Trotzdem hat jedes Lösungsmittel einen Wellenlängenbereich, in dem es UV- Licht absorbiert. 13. Hinsichtlich der Sequenzierung von Proteinen: Tandem-MS beschreiben und Vergleichen mit Edman-Abbau! Bei der Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) wird ein bestimmtes Ion aus dem Spektrum isoliert und fragmentiert. Das Fragmentmuster ist charakteristisch und ermöglicht gleichsam wie ein Fingerabdruck des Probenmoleküls dessen Identifizierung. Verfügen über enormes Potential bei der Strukturaufklärung und Identifizierung von Molekülen. Dabei werden bestimmte Scan- und Fragmentierungstechniken der einzelnen Komponenten nacheinander ausgeführt. Verglichen mit Edman-Abbau - Zur Identifizierung muss das Protein in Peptide zerlegt werden → enzymatischer Abbau - Peptide kann man über MS/MS fragmentieren. - Ein charakteristisches Fragmentierungsmuster liefert Sequenzinformationen → Identifizierung durch Datenbanksuche - Man kann auch modifizierte Proteine detektieren. - Edman Abbau braucht um einiges länger als Tandem MS. - Tandem MS fragmentiert Ionen bestimmter Masse. 14. Chromatographie: Diol-Säule, C18-Säule. Beschreibung der Säulen und der Unterschiede zwischen Säulentypen? 3 verschiedene TAG (48:0, 54:0, 60:0) werden aufgetrennt, welches eluiert bei welcher Säule zuerst ? Begründung? Diol-Säule Diol - Wird verwendet in der Normal-Phasen-Adsoprtionschromatographie (polare Stoffe eluieren später) ; Diol wird an Silikagel gehängt -> besitzt 2 OH-Gruppen und kann damit polare WW ausbilden. Generell wird in der Normalphasenchromatographie apolares Lösungsmittel zur Retention und polares LM zur Elution verwendet C18-Säule (und auch C8 Säule) 14 verwendet in der Reversed-Phase/Umkehrphasenadsorptionchromatographie (unpolare Stoffe eluieren später). Als stationäre Phase dient Silikagel, welches durch chemische Modifikation apolar gemacht wurde. Das Silikagel wurde durch Anhängen einer C18 (bzw C8) Kette apolar gemacht. Die Adsorption findet durch Van der Waals Wechselwirkungen statt. In der Umkehrphasenchromatographie wird polares LM zur Retention und apolares LM zu Elution verwendet. Bei der Diol-Säule eluiert zuerst 60,54,48 - polare Stoffe eluieren später in einer Normal- Phasen-Adsoprtionschromatographie Bei der C18 eluiert zuerst 48, 54, 60 - unpolare Stoffe eluieren später in einer RP- Chromatographie 15. 4 Moleküleigenschaften, auf denen chromatographische Trennung basiert, mit jeweils einem Beispiel. 1) Molekülgröße und Gestalt - Gel-Filtrationschromatographie - Gelpermeationschromatographie 2) Vorkommen positiv oder negativ geladener funktioneller Gruppen - Ionenchromatographie - Ionenpaarchromatographie - RP-HPLC mit Puffersalzen 3) Vorkommen anderer funktioneller Gruppen wie H-Brücken, hydrophobe WW - RP-HPLC - GC auf polaren Säulen 4) Siedepunktsunterschiede bei gleichen funktionellen Gruppen - GC 16. Lipidextrakt mit DC getrennt. Phospholipide abgetrennt: Wie ist eine weitere Analyse mit MS? Mit Vorreinigung, welche Ionisierung, Analysator und Scantechnik. Und wie bestimmt man Fettsäuremuster davon? Das Grundprinzip der Massenspektrometrie ist die Auftrennung von Ionen in der Gasphase nach ihrem Masse-zu Ladungs-Verhältnis (m/z). Vorreinigung: - Gelelektrophorese (1 und 2-D) - Extraktion - Derivatisierung - Standardderivatisierung in der Fettsäureanalytik: Methylesterbildung Ionenbildung - EI/CI (Electron-Impact-Ionisierung (EI) + Chemische Ionisierung (CI) - ESI/APCI - MALDI - FAB Analysator - Quadrupol - Ionenfalle - TOF - Sektorfeld - ICR 15  Scantechnik - MCP - Channeltron 17. Wie freie FS aus Totallipidextrakt in GC bestimmen + alternativen und analyse Festphasenextrakt: Diethylether/Eisessig (100/2) Diese Art von Chromatographie eignet sich nur zur Trennung von flüchtigen Substanzen. Die Substanzen müssen unzersetzt oder zumindest reproduzierbar zersetzt in die Gasphase gebracht werden können, also verdampfbar sein. Bei einigen an sich nicht flüchtigen Substanzen besteht die Möglichkeit, sie durch geeignete Derivatisierungen flüchtig zu machen. 1. Probenvorberitung - Extrahieren der Lipide aus der Probe mit einem geeigneten Extraktionsverfahren, z.B. mit Hilfe von organischen Lösungsmittel wie Chloroform und Methanol 2. Derivatisierung - Typische Derivatisierungsmethoden sind zum Beispiel die Bildung von Methylestern aus Carbonsäuren, die Acetylierung von Hydroxy- und Amino- Gruppen oder die Silylierung von Carbonsäuren, Hydroxy-, Amino- oder Thiolgruppen - Sollte eine Substanz einen zu hohen Siedepunkt haben oder zu thermischer Zersetzung neigen, so kann man versuchen, durch Derivatisierung die Flüchtigkeit und Stabilität zu beeinflussen und sie so für die Gaschromatographie zugänglich machen. 3. Extraktion der Fettsäureester - Die entstandenen Fettsäureester aus der wässrigen Phase extrahieren mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Hexan 4. Gaschromatographie (GC) - Die extrahierten Fettsäureester in den GC injizieren. - Man sollte eine GC-Säule, die für die Trennung von Fettsäureestern geeignet ist. - Eine geeignete Detektionstechnik wie FID (Flame Ionization Detector) verewenden 5. Quantifizierung - Standardlösungen von bekannten Fettsäuren verwenden, um eine Kalibrierkurve zu erstellen. - Nun kann man freien Fettsäuren in der Probe anhand der Kalibrierkurve quantifizieren Alternative Metthoden - Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC): - Die HPLC ist eine alternative Methode zur GC. Sie kann direkt für die Analyse von Fettsäuren verwendet werden, ohne dass eine Derivatisierung erforderlich ist. - Massenspektrometrie (MS): - Kopplung von GC oder HPLC mit Massenspektrometrie für eine genauere Identifikation und Quantifizierung der Fettsäuren 18. Edman Abbau + Vor-und Nachteile in Bezug auf Hybrid/MS Vorteile: - Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und kann daher weiter untersucht werden. - Das Peptid wird nicht denaturiert. Es wird nur die Kette in jedem Zyklus um ein Peptid verkürzt. - Bei dieser Synthese können Reinheiten des Produktes von bis zu 95% erreicht werden. - Trotz langer Analysezeiten lässt sich die Methode zuverlässig, robust und mit einfacher Interpretation betreiben 16  - PTH-AS zeigt ein spezifisches UV-Spektrum bei 269nm. - Die Nachweisgrenze liegt im Femtomolbereich. Nachteile: NH2-Gruppe darf nicht derivatisiert (z.b. acetyliert) sein, sonst erhält man keine Reaktion. Das betrifft ca.50% aller Proteine, die natürlich vorkommen. Nur selten ist eine Entfernung der Blockade möglich. Der viele Proteine sind am N-Terminus modifiziert. → N-Tzerminus darf nicht blockiert sein. - Probe darf nur ein Protein enthalten, sonst erhält man unklare Ergebnisse. - Salze, Detergenzien, freie AS stören bzw. verhindern die Reaktion! → Probenreinheit!!! → empfindlich gegen Verunreinigungen - Unvollständige Abbaureaktion führt zu komplexen Reaktionsgemischen. - Sequenz nicht mehr lesbar, wenn neu abgebaute AS unter 15% der eingesetzten Peptidmenge fällt. - Max. Sequenzlänge liegt bei ca.40AS Vergleich zu Tandem MS: - Zur Identifzierung muss das Protein in Peptide zerlegt werden → enyzmatischer Abbau - Peptide kann man über MS/MS fragmentieren. - Ein charakteristisches Fragementierungsmuster liefert Sequenzinformationen → Identifizierung durch Datenbanksuche - Man kann auch modifizierte Proteine detektieren. - Edman Abbau braucht um einiges länger als Tandem MS. - Tandem MS fragmentiert Ionen bestimmter Masse. 19. Wie Phospholipde analysieren (scantypen) 1. Full Scan Beim Full Scan wird das gesamte Massenspektrum über einen bestimmten Massenbereich aufgezeichnet. Diese Technik eignet sich gut für die Entdeckung unbekannter Phospholipide oder für umfassende Screening-Ansätze. 2. SIM Bei SIM wird das Massenspektrometer auf ein bestimmtes m/z (Massen-zu-Ladungs- Verhältnis) eingestellt, um ein spezifisches Ion oder eine Gruppe von Ionen zu überwachen. Dies kann nützlich sein, um gezielt bestimmte Phospholipide zu quantifizieren. 3. Produkt-Scan Beim Full Scan wird das gesamte Massenspektrum über einen bestimmten Massenbereich aufgezeichnet. Diese Technik eignet sich gut für die Entdeckung unbekannter Phospholipide oder für umfassende Screening-Ansätze. 4. SRM (Single Reaction Monitoring) oder MRM (Multiple Reaction Monitoring) MRM oder SRM ist eine gezielte Scantechnik, bei der bestimmte Vorläufer- und Produktionsionen ausgewählt werden. Dies ist besonders effektiv für die quantitative Analyse von spezifischen Phospholipiden. 5. Vorläuferionen-Scan (Precurser-Ion-Scan) Mittels Precursor-Ionen Scan (Full-Scan im Q1, Fragmentierung im Q2 und Q3 wird auf einen bestimmten m/z-Wert eingestellt! Dabei wird der m/z Wert von Q1 aufgezeichnet, wenn ein Ion Q3 passiert. Man stellt also Q3 auf den m/z Wert x (für Ethanolamin-Kopfgruppe) und das Spektrum zeigt somit alle Ionen bei denen diese Kopfgruppe mit den m/z Wert x abgespalten wird und somit erhält man im Vergleich mit der Full-Scan MS weitere PE mit dieser Kopfgruppe (z.B. 36:2, 32:2…) Somit kann durch die Wahl der geeigneten Scantechnik komplexe Mischungen relativ leicht identifiziert werden. 6. Neutralverlust-Scan (Neutral-Loss Scan) 17 Hierbei wird nach dem Verlust einer neutralen Masse gesucht, die typisch für bestimmte Phospholipidklassen ist. Das ist besonders nützlich, um nach bestimmten Phospholipiden zu suchen, die eine gemeinsame Struktur aufweisen. 20. Was Ionisationstechnik nach HPLC (ESI + genauer Aufbau) Elektrospray-Ionisierung (ESI) siehe Frage 4 a 21. C8 Säule, Auftrennung von Ceramide, TAG und DAG , was eluiert zuerst? verwendet in der Reversed-Phase/Umkehrphasenadsorptionchromatographie (unpolare Stoffe eluieren später). Als ersteres eluiert Ceramide (Ce) - Ceramide sind in der Regel polare Moleküle, und auf einer C8-Säule eluieren sie normalerweise früher. Sie haben eine stärkere Affinität zur mobilen Phase aufgrund ihrer Polarität. Als zweites eluiert Diacylglyceride (DAG) - Diacylglyceride sind weniger polar als Ceramide, aber sie sind in der Regel polarer als Triglyceride. Sie eluieren oft zwischen Ceramiden und Triglyceriden. Als zweites eluiert Triglyceride (TAG) - Triglyceride sind die am wenigsten polaren Moleküle in dieser Liste. Auf einer C8-Säule können sie dazu neigen, später zu eluieren, da sie eine stärkere Affinität zur hydrophoben stationären Phase haben. 22. Sie isolieren LDH und sehen dann am Gel aber noch zwei Proteinbande bei 70kD: Wie identifizieren sie dieses mittels MS? Dann verwendet man HPLC zur Lipidtrennung und welche Chromatographie-Art nimmt man und warum? 1. 23. Man findet ein Ceramid in seiner Probe und kriegt dann den m/z-Wert für Shingosin und mit welchem Scan findet man heraus, ob noch weitere Ceramide vorhanden sind und was kann man damit aussagen Precurser-Ion-Scan (Vorläufer-Ionen Scan) Der Vorläuferionen- Scan kommt zum Einsatz, wenn die Ladung nach der Fragmentierung des Phospholipids bevorzugt auf der Kopfgruppe lokalisiert ist. Q1 m/z der Kopfgruppe, Q2 fragmentiert, Q3 erfasst alle Moleküle di die bestimmte KG verlieren. So kann man sehen ob noch andere vorhanden sind aber nicht wie ihre Struktur ausschaut. 24. Analyse von freien FS in Proteingemisch 18  a. Auftrennung mit GC, wie bereite ich die Probe vor oder derivatisiere sie oder so Das Wesen der Gaschromatographie ist, wie der Name schon sagt, die Verwendung einer gasförmigen mobilen Phase. Die stationäre Phase kann fest sein, bei den heute weit verbreiteten Fused-Silica- Säulen ist sie aber flüssig in Form einer hochviskosen Polysiloxan- Beschichtung an der Kapillar- Innenwand. Derivatisierung - Für nicht unzersetzt verdampfbare Verbindungen Derivatisierung notwendig - Zum Beispiel: - Veresterung: Methylester bei Carbonsäuren mit BF3/Methanol - Acetylierung: OH, NH2, NHR, z.B. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid - Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt - Sollte eine Substanz einen zu hohen Siedepunkt haben oder zu thermischer Zersetzung neigen, so kann man versuchen, durch Derivatisierung die Flüchtigkeit und Stabilität zu beeinflussen und sie so für die Gaschromatographie zugänglich machen. Typische Derivatisierungsmethoden sind zum Beispiel die Bildung von Methylestern aus Carbonsäuren, die Acetylierung von Hydroxy- und Amino- Gruppen oder die Silylierung von Carbonsäuren, Hydroxy-, Amino- oder Thiolgruppen b. Ich will OH-Gruppen und Doppelbindungen-Lage bestimmen, wie mach ich das ­ Derivatisierung zur Bestimmung der Lage von Doppelbindungen o Zur Bestimmung der Doppelbindungs- Position kann der Fettsäuremethylester mit Dimethyl-Disulfid und Iod als Katalysator umgesetzt werden. Dabei lagert sich an den Kohlenstoffatomen der ehemaligen Doppelbindung Methylsulfid an o Methylester liefern kaum Information zur Lage von Doppelbindungen innerhalb der Fettsäure o Besonders bei einfach ungesättigten Fettsäuren kann Doppelbindung durch Derivatisierung erkannt werden o Sehr brauchbar: Derivatisierung mit Dimethyldisulfid mit Iod als Katalysator o Nach einer derartigen Derivatisierung bilden sich bei Elektronenstoß- Ionisationsbedingungen charakteristische Fragmente, anhand derer man die Position der ehemaligen Doppelbindung ermitteln kann. Diese Methode funktioniert gut bei ein- und zweifach ungesättigten Fettsäuren, bei mehreren Doppelbindungen wird das Fragmentmuster oftmals sehr komplex und schwierig zu interpretieren. ­ Derivatisierung von OH Gruppen o Silylierungs- Reagenzien, mit denen Hydroxy- Gruppen derivatisiert werden können. Damit wird einerseits die Polarität des Fettsäureesters reduziert und somit das gaschromatographische Verhalten verbessert, andererseits aber auch bei Verwendung eines Massenspektrometers die Lokalisierung der Hydroxy- Gruppe ermöglicht. o Freie OH-Gruppen reagieren mit GC-Säulenmaterial und führen zu Peakverbreiterungen o Häufige Derivatisierung: Silylierung o Mit Silylierungsreagenzien werden die Hydroxy- Gruppen in Anwesenheit einer organischen Base wie Pyridin bei milden Bedingungen zu den entsprechenden Trimethylsilyl-Ethern umgesetzt. Diese Reaktion greift zwar keine bestehenden Esterbindungen an, sie funktioniert allerdings auch an Carbonsäure- Gruppen. ­ Positionsbestimmung der OH-Gruppe 19  o Dieses charakteristische Massenspektrum eines Fettsäuremethylesters mit einer silylierten HydroxyGruppe zeigt unter Elektronenstoß-Ionisationsbedingungen charakteristische Fragmente, anhand derer die Position der Hydroxy- Gruppe ermittelt werden kann. o Unter EI-Bedingungen wird bei gesättigten Fettsäuren die Fragmentierung vor und hinter der O-TMS-Gruppe favorisiert- typische Fragmente, die auch die Lage der OH-Gruppen anzeigen c. Welche Analysetechnik nehme ich für b) und warum Massenspektrometer MS ermöglicht eine präzise Bestimmung der Molekülmasse und bietet detaillierte Informationen über die Struktur von Molekülen. Produktionenscan (product ion scan): MS/MS-Experimente ermöglichen eine selektive Fragmentierung und bieten somit Informationen über die Position von OH-Gruppen und Doppelbindungen. Die Technik ist hochauflösend und empfindlich, was bei der Analyse von komplexen Molekülen wie Fettsäuren wichtig ist. 25. Welche Ionisierungsarten kann ich mit HPLC koppeln und Vor- und Nachteile und Ionisierungsarten erklären ESI - Siehe Frage 4a Vorteile: - Schonend - Kopplung an ein LC-System. Die Kopplung ermöglicht die Analyse komplexerer Proben, da durch die LC (meist eine RP-HPLC) eine Auftrennung der Analyten erfolgt. Nachteile: - empfindlich gegenüber Verunreinigungen wie Seifen und Salzen ist als MALDI. MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (Matrixunterstützte Laserdesorptions- Ionisierung) - keine „on-line“-Kopplung, Ionisierung im Vakuum hauptsächlich Einfachladungen - Die Matrixunterstützte Laserdesorptions- Ionisierung erlaubt keine direkte Kopplung an ein Chromatographie- System. Die in eine Matrix eingebettete Probe wird durch Laserbestrahlung im Vakuum ionisiert und es werden hauptsächlich einfach geladenen Molekülionen gebildet. - Die Probe wird mit einem Überschuß an Matrix (organische Säure) vermischt und kristallisiert zu einem Spot. - In der MALDI- Ionenquelle wird dieser Spot mit einem Laser beschossen. Die Matrix absorbiert die Laserenergie und gibt sie abgeschwächt an die Probe weiter. - Es werden hauptsächlich einfach geladene Ionen gebildet - Die Ionisierung ist schonend und führt zu keiner Fragmentierung der Probe - Bei der Matrix- Unterstützten Laser Desorptions- Ionisation – kurz MALDI - wird die gelöste Probe mit einem Überschuss einer Matrix, typischerweise eine organische Säure wie Zimtsäure, vermischt, auf eine Metallplatte aufgebracht und getrocknet. Dabei sollte die Matrix möglichst gleichmäßig auskristallisieren und die Probenmoleküle darin eingebettet sein. Dieser Prozess geschieht entweder automatisiert in entsprechenden Pipettier- Robotern oder händisch am Labortisch. Erst die getrocknete Probe wird über ein Schleusensystem in den Hochvakuumbereich des Massenspektrometers eingebracht. Auf diese Art kommt keine Flüssigkeit in das 20  System. Die eigentliche Ionisierung erfolgt dann durch Beschuss des Matrix-Proben- Gemisches mit einem Laserimpuls. Die meiste Energie des Laserstrahls wird von der Matrix absorbiert und in abgeschwächter Form an die Probenmoleküle übertragen, wodurch diese ionisiert werden. Diese Ionisierungsform gilt als „weiche“ Ionisierungstechnik, da es beim Ionisierungsprozess kaum zu Fragmentierungsreaktionen kommt. Ein weiteres Charakteristikum der MALDI- Ionisierung ist die Ausbildung von überwiegend einfach geladenen Ionen. Vorteile: - Schonend und führt zu keiner Fragmentierung der Probe. - MALDI ist besonders gut für die Massenspektrometrie von großen Molekülen wie Proteinen und Peptiden geeignet. Nachteile: - Die Methode erfordert die Verwendung einer Matrix und ist eher für feststoffhaltige Proben geeignet. CI - Die Chemische Ionisierung findet im Prinzip in der gleichen Ionenquelle wie die EI- Ionisierung statt. Der entscheidende Unterschied ist ein Reaktand- Gas wie Methan oder Ammoniak, das zusätzlich in die Ionenquelle geleitet wird. In der Ionenquelle herrscht trotzdem noch Vakuum, aber die Reaktand-Gasmoleküle sind im deutlichen Überschuss im Vergleich zu den Probenmolekülen. Vom Filament wird wie bei der EI- Ionisierung ein Elektronenstrahl in die Quelle geleitet, der aber jetzt hauptsächlich die Reaktand- Gasmoleküle ionisiert. Erst in weiterer Folge kollidieren die Reaktandgas- Ionen mit den Probenmolekülen und übertragen so die Ladung. Die auf die Probenmoleküle übertragenen Energie ist wesentlich geringer als bei der EI- Ionisierung, weshalb es zu deutlich weniger Fragmentierungsreaktionen kommt. Daher wird dies Ionisierung auch als „weiche“ Ionisierung bezeichnet. Die überwiegend gebildeten Ionen sind Molekülionen, weshalb man mit dieser Ionisierungstechnik gut Information über das Molekulargewicht des jeweiligen Probenmoleküls erhält. Auch für quantitative Analysen hat diese Ionisierungstechnik gewisse Vorteile. Man erreicht wesentlich geringere Nachweisgrenzen, da die Intensität des Signals des Probenmoleküls nicht auf viele Fragment- Signale aufgeteilt wird, sondern nur zum Signal des Molekülions beiträgt. Vorteile: - CI ist besonders für Verbindungen mit hoher Polarität geeignet. Es führt zu molekularen Ionen und wenig Fragmentierung. Nachteile: - Die Technik erfordert oft die Verwendung von Chemikalien wie Methan oder Ammoniak als Reagenzgas, was die Instrumentenwartung erhöhen kann. - 26. Lichtstreudetektor erklären und Nachteile im vergleich zum MS siehe Frage 12 Nachteile im Vergleich zum MS - Temperatur muss höher als der Siedepunkt des Eluenten, aber unter dem Siedepunkt der Probe liegen. - Das verwendete Gas muss ein Inertgas sein (meist Stickstoff, aber auch Helium). - Volumenstrom muss an den Siedepunkt des Eluenten angepasst werden -> höherer Siedepunkt, langsamerer Strom 21  - Wenn Puffer als Eluent verwendet wird, müssen ALLE Komponenten flüchtig, nur in geringen Mengen vorhanden und von großer Reinheit sein. 27. Lipide mit Folch Extraktion isoliert und am DC getrennt a. 2 spezifische und 2 unspezifische Färbemethoden aufzählen und beschreiben was sie färben. Siehe 1b b. Rf-Werte erklären und welchen Wert sollte der Rf haben, um nützlich zu sein? Siehe 1c c. Das LM besteht aus Hexan, irgendein Ether und Eisessig (80/20/2, v/v/v) und man hat Triglyceride, Diglyceride und Phospholipide. welche Lipide befinden sich an der Startlinie, dazwischen und welche eher an der Laufmittelfront und warum? Startlinie: Phospholipide Dazwischen: Diglyceride Laufmittelfront: Triglyceride Unpolare wandern weiter als schwach polare. Polare wandern gar nicht, bleiben an der Startlinie. Eine typische Mischung zur Trennung von Neutrallipiden ist die Kombination von Hexan, Diethylether und Eisessig im Verhältnis von 80 zu 20 zu 2 Volumsteilen. Allfällige Phospholipide in einer so getrennten Probe bleiben am Startpunkt zurück, die Trennung funktioniert nur für die Neutrallipide. Eine Mischung aus Methylacetat, Propanol, Chloroform, Methanol und wässriger Kaliumchlorid-Lösung ist nur eine von vielen möglichen Mischungen zur Trennung der verschiedenen Phospholipid-Klassen. 28. PL im MS analysieren. Welche Scanmöglichkeiten hat man generell beim Triple- Quad MS, was sagen sie aus und welche eignen sich besonders um die Struktur von PLs zu analysieren? Kombination von drei Quadrupol- Analysatoren - 3 Quadrupol in Serie - Mittlerer Quadrupol (Q2) als Kollissionszelle - 1. Und 2. Quadrupol (Q1, Q§): Scannen oder best. m/z fix Ist statt des Flugrohres hinter der Kollisionszelle noch ein Quadrupol installiert, so wird dieses Hybridsystem „Triple-Quadrupol“ genannt. Die Kurzbezeichnung für diesen 3. Quadrupol ist meist „Q3“. Die technische Ausführung von Triple- Quadrupol- Systemen kann unterschiedlich sein. Ursprünglich war die Anordnung der drei Quadrupole linear. Später hat sich eine Anordnung durchgesetzt, bei der Q2 gebogen ausgeführt ist. Neben einer deutlichen Platzersparnis bietet diese Version auch noch den Vorteil von Spektren mit wesentlich weniger Hintergrundrauschen. Durch die gekrümmte Flugbahn der Ionen werden alle bei der Fragmentierung entstandenen Neutralteilchen entfernt. Da diese von den 22 elektromagnetischen Feldern nicht mehr beeinflusst werden können folgen sie der Flugbahn der Ionen nicht und kommen so nicht als Störsignale am Detektor an. Full Scan: - Alle Ionen passieren Q1 - Kollisionszelle aus - Alle Ionen werden im Q3 analysiert - Dazu wird die Kollisionszelle ausgeschaltet und Q1 auf „Durchlass“ geschaltet. Der Scan erfolgt im Q3. Das Ergebnis ist vergleichbar mit dem Full-Scan in einem einfachen Quadrupol- MS - wenn Sie das gesamte Spektrum der Ionen in einer Probe betrachten möchten, ohne spezifische Übergänge im Voraus festzulegen. Es eignet sich besonders für die Entdeckung unbekannter Verbindungen oder die Erfassung eines breiten Spektrums von Analyten SIM Scan: - Alle Ionen passieren Q1 - Kollisionszelle aus - Ionen mit bestimmten m/z passieren Q3 - Genauso wie bei einem einfachen Quadrupol-MS ist es möglich, Q3 im SIM- Modus zu betreiben, während Q1 auf Durchlass und die Kollisionszelle Q2 ausgeschaltet ist. In dieser Betriebsart erhält man keinerlei Informationen über Ionen mit einem anderen als dem gewählten m/z- Wert, dafür wird steht entsprechend mehr Analysenzeit zur Detektion dieses einen Wertes zur Verfügung. Dieses Ion kann dementsprechend wesentlich empfindlicher gemessen werden. - SIM Scan und Full Scan liefern im Triple- Quadrupol keine zusätzliche Information im Vergleich zu einem einfachen Quadrupol- MS. - In dieser Betriebsart erhält man keinerlei Informationen über Ionen mit einem anderen als dem gewählten m/z- Wert, dafür wird steht entsprechend mehr Analysenzeit zur Detektion dieses einen Wertes zur Verfügung. Dieses Ion kann dementsprechend wesentlich empfindlicher gemessen werden Produktionenscan (product ion scan), (MS/MS; MS2): - Bestimmtes m/z wird im Q1 ausgewählt - Kollisionszelle aktiviert: Fragmentierung - Scannen der Fragmente im Q3 23  - Beim Produktionen- Scan wird das zu fragmentierende m/z im Q1 ausgewählt, im Q2 fragmentiert und die gebildeten Fragmente im Q3 gemessen. Dabei wird im Q3 ein ganzer Massenbereich gescannt. - Das erhaltene Produkt-Ionenspektrum kann zur Identifikation der Fragmentierungsmuster und somit zur Strukturaufklärung der Moleküle verwendet werden. SRM (or MRM): Single (or Multiple) Reaction Monitoring - Bestimmtes m/z wird im Q1 ausgewählt - Kollisionszelle aktiviert: Fragmentierung - Nur ausgewähltes m/z passiert Q3 - Will man analog zum SIM- Scan nur Fragmente mit bestimmten m/z- Werten messen, dann verwendet man die Möglichkeit des „Single“- beziehungsweise „Multiple Reaction Monitoring“; abgekürzt SRM und MRM. Diese Scantypen verwendet man, wenn die Fragmente bekannt sind und man die zur Verfügung stehende Messzeit zur Messung ausschließlich dieser m/z- Werte verwenden will. Analog zum SIM- Scan messen SRM und MRM- Scans die ausgewählten Ionen mit größerer Empfindlichkeit, verzichtet dafür aber um weiter führende Informationen zu anderen m/z- Bereichen. - MRM Messung bei Analyse pharmakologischer Wirkstoffe: Beispiel Analyse von Clindamycin - SRM- oder MRM-Modi bieten eine verbesserte Empfindlichkeit, Selektivität und quantitative Genauigkeit, da sie nur bestimmte Übergänge überwachen. Dies ist besonders wichtig in der pharmazeutischen Forschung, Lebensmittelanalytik und klinischen Studien, wo genaue quantitative Informationen über das Vorkommen bestimmter Verbindungen erforderlich sind. Precurser-Ion-Scan (Vorläufer-Ionen-Scan) - Ladung nach Fragmentierung auf Kopfgruppe- nur Kopfgruppe detektierbar - Q1 scannt über Massenbereich - Q2 Kollisionszelle aktiv - Q3 auf bestimmtes m/z fix eingestellt (Masse der Kopfgruppe) - Scan erfasst alle Spezies, die diese Kopfgruppen-Masse liefern - Der Vorläuferionen- Scan kommt zum Einsatz, wenn die Ladung nach der Fragmentierung des Phospholipids bevorzugt auf der Kopfgruppe lokalisiert ist. - Der Präkursor-Ionen-Scan ist besonders nützlich, wenn Sie nach bestimmten Ionen suchen, die charakteristisch für bestimmte Moleküle oder Verbindungen sind. Dieser Modus wird oft in der Entdeckungsphase eingesetzt, wenn unbekannte oder nicht vorhergesehene Verbindungen in einer Probe identifiziert werden sollen. Neutral-Loss Scan (Neutralverlust-Scan) 24  - Ladung bleibt nach Fragmentierung auf Glycerol-Gerüst- nur dieser Teil detektierbar - Q1 scannt über Massenbereich - Q2 Kollisionszelle aktiv - Q3 scannt über versetzen Massenbereich (um die Masse der abgespaltenen neutralen Gruppe versetzt) - Scan erfasst alle Spezies, die diese Kopfgruppen-Masse liefern - Der Neutralverlust- Scan kommt zum Einsatz, wenn die Ladung nach der Fragmentierung des Phospholipids bevorzugt auf dem Diglycerid- Fragment lokalisiert ist. - Der Neutralverlust-Scan ist besonders nützlich, um Informationen über die Fragmentierungsmuster von Molekülen zu erhalten. Dieser Modus kann in der Strukturaufklärung von Molekülen, insbesondere in der Massenspektrometrie von komplexen organischen Verbindungen, eingesetzt werden. Es ermöglicht die Identifizierung von spezifischen Fragmentierungen, die durch den Verlust von neutralen Molekülen wie Wasser (H₂O), Ammoniak (NH₃) oder Kohlendioxid (CO₂) entstehen können. Struktur von PLs analysieren: - Vor allem durch Produktionenscan (product ion scan), (MS/MS; MS2) Full-Scan eignen sich hervorragend zur Entdeckung von neuen oder unbekannten Phospholipiden 29. Man hat Triglyceride isoliert und möchte sie weiter analysieren. Wie kann man die Triglyceride weiter verarbeiten, um möglichst viel von ihrer Struktur herauszufinden? Zur Bestimmung unpolarer Neutrallipide wie Mono- Di- und Triglyceride stehen viele Analysenmöglichkeiten zur Verfügung. - Bestimmung mittels DC - Trennung mittels HPLC, Detektion mittels ELSD oder MS - Trennung mittels GC, Detektion mittels FID oder MS - Nach entsprechender Derivatisierung sind Monoglyceride problemlos mit klassischer, Di- und Triglyceride eher nur mittels Hochtemperatur- Gaschromatographie zu trennen. Als Detektor kommen sowohl der Flammenionisationsdetektor als auch das Massenspektrometer in Frage. 25  - Enzymatische Bestimmung - Es existieren auch enzymatische Test-Kits zur Bestimmung von Triglyceriden. - 30. Proteinanalytik mit Tandem-MS. a. Wie bereitet man die Proben vor und wie funktioniert das Prinzip? Unter Hybrid- Massenspektrometern versteht man Systeme, in denen zwei oder mehrere Analysatoren miteinander gekoppelt sind. Derartige Geräte ermöglichen sogenannte Tandem- MS-Experimente, die über enormes Potential bei der Strukturaufklärung und Identifizierung von Molekülen verfügen. Dabei werden bestimmte Scan- und Fragmentierungstechniken der einzelnen Komponenten nacheinander ausgeführt. Triple-Quadrupol oder Q-TOF ermöglichen MS/MS- Messungen 1. Chromatographische Trennung des Peptidmix (enzymat. Verdau) 2. Im Full-Scan wird das zu fragmentierende Ion bestimmt. 3. Dieses Ion wird in Q1 isoliert und in Q2 fragmentiert, die in Q3 oder im TOF- Analysator Bruchstücke gemessen (MS2 ) - Fragmentierung eines Peptids liefert Mischung verschiedener Fragmente. - Abstände der Peaks im MS/MS- Spektrum entsprechen den m/z- Werten der Aminosäuren - Ermittlung der Aminosäuresequenz möglich b. Was muss man beachten und was sind die Vor-und Nachteile im Vergleich zur Edman-Sequenzierung? Zu beachten ist, dass eine Datenbanksuche nur dann erfolgreich sein kann, wenn die entsprechende Aminosäuresequenz bereits in der Datenbank vorliegt. Die Identifizierung vollkommen unbekannter Proteinsequenzen ist auf diese Art nicht so einfach möglich. Siehe Frage 18 31. Wie müssen Sie ihre Experimente modifizieren wenn Sie überprüfen wollen, ob in der Probe auch Ceramide vorliegen, bei denen die Sphingoid-base nur 10 statt der üblichen 13C Atome (also 2 CH2-Gruppen weniger) enthält. Wenn man überprüfen möchten, ob in der Probe Ceramide vorhanden sind, bei denen die Sphingoid-Basis nur 10 statt der üblichen 13C-Atome enthält (also 2 CH2-Gruppen weniger), kann man dies durch eine modifizierte Massenspektrometrie-Analyse erreichen. - MS/MS Scan „Produktionenscan“ 32. Nennen Sie 2 alternativ-Möglichkeiten, um FS in andere flüchtige Verbindungen zu überführen. Geben Sie an, welchen Zweck die jeweilige Derivatisierung dient. Sollte eine Substanz einen zu hohen Siedepunkt haben oder zu thermischer Zersetzung neigen, so kann man versuchen, durch Derivatisierung die Flüchtigkeit und Stabilität zu beeinflussen und sie so für die Gaschromatographie zugänglich machen. Typische Derivatisierungsmethoden sind zum Beispiel die Bildung von Methylestern aus Carbonsäuren, die Acetylierung von Hydroxy- und Amino- Gruppen oder die Silylierung von Carbonsäuren, Hydroxy-, Amino- oder Thiolgruppen. Veresterung: Methylester bei Carbonsäuren mit BF3 /Methanol Acetylierung: OH, NH2, NHR, z.B. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt - Die Silylierung ist eine häufig verwendete Derivatisierungsmethode in der GC. Sie besteht darin, Siliziumgruppen an funktionelle Gruppen zu binden, um die Flüchtigkeit zu erhöhen. 26  33. Was kann man mit den Fettsäuren nach Methylierung machen und für welche Analysemethode müssen die Proben so vorbereitet werden + Begründung Nach der Derivatisierung kann man eine Gaschromatographie durchführen. Detektion kann zum Beispiel durch FID oder Massenspektrometer erfolgen. Anders als beim Massenspektrometer werden die Ionen bei FID nicht weiter analysiert, sondern durch die Elektroden nur ihr Einfluss auf die Leitfähigkeit gemessen. Gaschromatographie (GC): - GC ist eine weit verbreitete Methode zur Fettsäureanalyse aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Fettsäuren effektiv zu trennen. - Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Retentionszeiten der Fettsäuremethylester in der GC-Säule, wodurch die genaue Identifizierung und Quantifizierung ermöglicht wird. Methylierung: - Die Methylierung verbessert die Flüchtigkeit der Fettsäuren, indem sie sie in Fettsäuremethylester umwandelt, die für die GC-Analyse gut geeignet sind. Flame Ionization Detector (FID): - FID ist eine häufig verwendete Detektionsmethode in der GC, da sie empfindlich auf Kohlenstoff reagiert, was die Detektion von Fettsäuren erleichtert. 34. Chromatographie: Diol-Säule vs. C8-Säule. Beschreiben der Säulen + Unterschiede, wie werden verschiedene Phospholipide (?) mit verschieden langen Fettsäureketten in welcher Säule getrennt + Begründung Diol-Säule Diol - Wird verwendet in der Normal-Phasen-Adsoprtionschromatographie (polare Stoffe eluieren später) ; Diol wird an Silikagel gehängt -> besitzt 2 OH-Gruppen und kann damit polare WW ausbilden. Generell wird in der Normalphasenchromatographie apolares Lösungsmittel zur Retention und polares LM zur Elution verwendet C8 Säule - verwendet in der Reversed-Phase/Umkehrphasenadsorptionchromatographie (unpolare Stoffe eluieren später). - als stationäre Phase dient Silikagel, welches durch chemische Modifikation apolar gemacht wurde. Das Silikagel wurde durch Anhängen einer C8 (bzw C18) Kette apolar gemacht. Die Adsorption findet durch Van der Waals Wechselwirkungen statt. In der 27  Umkehrphasenchromatographie wird polares LM zur Retention und apolares LM zu Elution verwendet. - Bei der Diol-Säule eluiert zuerst 60,54,48 - polare Stoffe eluieren später in einer Normal-Phasen-Adsoprtionschromatographie - Bei der C18 eluiert zuerst 48, 54, 60 - unpolare Stoffe eluieren später in einer RP- Chromatographie 35. Sie isolieren ein Lipidextrakt - wie kriegt man ein Fettsäuremuster + welche Aussagen kann man treffen mit den genannten Methoden Siehe 3a 36. PL (Phospholipid) gelöst in CHCl3/Methanol. Wie charakterisiert man hinsichtlich PL-Sequenz und Fettsäure? Phospholipide: Unterschiedliche Kopfgruppen der Glycerophospholipide verleihen den einzelnen Klassen spezifische Eigenschaften, die beispielsweise die Kurvatur der mit den jeweiligen Klassen gebildeten Membranen definiert. Eine Sonderstellung bei den Phospholipid- Kopfgruppen nimmt das Cardiolipin ein, da über ein weiteres Glycerinmolekül und einen weitere Phosphodieseterbindung nochmals ein Glycerin mit weiteren zwei Fettsäuren eine sehr große Kopfgruppe gebildet wird. Das im Vergleich zu den übrigen Phospholipiden sehr große Molekül weist durch die insgesamt vier Fettsäuren eine noch größere Komplexität und höherer Variabilität auf. Zur Trennung und Analyse der Phospholipide stehen viele chromatographische Methoden, von der Dünnschichtchromatographie bis hin zur HPLC mit Lichtstreudetektor oder Massenspektrometrie-Kopplung. - Trennung der Hauptkomponenten mittels DC auf Kieselgel mit Laufmitteln aus Chloroform / Wasser / Methanol / Eisessig in verschiedenen Zusammensetzungen Es gibt viele Laufmittelmischungen, um Phospholipide mittels Dünnschichtchromatographie zu trennen. Ganz allgemein wandern weniger polare Phospholipide weiter zur Laufmittelfront als stärker polare. Sind in der Probe zusätzlich auch Neutrallipide enthalten, so wandern diese bei den meisten Laufmittelgemischen zur Phospholipid- Trennung ganz vorne in der Laufmittelfront. - Verschiedene HPLC-Systeme zur Trennung (normal- und reversed-phase) - Bei der Normalphasenchromatographie spielt die Polarität der jeweiligen Kopfgruppe die entscheidende Rolle bei der Wechselwirkung mit der stationären Phase, während bei der Umkehrphasenchromatographie der Einfluss der Fettsäureketten entscheidend ist. Daher kann es bei der Umkehrphasenchromatographie eher zu einer Trennung nach Spezies auch innerhalb einer Phospholipid-Klasse kommen, während bei der Normalphasenchromatographie meist ein Peak pro Lipidklasse auftritt. - Gute Detektionsmöglichkeiten mit Massenspektroskopie - Selektive Scantechniken dank charakteristischer Kopfgruppen - Neben der Detektion mittels Lichtstreudetektor bieten gerade die Scantechniken eines Triple-Quadrupol- Massenspektrometers sehr selektive Möglichkeiten, um einzelne Lipidklassen spezifisch zu analysieren. Trennung mittels Normalphsen-HPLC und Detektion mittels ELSD - Das hier gezeigte Chromatogramm zeigt die Trennung eines Gesamtlipidextraktes über eine Diol-Säule. Es wird ein binärer Gradient verwendet, bei dem das Laufmittel 28  A primär Aceton das Laufmittel B primär Methanol ist, wobei in beiden Fällen Essigsäure, Triethylamin und Hexan zugesetzt sind. Unter diesen Bedingungen werden die Neutrallipide nicht getrennt und eluieren zusammen in einem Peak am Beginn der Chromatographie. Die Phospholipide eluieren dann abhängig von der Polarität der Kopfgruppen 1. Full Scan - Das Spektrum zeigt alle Ionen, die aus der Probe gebildet werden - Im ersten Schritt misst man ein Full-Scan- Spektrum wie hier abgebildet. Anhand dieser daten kann man noch keine eindeutige Aussage über vorhandene Lipide treffen. Der intensivste Peak bei m/z 835 wird ausgewählt, um ein Produktionen- Spektrum zu messen 2. Produkt-Ionen-Scan des Peaks bei m/z 835 Das Spektrum zeigt die Fragmente des Moleküls mit m/z 835 Auffinden charakteristischer Fragmente (z.B. Kopfgruppe) 3. Precurser-Ionen Scan 37. Chromatographie: Diol-Säule, C8-Säule. Beschreibung der Säulen und deren Unterschiede. 3 verschiedene PC (24:0, 32:0, 38:0) werden aufgetrennt. Welches 29  davon eluiert bei welcher Säule zuerst? Begründe.Auch: C18 Säule (48:0, 54:0, 60:0) Siehe Frage 34 - Bei der Diol-Säule eluiert zuerst 38,32,24 - polare Stoffe eluieren später in einer Normal-Phasen-Adsoprtionschromatographie - Bei der C8 eluiert zuerst 24, 32, 38 - unpolare Stoffe eluieren später in einer RP- Chromatographie - Bei der C18 eluiert zuerst 48, 54, 60 - unpolare Stoffe eluieren später in einer RP- Chromatographie 38. 3 Möglichkeiten FS-Methylester weiter zu verwenden und je ein Beispiel, wozu sie eingesetzt werden Siehe Frage 10 39. Sie haben eine Folch-Extraktion von Lipiden aus der Maus mittels ESI-MS im Triple- Quad getrennt. Durch Fullscan & Retentionszeit wissen Sie, dass es sich um ein H+-Adukt des PE 34:2 handelt. Im Produkt-Ionen-Scan finden Sie einen signifikanten Peak bei m/z x, was sich durch den Verlust der Ethanolamin- Kopfgruppe erklären lässt. Wie können Sie weitere PE´s in Ihrer Probe finden (Scantechnik?)? Welche Aussagen über das FS-Muster lassen sich mit diesem Scan treffen, welche nicht? Neural-Loss Scan (Neutralverlust-Scan) - Ladung bleibt nach Fragmentierung auf Glycerol-Gerüst- nur dieser Teil detektierbar - Q1 scannt über Massenbereich - Q2 Kollisionszelle aktiv - Q3 scannt über versetzen Massenbereich (um die Masse der abgespaltenen neutralen Gruppe versetzt) - Scan erfasst alle Spezies, die diese Kopfgruppen-Masse liefern - Der Neutralverlust- Scan kommt zum Einsatz, wenn die Ladung nach der Fragmentierung des Phospholipids bevorzugt auf dem Diglycerid- Fragment lokalisiert ist. - Das Prinzip wird am Beispiel von Phosphatidylethanolamin, kurz PE, erklärt. Im Zuge der Fragmentierung bleibt die Ladung üblicherweise auf dem Diglycerid- Fragment, während die Kopfgruppe als Neutralteilchen verloren geht. Die Masse der Kopfgruppe eines PEs beträgt 141 Da. Das Diglycerid- Fragment eines PEs hat abhängig von der 30  Art der Fettsäuren unterschiedlichste Massen. Egal, wie schwer das gesamte PE ist, egal, wie kurz oder lang die zwei Fettsäuren sind und egal, wieviel Doppelbindungen in den Fettsäuren vorhanden sind, das Kopfgruppen- Fragment, welches bei jedem PE abgespalten wird, reduziert den m/z- Wert immer um 141. - Beim Neutralverlust- Scan wird daher sowohl in Q1 als auch in Q3 gescannt, allerdings um genau diesen charakteristischen Massenverlust versetzt. Die Fragmentierung in Q2 wird aktiviert und Q1 scannt über den gesamten Massenbereich, der auf PEs untersucht werden soll. Wenn ein PE Q1 passiert, wird es fragmentiert und das um die eingestellte Differenz leichtere Fragment gelangt durch Q3 zum Detektor und wird registriert. Jedes andere Ion, dass fragmentiert wird, aber dabei nicht um den ausgewählten Wert leichter wird, kann Q3 nicht passieren und wird auch nicht registriert. - Im Spektrum werden dann jene m/z- Werte dargestellt, die Q1 passierten und deren entsprechend leichteres Fragment durch Q3 zum Detektor gelangt ist. - Neben der Charakterisierung von Phospholipiden kann der Neutralverlust- Scan auch zur Analyse von Triglyceriden eingesetzt werden, allerdings müssen dabei mehrere Neutralverlust- Scans kombiniert werden, da für kein Triglycerid nur eine einzelne Fettsäure charakteristisch ist. - Auch das Vorhandensein mehrerer PEs mit unterschiedlichen Fettsäurekombinationen, aber gleicher Gesamtmasse kann nicht ausgeschlossen werden. - Bestätigung des PE 34:2: Das Vorhandensein des H⁺-Addukts des PE 34:2 im Fullscan wird durch den signifikanten Peak im Produkt-Ionen-Scan, der den Verlust der Ethanolamin-Kopfgruppe zeigt, bestätigt. - Identifikation anderer PE-Spezies: Durch den Produkt-Ionen-Scan können Sie zusätzliche PE-Spezies identifizieren, die in der Probe vorhanden sind, da sie denselben charakteristischen Verlust der Ethanolamin-Kopfgruppe aufweisen. - Fettsäureinformationen: Der Produkt-Ionen-Scan allein liefert jedoch keine detaillierten Informationen über die Fettsäurezusammensetzung. Um diese Informationen zu erhalten, könnte eine weitere MS/MS-Analyse mit unterschiedlichen Fragmentierungsbedingungen durchgeführt werden. 40. mit DC wurden Neutrallipide abgetrennt so dass nur mehr Sphingo- und Phospholipide übrig sind. Beschreiben Sie geeignete MS-Methoden (Probenvorbereitung und Vortrennung, Ionisierungsart, …) Das Diagramm stellt schematisch den Ablauf einer massenspektrometrischen Analyse dar. Eine entsprechend vorbereitete Probe wird üblicherweise über ein geeignetes System vorgetrennt und zur Ionenquelle geleitet. Abhängig vom technischen Grundprinzip befindet sich diese Ionenquelle außerhalb des Vakuumbereiches (ESI, APCI) oder bereits 31  im Vakuumbereich (EI, CI, MALDI). Welche Art von Analysator – Quadrupol, Ionenfalle, Flugzeitanalysator, Ionenzyklotron, etc.) – dann an die jeweilige Ionenquelle gekoppelt ist, ist prinzipiell nicht festgelegt, auch wenn es für gewisse Kombinationen aus historisch- technischen Gründen Präferenzen gibt. Die dann nach ihren m/z-Werten getrennten Ionen werden mit Hilfe eines geeigneten Detektors registriert und die Daten anschließend mit entsprechenden Software- Paketen ausgewertet. 41. Ceramid mit bestimmter Größe wie kann man die FS analysieren Fettsäuren sind in biologischen Systemen in Lipide eingebaut. Man muss die Fettsäure vor der Extraktion aus ihrer Bindung freisetzen. Ein Ceramid besteht aus einer Fettsäure mit über einer Amidbindung verbundenes Sphingosin Fettsäuremethylester aus Sphingolipiden und anderen N-Acyl Lipiden Fettsäuren, die über Amidbindung gebunden sind, sind über sauer katalysierte Umesterungen nicht optimal derivatisierbar. Die Reaktion läuft nicht vollständig ab und es kommt zur Bildung vieler Nebenprodukte aus der Sphingoidbase. Unter milden alkalischen Bedingungen werden Esterbindungen gespalten, Amidbindungen hingegen nicht. So hat man eine Möglichkeit, diese Lipidklassen zu trennen. Alle Lipide mit estergebundenen Fettsäuren werden so zerstört, nur die Sphingolipide bleiben intakt. Unter härteren alkalischen Bedingungen können dann auch die amidgebundenen Fettsäuren umgesetert werden - C18 ist eine Reversed- Phase - Die gebräuchlichsten Ionisierungsmethoden für die Massenspektrometrie (MS) von Ceramiden sind Elektrospray-Ionisation (ESI) und Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). Die Wahl zwischen diesen Methoden hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Molekülgröße, Löslichkeit und Analyseanforderungen - 32 42. Proteinextraktion von Carboanhydrase und einem unbekannten Protein, wie kann man nachweisen, dass man tatsächlich CAH isoliert hat? - Proteingemisch→PAGE (1D, 2D, nativ) →Membran →Analytik (Edman, MS) 1. SDS-PAGE 2. Western Blot 3. Aktivitätstest 4. Massenspektrometrie 5. Immunopräzipitation 43. ESI vs. EI ESI (Electrospray- Ionisierung) - eignet sich ideal zur Kopplung von Flüssigchromatographie- Systemen mit Massenspektrometern - Kombination mit LC - durch Anlegen von Spannung (bis ca. 4eV) wird Probelösung in geladene Tröpfchen zerstäubt. - ist sehr schonend und ermöglicht sogar die Ionisierung großer Biomoleküle wie Proteine, ohne diese zu fragmentieren - Die geladenen Tröpfchen verlieren auf ihrem Weg von der Kapillare zum MS Lösungsmittel, wodurch die so lange schrumpfen, bis die Abstoßungskräfte zwischen den ladungen zur sogenannten "Coulomb-Explosion" führen und der Tropfen in kleinere Tröpfchen zerplatzt - Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, bleiben Pseudomolekülionen der Form [M+xH]x+ zurück, die MS analysiert werden können. Je nach Größe des Proteinmoleküls sind Mehrfachladungen möglich. Limitierung: - Die Ionisierungseffizienz ist abhängig von der Konzentration der Probe und empfindlich gegenüber Verunreinigungen. Electron-Impact- Ionisierung (EI) - Probe (gasförmig) wird mit e- beschossen und ionisiert - harte“ Ionisierung Probe fragmentiert stark - Fragmentmuster = „Fingerabdruck“ - Ionisierung standardisiert 70eV Datenbanksuche möglich - Hauptsächlich in Kombination mit Gaschromatographie Die Elektronenstoß- Ionisation ist eine sogenannte „harte“ Ionisierungstechnik, weil es zu einer starken Fragmentierung der Probenmoleküle kommt. Die Probenmoleküle werden typischerweise über ein Gaschromatographie- System direkt in die evakuierte Ionenquelle geleitet. Dort werden von einem Glühdraht, auch „Filament“ genannt, Elektronen in die ionenquelle hinein beschleunigt, und zwar mit einer definierten Energie von 70 eV. Die überwiegende Mehrheit dieser Elektronen trifft nicht direkt auf die gasförmigen Probenmoleküle, aber durch ihre Wechselwirkungen mit der jeweiligen Elektronenhülle des Probenmoleküls wird aus dieser Hülle ein Elektron herausgeschlagen. Dies führt zu 33  positiv geladenen Molekülionen. Allerdings wird dabei sehr viel Energie auf das Probenmolekül übertragen, was in weiterer Folge zu dessen Fragmentierung führt. Diese Fragmentierung erfolgt nach bestimmten Regeln, auf die hier nicht näher eingegangen wird. Kurz gesagt, gibt es in Molekülen mit bestimmten Strukturelementen wie Heteroatomen quasi „Sollbruchstellen“, an denen es zu Fragmentierungen kommt. Auch Hydroxy- oder Amino- Gruppen werden leicht als kleine, stabile Moleküle wie Wasser oder Ammoniak abgespalten. Die Fragmentierungen erfolgen nach geräteunabhängigen Regeln und da die eingesetzte Energie von 70 eV einheitlich als Standard von den verschiedenen Geräteherstellern verwendet wird, liefert ein und dasselbe Molekül immer ein identes Fragmentmuster, welches wie ein Fingerabdruck charakteristisch für dieses Molekül ist. Dieses charakteristische Fragmentmuster ermöglicht über Datenbanken eine automatisierte Identifizierung der Probenmoleküle. 44. HPLC über Diolsäule nach 20 min wird dann mit reinem Methanol gefahren (zuerst was anderes) welche Säulenchromatographie handelt es sich dann eine Abbildung eines Lichtstreu Detektors und man muss die Peaks beschriften welcher ist TAG, MAG und PC+ Begründung warum? a. welcher Ionisator eignet sich hier am Besten für ein MS+ kurz warum? Die beschriebene Methode, bei der die Elution nach 20 Minuten auf reines Methanol umschaltet, ist als "Normal Phase HPLC" bekannt. Normal Phase HPLC verwendet eine polarere stationäre Phase im Vergleich zu der üblicheren umgekehrten Phase (Reverse Phase). In diesem Fall ist die Diolsäule die polarere Säule. - TAG (Triacylglycerol): Triacylglycerole bestehen aus drei Fettsäuren, die an ein Glycerolmolekül gebunden sind. In der Regel eluieren TAGs später in Normal Phase HPLC. Aufgrund ihrer Molekülmasse und Polarität könnten sie als ein späterer, breiter Peak erscheinen. - MAG (Monoacylglycerol): Monoacylglycerole haben nur eine Fettsäure, daher könnten sie einen früheren, schmaleren Peak zeigen. - PC (Phosphatidylcholin): Phosphatidylcholine sind eine Klasse von Phospholipiden, die oft in Lipidmischungen vorkommen. Je nach den spezifischen Eigenschaften der verwendeten Säule könnten sie an verschiedenen Stellen eluieren. Der PC-Peak wird wahrscheinlich in der Nähe des Übergangs von Normal Phase zu reinem Methanol erscheinen. Die genaue Position der Peaks kann von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich der Säulencharakteristika, der Gradientenbedingungen und der Probenvorbereitung. Für die Kopplung mit der Massenspektrometrie (MS) könnte ein Elektrospray-Ionisator (ESI) am besten geeignet sein. ESI ist besonders gut für die Ionisierung von polaren und lipophilen Verbindungen, was in Lipidchromatographie-Anwendungen wichtig ist. ESI erzeugt geladene Ionen, die leichter in den Massenspektrometer eingeführt und analysiert werden können. 45. Man will Phospholipide analysieren. Welche Analystechnik wird verwendet und welche Aussagen können getroffen werden bzw. welche nicht? Siehe Frage 36 Aussagen, die getroffen werden können: - Identifikation von Phospholipidklassen: MS kann verschiedene Phospholipidklassen unterscheiden. - Fettsäuren und Kopfgruppen: MS und NMR können Informationen über die Fettsäuren und Kopfgruppen liefern. 34  - Quantifizierung: MS und LC können für die quantitative Analyse von Phospholipiden verwendet werden. Aussagen, die begrenzt sind: - Genauigkeit der Identifikation: Die Identifikation einzelner Phospholipidmoleküle kann in manchen Fällen durch die Komplexität des Mixes begrenzt sein. - Auflösung von Isomeren: MS und LC können manchmal Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Isomeren haben. - Absolute Quantifizierung: Absolute Quantifizierung kann herausfordernd sein und erfordert oft den Einsatz von internen Standards. 46. Das Enzym acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) besteht aus 2346 AS und katalysiert den ersten Schritt der FS-Biosynthese. Sie tauschen ein Phosphorlilierbar Serin an der Position 1157, gegen ein nicht phosphorlierbares Alanin aus. Sie isolieren das Enzym aus Hefe S.cerevisiae und trennen es mittels SDS-Gel von Begleitprotein ab. Nun liegt eine Coomassie-gefärbte Bande mit der ACC vor. Sie wollen nun bestimmen dass die AS an Position 1157 tatsächlich Alanin und nicht Serin ist und es sich auch um ihr Protein handelt. Gehen sie auch Vor und Nachteile ein Um zu bestätigen, dass an der Position 1157 tatsächlich Alanin und nicht Serin vorliegt, und um sicherzustellen, dass das isolierte Protein die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) ist, können verschiedene experimentelle Ansätze verwendet werden. Ein typischer Ansatz ist die Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit einer geeigneten Proteindigestion. 1. Proteolyse: Führen Sie eine Proteolyse des isolierten Proteins durch, um Peptide zu erzeugen. Dies kann durch die Zugabe eines geeigneten Protease-Enzyms wie Trypsin erfolgen. 2. LC-MS/MS-Analyse: Trennen Sie die durch die Proteolyse erzeugten Peptide mittels Flüssigkeitschromatographie (LC) und analysieren Sie sie mit einem Tandem-Massenspektrometer (MS/MS). Die Massenspektrometrie-Daten können zur Identifizierung der Peptide und zur Bestätigung der Aminosäurezusammensetzung verwendet werden. 3. Phosphorylierungsnachweis: Untersuchen Sie die MS/MS-Daten, um festzustellen, ob eine Phosphorylierung an der Position 1157 vorliegt. Die Masse eines phosphorylierten Serins unterscheidet sich von der Masse eines nicht-phosphorylierten Serins oder Alanins. 4. Fragmentierungsspektrum: Betrachten Sie das Fragmentierungsspektrum der Peptide, die die Position 1157 enthalten. Spezifische Fragmente können Aufschluss darüber geben, welche Aminosäure an dieser Position vorliegt. 5. Vergleich mit Referenzsequenz: Vergleichen Sie die experimentellen MS/MS-Daten mit der bekannten Sequenz der Acetyl- CoA-Carboxylase, um die Aminosäure an Position 1157 zu bestätigen. Vorteile: - Spezifität: Die Massenspektrometrie bietet eine hohe Spezifität bei der Identifizierung von Aminosäuren. - Genauigkeit: MS/MS ermöglicht die Bestimmung der Aminosäuresequenz mit hoher Genauigkeit. - Schnelligkeit: Die Analyse kann relativ schnell durchgeführt werden. Nachteile: 35  - Komplexität: Die Interpretation von MS/MS-Daten kann bei komplexen Peptidmischungen herausfordernd sein. - Kosten: Der Einsatz von Massenspektrometern kann kostenaufwändig sein. - Anforderungen an die Expertise: Die Interpretation der Daten erfordert eine gewisse Erfahrung im Umgang mit Massenspektrometern und bioinformatischer Analyse. 47. Man hat freie Fettsäuren. Wie kann man die mittels GC analysieren? Wie kann man die OH-Gruppen und Doppelbindungen lokalisieren? Siehe Frage 24 48. Man hat ein C8-Säule und möchte Tri-,Di-. und Monoglyceride auftrennen. Was eluiert wann und wieso? Bei der C8 eluieren unpolare Stoffe später in einer RP-Chromatographie. Zuerst eluiert Monoglycerid dann Diglycerid und zuletzt Triglycerid 49. Derivatisierung von Lipide Veresterung: Methylester bei Carbonsäuren mit BF3 /Methanol Acetylierung: OH, NH2 , NHR, z.B. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt 50. C18 Säule und Reihenfolge von Ceramide (24, 18, 16) und welche Ionisierungsmethode am Besten geeignet und wieso C18 ist eine Reversed- Phase Die gebräuchlichsten Ionisierungsmethoden für die Massenspektrometrie (MS) von Ceramiden sind Elektrospray-Ionisation (ESI) und Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). Die Wahl zwischen diesen Methoden hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Molekülgröße, Löslichkeit und Analyseanforderungen 51. Welche Info man durch MS und FID bekommt und vergleichen miteinander FID: siehe Frage 9 - Das Ergebnis einer GC-FID- Messung ist also ein Chromatogramm, bei dem die Retentionszeit der einzelnen Peaks der einzige Parameter zur Identifizierung einer Substanz ist. Sollten zwei Substanzen zur gleichen Zeit eluieren und sich die Peaks überlagern, so hat man rein über den Detektor keine Möglichkeit, sie getrennt zu identifizieren. MS - Massenspektrometrie bezeichnet ein Verfahren zum Messen der Masse von (historisch ursprünglich) Atomen oder (heute meist) Molekülen. Die zu untersuchenden Moleküle werden dabei in die Gasphase überführt (Desorption) und ionisiert. Vergleich - MS liefert detailliertere Informationen über die Masse und Struktur von Molekülen und ermöglicht die Identifizierung von Verbindungen auf der Grundlage ihrer Massensignaturen. - FID ist weniger selektiv, eignet sich jedoch gut für die quantitative Analyse von organischen Verbindungen und ist aufgrund seiner Empfindlichkeit und Linearität in der GC weit verbreitet. 52. Adsorptionschromatographie,